槲皮素对肺动脉平滑肌细胞增殖及大鼠低氧性肺动脉高压的影响
作者：王昌明 张珍祥
单位：王昌明 540001 桂林医学院附院呼吸内科；张珍祥 同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室
关键词：槲皮素；血小板衍生生长因子；肺动脉平滑肌细胞；高血压；肺性
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【摘 要】 目的 研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素(quercetin)对血小板衍生生长因子PDGF诱导的平滑肌细胞增殖及低氧性肺动脉高压的影响。方法 ①用原代培养的小牛肺动脉平滑肌细胞，采用MTT比色法、流式细胞及Western Blot技术对PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响进行分析；②通过大鼠缺氧动物模型观察槲皮素对右心室收缩压(RVSP)，右心室/左心室+室间隔比值(RV/LV+S)及肺小动脉图像分析的影响。结果 与对照组相比槲皮素处理组能显著地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖，明显地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞酪氨酸磷酸化程度，且呈明显剂量依赖性，槲皮素对RVSP、RV/LV+S及肺小动脉中膜肥厚也有明显的抑制作用。结论 槲皮素可显著地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖，对低氧性肺动脉高压有一定的防治作用。
, 百拇医药
【中图号】 R331.43
Effect of quercetin on pulmonary artery smooth cell proliferation and
hypoxic pulmonary hypertension in rats
WANG Changming,ZHANG Zhenxiang.
Department of Respirotory Disease, Affiliated Hospital, Guilin Medical College, Guilin 541001
【Abstract】 Objective To explore the effect of tyrosine protein kinases (TPK)inhibitor Quercetin on platelet derived growth factor (PDGF)-induced pulmonary artery smooth muscle cell(PASMC) proliferations and hypoxic pulmonary hypertension in the rats.Methods By primary culture of calf PASMC, the effect of PDGF induced PASMC proliferation was analysed using MTT colorimetry flow cytometry and Western Blot.The right ventricular systolic pressure(RVSP),the ratio of the right ventricle to left ventricle plus interventricular septum (RV/LV+S) and pulmonary small artery morphological analysis was observed on hypoxic pulmonary hypertension in the rats.Results As compared with control group, PDGF-induced PASMC proliferations and tyrosine phosphorylation with Western Blot analysis were significantly inhibited by Quercetin groups in a dose -dependent manner. The RVSP,RV/LV+S and pulmonary small artery medial thickness was remarkably inhibited by quercetin in hypoxic plumonary hypertension models in the rats.Conclusions Quercetin could block PDGF-induced PASMC proliferations by inhibiting tyrosine phosphorylation protein expression, to some extent, it could prevent and treat hypoxic pulmonany hypertension.
, 百拇医药
【Key words】 Quercetin Platelet derived growth factor Pulmonary artery smooth muscle cell Hypertension, pulmonary
肺血管构形重建(structural remodeling)是慢性缺氧性肺动脉高压的病理形态学基础，主要表现为中膜平滑肌细胞增殖及迁移[1]，而平滑肌细胞的增殖依赖于多种生长因子的作用，尤其是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)，生长因子的作用是通过与生长因子受体结合，激活受体内酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase,TPK)使其磷酸化而调节细胞的增殖。本文通过TPK特异性抑制剂槲皮素(quercetin)来观察对PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)增殖及大鼠低氧性肺动脉高压的作用，为临床应用此药防治肺心病提供重要的实验依据。
, 百拇医药
1 材 料 和 方 法
1.1 主要试剂及仪器
无血清DME/F-12混合培养液(SFM)，胎牛血清(FCS)，胰蛋白酶，PDGF-BB以上均为Gibco产品，槲皮素、Anti-Phosphotyrosine、a-sm-actin均为sigma产品、噻唑蓝(MTT)(瑞士Fluka产品)、流式细胞仪(FCM)(美国BD公司型号FACS420)、ASM 68k图象分析仪(德国Leite公司)。
1.2 肺动脉平滑肌细胞的制备与鉴定
初生小牛PASMC的培养按赵三妹等人的方法[2]，第5-6代细胞用于实验，细胞在相差显微镜下呈梭形或长梭形重叠多层生长，高低起伏呈“峰、谷”状，抗a-sm-actin单克隆抗体免疫荧光染色，胞浆内出现呈荧光反应的肌动蛋白丝结构(图1)。
, 百拇医药
图1 抗a-sm-actin单抗免疫荧光染色,培养的第3代牛肺动脉
平滑肌细胞浆内呈丝状强荧光反应 ×200
1.3 Quercetin对PDGF诱导的PASMC增殖的影响
1.3.1 MTT比色法检验细胞增殖：取5～6代PASMC接种于96孔培养板内(1.6×10细胞/ml)，培养36 h，弃去原有培养基，改SFM培养24 h，细胞分组如下①Quercetin处理组:每孔分别加入含Quercetin(0.1、1、10 μmol/L)各浓度组6孔，3 h后加PDGF10 ng/ml；②PDGF组：每孔仅加PDGF10 ng/ml；③SFM组：每孔仅加SFM。以上各组分别于第24、48、72 h按Mosmann等[3]法进行MTT比色测定。
1.3.2 细胞周期时相分布测定：取5～6代细胞接种于100 ml培养瓶内，每组3瓶，在含10%FCS DMEM培养48 h后用SFM同步化培养48 h，细胞分组及处理同上，细胞处理后48 h制备成单细胞悬液，体积分数为70%冷乙醇固定后于4 ℃冰箱保存待测。FCM测量结果输入微机处理，计算样品细胞周期各时相的细胞比率(包括G0/G1,S和G2M期的DNA含量)。
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1.3.3 Quercetin对PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化影响：①细胞处理：细胞接种于100 ml培养瓶内培养48 h，再用SFM培养48 h，各组加含Quercetin (0.1、1、10、100 μmol/L)，14 h后再加一次Quercetin，3 h后加入PDGF20 ng/ml，培养24 h后再加一次Quercetin，3 h后加PDGF(20 ng/ml),1～5 min后将细胞处理进行Western Blot分析[4]。
1.3.4 动物分组：体质量200～230 g左右SD大白鼠30只,雌雄不拘，随机分组：①用药组(缺氧+Quercetin, H+Q)：动物在常压低氧(10%O2，每天持续8 h)箱中饲养，低氧前3 d开始腹腔注射Quercetin(200 mg*kg-1)每日1次。②低氧对照组(H)以等容积生理盐水代替Quercetin,其它处理同用药组。③空白对照组(C)。
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1.3.5 右心室收缩压(RVSP)及右室/左室+室间隔(RV/LV+S)比值测定：实验第22 d，大鼠用乌拉坦(l g*kg-1)麻醉，经右颈外静脉插管至右心室，接YZ-0.5Ⅰ型血压换能器，用上海产SJ-41型生理四道仪记录右心室瞬时压波形，计算RVSP，测定后完整取出动物心肺，分离右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)，60 ℃烤干后称其干重，计算RV/LV+S比值。
1.3.6 肺小动脉形态学定量测定：大鼠肺组织用10%中性福尔马林经肺动脉干和支气管灌注固定后，常规石腊包埋切片行弹力纤维染色，在ASM68K图像分析仪测量伴行及Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级呼吸性细支气管及肺泡管的肺小动脉外经、中膜厚度、横截面积和中膜面积，计算中膜厚度占外经百分比(MT%)和中膜面积占横载面积的百分比(MA%)。
1.4 统计学处理
数据以
±s表示，组间比较采用t检验。
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2 结 果
2.1 MTT比色法
Quercetin组的大鼠均能在24h、48h、72h，显著地抑制PDGF所诱导的PASMC增生的比色反应(A值表示)呈剂量依赖性(表1)。
表1 Quercetin对PDGF诱导的PASMC
增殖的影响(MTT法)(n=6,±s)
组 别
A值
24h
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48h
72h
SFM组
0.337±0.023
0.332±0.011
0.328±0.023
PDGF组
0.590±0.033
0.667±0.029
0.708±0.017
Quercetin组
(0.1 μmol/L)
, http://www.100md.com
0.538±0.033*
0.581±0.028***
0.610±0.027***
(1 μmol/L)
0.424±0.031***
0.518±0.036***
0.529±0.039***
(10 μmol/L)
0.373±0.036***
, http://www.100md.com
0.392±0.036***
0.379±0.030***
注：与PDGF组相比 *P<0.05，***P<0.001
2.2 Quercetin对PDGF诱导的PASMC细胞周期时相分布的影响
Quercetin组能显著地抑制PDGF诱导的PASMC细胞周期S期及G2M期的增生，呈剂量依赖性(表2)。
表2 Quercetin对PDGF诱导的PASMC细胞周期时相
分布的影响(n=6,±s)
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组 别
Go/1(%)
S(%)
G2M(%)
SFM组
93.5±1.6
5.5±0.6
1.0±0.2
PDGF组
37.9±1.7
51.8±1.4
10.3±0.7
, 百拇医药
Quercetin组
(0.1 μmol/L)
48.6±1.35**
44.9±1.6**
6.5±0.6**
(1μ mol/L)
68.5±1.0***
26.6±0.72***
4.9±1.0***
(10 μmol/L)
, 百拇医药
85.6±1.9***
10.3±0.8***
4.1±0.8***
注:与PDGF组相比 **P<0.01，***P<0.001
2.3 Quercetin对PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化的影响
Western Blot 分析表明Quercetin能显著地抑制PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化程度,呈剂量效应关系(图2)。
, 百拇医药
图2 Westem Blot显示槲皮素对PDGF诱导的PASMC
酪氨酸磷酸化程度的剂量效应关系
2.4 RVSP及RV/LV+S比值的变化
H+Q组的RVSP为3.33±0.33，明显低于H组4.95±0.42(P<0.001)，而又高于C组2.55±0.21(P<0.001)，说明Quercetin对低氧引起的肺动脉高压有一定的抑制作用，而H+Q组的RV/LV+S比值为0.35±0.04，明显低于H组0.43±0.02(P<0.05)，而又高于C组0.31±0.03(P<0.05)，说明Quercetin能抑制低氧引起的右心室肥大(表3)。
表3 RVSR及RV/LV+S比值(n＝10,±s)
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组别
RVSP(KPa)
RV/LV+S
H组
4.95±0.42
0.43±0.02
H+Q组
3.33±0.31△△△
0.35±0.04△
C组
2.58±0.20***
, 百拇医药
0.31±0.03*
注：与H组相比 △P<0.05，△△△P<0.001
与H+Q组相比 *P<0.05，***P<0.001
2.5 肺小动脉结构改变和图像分析结果
光镜下见H组肺小动脉中膜显著增厚(图3)，H+Q组的变化明显减轻(图4)，图像分析结果(表4)，显示组间的肺小动物外经差异无显著性(P>0.05)，H+Q组的MT%及MA%明显低于H组(P<0.001)，而又高于C组(P<0.001)，表明Quercetin对低氧诱发的肺小动脉中膜增厚有明显抑制作用。
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图3 低氧组(21天)弹力纤维染色显示,肺小动脉内外两层弹力膜,肌型肺小动脉中膜明显增厚(MT%＝26%) ×200
图4 用药组(21天)弹力纤维染色显示,肺小动脉中膜增厚
变化较低氧组明显减轻(MT%＝8%) ×200
表4 肺动脉MT(%)和MA(%)(±s)
组别
, http://www.100md.com 鼠数
外径(um)
中膜厚度(um)
模截面积(um2)
中膜面积(um2)
MT(%)
MA(%)
H组
21
19.08±1.05
1.71±0.09
267.67±32.06
, 百拇医药
91.23±8.04
17.90±0.99
34.30±2.72
H+Q组
20
18.68±0.87
1.19±0.09
254.27±36.45
60.36±5.96
12.75±12.88△△△
23.98±2.40△△△
, 百拇医药
C组
16
20.20±1.38
0.81±0.11
303.64±26.07
48.70±4.11
8.01±1.12***
16.07±0.85***
注：与H组相比 △△△P<0.001;
与H+Q组相比 ***P<0.001
3 讨 论
, 百拇医药
慢性阻塞性肺疾病、高原病等患者都有不同程度的肺泡低氧，肺泡低氧可引起肺血管尤其肺小动脉收缩和肺动脉中膜平滑肌增生、肥大及细胞外基质增多[5]，晚期并发肺动脉高压(PHA)和右心室肥大，目前肺血管构型重建在PHA中的作用倍受重视，其中心环节是PASMC增殖，而PASMC增殖依赖于多种生长因子尤其是PDGF的作用， PDGF在缺氧性肺动脉高压的血管构型重建中具有重要作用[6]，当生长因子与受体结合后可激活受体细胞膜内部分的TPK，其TPK可催化靶蛋白分子中的酪氨酸磷酸化，通过细胞内信息传导的共同通道而调节细胞的生长和繁殖。
Quercetin属黄酮类物，是TPK的特异性抑制剂，本研究的结果显示Quercetin能显著地抑制PDGF诱导的PASMC增殖。FCM分析表明,Quercetin能阻断PASMC G0/G1期进入DNA合成的S期，Western Blot分析表明,Quercetin能抑制PDGF诱导的酪氨酸磷酸化程度，本文首次观察到Quercetin具有抑制低氧诱发的PHA作用，减轻右心室肥大，其机制主要是通过阻断肺小动脉平滑肌细胞增生而降低肺循环阻力。有报道Quercetin可以抑制某些缩血管活性物质(如5-HT,去甲肾上腺素)所致的离体肺血管收缩[7]及抑制生长因子所致的成纤维细胞增殖及细胞外基质的沉积[8]。我们的结果表明Quercetin有可能应用于肺动脉高压的防治，其作用机理有待进一步研究。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Dzou VJ, Gibbons GH. Vascular remodeling: Nachanisms and inplication. J Cardiovas Pharm, 1993,21(suppl1):1-5.
2 赵三妹,夏人仪,王宗立,等. 动肺平滑肌细胞培养方法及应用.中华病理学杂志，1987,16:260-261.
3 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival:application to proliferation and cytoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55-65.
4 Bilder GE, Krawiec JA, Mevety K, et al. Tyrphostin inhibit PDGF-induced DNA synthesis and associated early events in smooth muscle cells. Am J Physiol, 1991,260:721-730.
, 百拇医药
5 Sobin SS, Tremer HM, Hardy J, et al. Changes in arteriole in acute and chronic hypoxic pulmonary hypertension and fecovery in rat. J Physiol, 1983, 55:1445-1452.
6 冉丕鑫, 钟南山.生长因子、原癌基因与低氧性肺动脉高压，基础医学与临床,1996,16:1-4.
7 Duarte J, Petz VF, Zarzuelo A, et al. Inhibitory effects of Quercetin and staurasporine on phasic contractions in rat vascular smooth muscle. Eur J Pharmacol, 1994,262:149-154.
8 Delwiche F, Raines E, powell J, et al. Platelet derived growth factor enhances in vitro erythropoiesis via stimulation of mesenchymal cells. J Clin Invest, 1985,76 :137-139.
(收稿 1998-05-19 修回 1999-04-23), http://www.100md.com
单位：王昌明 540001 桂林医学院附院呼吸内科；张珍祥 同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室
关键词：槲皮素；血小板衍生生长因子；肺动脉平滑肌细胞；高血压；肺性
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【摘 要】 目的 研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素(quercetin)对血小板衍生生长因子PDGF诱导的平滑肌细胞增殖及低氧性肺动脉高压的影响。方法 ①用原代培养的小牛肺动脉平滑肌细胞，采用MTT比色法、流式细胞及Western Blot技术对PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响进行分析；②通过大鼠缺氧动物模型观察槲皮素对右心室收缩压(RVSP)，右心室/左心室+室间隔比值(RV/LV+S)及肺小动脉图像分析的影响。结果 与对照组相比槲皮素处理组能显著地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖，明显地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞酪氨酸磷酸化程度，且呈明显剂量依赖性，槲皮素对RVSP、RV/LV+S及肺小动脉中膜肥厚也有明显的抑制作用。结论 槲皮素可显著地抑制PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖，对低氧性肺动脉高压有一定的防治作用。
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【中图号】 R331.43
Effect of quercetin on pulmonary artery smooth cell proliferation and
hypoxic pulmonary hypertension in rats
WANG Changming,ZHANG Zhenxiang.
Department of Respirotory Disease, Affiliated Hospital, Guilin Medical College, Guilin 541001
【Abstract】 Objective To explore the effect of tyrosine protein kinases (TPK)inhibitor Quercetin on platelet derived growth factor (PDGF)-induced pulmonary artery smooth muscle cell(PASMC) proliferations and hypoxic pulmonary hypertension in the rats.Methods By primary culture of calf PASMC, the effect of PDGF induced PASMC proliferation was analysed using MTT colorimetry flow cytometry and Western Blot.The right ventricular systolic pressure(RVSP),the ratio of the right ventricle to left ventricle plus interventricular septum (RV/LV+S) and pulmonary small artery morphological analysis was observed on hypoxic pulmonary hypertension in the rats.Results As compared with control group, PDGF-induced PASMC proliferations and tyrosine phosphorylation with Western Blot analysis were significantly inhibited by Quercetin groups in a dose -dependent manner. The RVSP,RV/LV+S and pulmonary small artery medial thickness was remarkably inhibited by quercetin in hypoxic plumonary hypertension models in the rats.Conclusions Quercetin could block PDGF-induced PASMC proliferations by inhibiting tyrosine phosphorylation protein expression, to some extent, it could prevent and treat hypoxic pulmonany hypertension.
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【Key words】 Quercetin Platelet derived growth factor Pulmonary artery smooth muscle cell Hypertension, pulmonary
肺血管构形重建(structural remodeling)是慢性缺氧性肺动脉高压的病理形态学基础，主要表现为中膜平滑肌细胞增殖及迁移[1]，而平滑肌细胞的增殖依赖于多种生长因子的作用，尤其是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)，生长因子的作用是通过与生长因子受体结合，激活受体内酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase,TPK)使其磷酸化而调节细胞的增殖。本文通过TPK特异性抑制剂槲皮素(quercetin)来观察对PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)增殖及大鼠低氧性肺动脉高压的作用，为临床应用此药防治肺心病提供重要的实验依据。
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1 材 料 和 方 法
1.1 主要试剂及仪器
无血清DME/F-12混合培养液(SFM)，胎牛血清(FCS)，胰蛋白酶，PDGF-BB以上均为Gibco产品，槲皮素、Anti-Phosphotyrosine、a-sm-actin均为sigma产品、噻唑蓝(MTT)(瑞士Fluka产品)、流式细胞仪(FCM)(美国BD公司型号FACS420)、ASM 68k图象分析仪(德国Leite公司)。
1.2 肺动脉平滑肌细胞的制备与鉴定
初生小牛PASMC的培养按赵三妹等人的方法[2]，第5-6代细胞用于实验，细胞在相差显微镜下呈梭形或长梭形重叠多层生长，高低起伏呈“峰、谷”状，抗a-sm-actin单克隆抗体免疫荧光染色，胞浆内出现呈荧光反应的肌动蛋白丝结构(图1)。
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图1 抗a-sm-actin单抗免疫荧光染色,培养的第3代牛肺动脉
平滑肌细胞浆内呈丝状强荧光反应 ×200
1.3 Quercetin对PDGF诱导的PASMC增殖的影响
1.3.1 MTT比色法检验细胞增殖：取5～6代PASMC接种于96孔培养板内(1.6×10细胞/ml)，培养36 h，弃去原有培养基，改SFM培养24 h，细胞分组如下①Quercetin处理组:每孔分别加入含Quercetin(0.1、1、10 μmol/L)各浓度组6孔，3 h后加PDGF10 ng/ml；②PDGF组：每孔仅加PDGF10 ng/ml；③SFM组：每孔仅加SFM。以上各组分别于第24、48、72 h按Mosmann等[3]法进行MTT比色测定。
1.3.2 细胞周期时相分布测定：取5～6代细胞接种于100 ml培养瓶内，每组3瓶，在含10%FCS DMEM培养48 h后用SFM同步化培养48 h，细胞分组及处理同上，细胞处理后48 h制备成单细胞悬液，体积分数为70%冷乙醇固定后于4 ℃冰箱保存待测。FCM测量结果输入微机处理，计算样品细胞周期各时相的细胞比率(包括G0/G1,S和G2M期的DNA含量)。
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1.3.3 Quercetin对PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化影响：①细胞处理：细胞接种于100 ml培养瓶内培养48 h，再用SFM培养48 h，各组加含Quercetin (0.1、1、10、100 μmol/L)，14 h后再加一次Quercetin，3 h后加入PDGF20 ng/ml，培养24 h后再加一次Quercetin，3 h后加PDGF(20 ng/ml),1～5 min后将细胞处理进行Western Blot分析[4]。
1.3.4 动物分组：体质量200～230 g左右SD大白鼠30只,雌雄不拘，随机分组：①用药组(缺氧+Quercetin, H+Q)：动物在常压低氧(10%O2，每天持续8 h)箱中饲养，低氧前3 d开始腹腔注射Quercetin(200 mg*kg-1)每日1次。②低氧对照组(H)以等容积生理盐水代替Quercetin,其它处理同用药组。③空白对照组(C)。
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1.3.5 右心室收缩压(RVSP)及右室/左室+室间隔(RV/LV+S)比值测定：实验第22 d，大鼠用乌拉坦(l g*kg-1)麻醉，经右颈外静脉插管至右心室，接YZ-0.5Ⅰ型血压换能器，用上海产SJ-41型生理四道仪记录右心室瞬时压波形，计算RVSP，测定后完整取出动物心肺，分离右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)，60 ℃烤干后称其干重，计算RV/LV+S比值。
1.3.6 肺小动脉形态学定量测定：大鼠肺组织用10%中性福尔马林经肺动脉干和支气管灌注固定后，常规石腊包埋切片行弹力纤维染色，在ASM68K图像分析仪测量伴行及Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级呼吸性细支气管及肺泡管的肺小动脉外经、中膜厚度、横截面积和中膜面积，计算中膜厚度占外经百分比(MT%)和中膜面积占横载面积的百分比(MA%)。
1.4 统计学处理
数据以
±s表示，组间比较采用t检验。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 MTT比色法
Quercetin组的大鼠均能在24h、48h、72h，显著地抑制PDGF所诱导的PASMC增生的比色反应(A值表示)呈剂量依赖性(表1)。
表1 Quercetin对PDGF诱导的PASMC
增殖的影响(MTT法)(n=6,
±s)组 别
A值
24h
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48h
72h
SFM组
0.337±0.023
0.332±0.011
0.328±0.023
PDGF组
0.590±0.033
0.667±0.029
0.708±0.017
Quercetin组
(0.1 μmol/L)
, http://www.100md.com
0.538±0.033*
0.581±0.028***
0.610±0.027***
(1 μmol/L)
0.424±0.031***
0.518±0.036***
0.529±0.039***
(10 μmol/L)
0.373±0.036***
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0.392±0.036***
0.379±0.030***
注：与PDGF组相比 *P<0.05，***P<0.001
2.2 Quercetin对PDGF诱导的PASMC细胞周期时相分布的影响
Quercetin组能显著地抑制PDGF诱导的PASMC细胞周期S期及G2M期的增生，呈剂量依赖性(表2)。
表2 Quercetin对PDGF诱导的PASMC细胞周期时相
分布的影响(n=6,
±s), http://www.100md.com
组 别
Go/1(%)
S(%)
G2M(%)
SFM组
93.5±1.6
5.5±0.6
1.0±0.2
PDGF组
37.9±1.7
51.8±1.4
10.3±0.7
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Quercetin组
(0.1 μmol/L)
48.6±1.35**
44.9±1.6**
6.5±0.6**
(1μ mol/L)
68.5±1.0***
26.6±0.72***
4.9±1.0***
(10 μmol/L)
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85.6±1.9***
10.3±0.8***
4.1±0.8***
注:与PDGF组相比 **P<0.01，***P<0.001
2.3 Quercetin对PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化的影响
Western Blot 分析表明Quercetin能显著地抑制PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化程度,呈剂量效应关系(图2)。
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图2 Westem Blot显示槲皮素对PDGF诱导的PASMC
酪氨酸磷酸化程度的剂量效应关系
2.4 RVSP及RV/LV+S比值的变化
H+Q组的RVSP为3.33±0.33，明显低于H组4.95±0.42(P<0.001)，而又高于C组2.55±0.21(P<0.001)，说明Quercetin对低氧引起的肺动脉高压有一定的抑制作用，而H+Q组的RV/LV+S比值为0.35±0.04，明显低于H组0.43±0.02(P<0.05)，而又高于C组0.31±0.03(P<0.05)，说明Quercetin能抑制低氧引起的右心室肥大(表3)。
表3 RVSR及RV/LV+S比值(n＝10,
±s), http://www.100md.com
组别
RVSP(KPa)
RV/LV+S
H组
4.95±0.42
0.43±0.02
H+Q组
3.33±0.31△△△
0.35±0.04△
C组
2.58±0.20***
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0.31±0.03*
注：与H组相比 △P<0.05，△△△P<0.001
与H+Q组相比 *P<0.05，***P<0.001
2.5 肺小动脉结构改变和图像分析结果
光镜下见H组肺小动脉中膜显著增厚(图3)，H+Q组的变化明显减轻(图4)，图像分析结果(表4)，显示组间的肺小动物外经差异无显著性(P>0.05)，H+Q组的MT%及MA%明显低于H组(P<0.001)，而又高于C组(P<0.001)，表明Quercetin对低氧诱发的肺小动脉中膜增厚有明显抑制作用。
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图3 低氧组(21天)弹力纤维染色显示,肺小动脉内外两层弹力膜,肌型肺小动脉中膜明显增厚(MT%＝26%) ×200
图4 用药组(21天)弹力纤维染色显示,肺小动脉中膜增厚
变化较低氧组明显减轻(MT%＝8%) ×200
表4 肺动脉MT(%)和MA(%)(
±s)组别
, http://www.100md.com 鼠数
外径(um)
中膜厚度(um)
模截面积(um2)
中膜面积(um2)
MT(%)
MA(%)
H组
21
19.08±1.05
1.71±0.09
267.67±32.06
, 百拇医药
91.23±8.04
17.90±0.99
34.30±2.72
H+Q组
20
18.68±0.87
1.19±0.09
254.27±36.45
60.36±5.96
12.75±12.88△△△
23.98±2.40△△△
, 百拇医药
C组
16
20.20±1.38
0.81±0.11
303.64±26.07
48.70±4.11
8.01±1.12***
16.07±0.85***
注：与H组相比 △△△P<0.001;
与H+Q组相比 ***P<0.001
3 讨 论
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慢性阻塞性肺疾病、高原病等患者都有不同程度的肺泡低氧，肺泡低氧可引起肺血管尤其肺小动脉收缩和肺动脉中膜平滑肌增生、肥大及细胞外基质增多[5]，晚期并发肺动脉高压(PHA)和右心室肥大，目前肺血管构型重建在PHA中的作用倍受重视，其中心环节是PASMC增殖，而PASMC增殖依赖于多种生长因子尤其是PDGF的作用， PDGF在缺氧性肺动脉高压的血管构型重建中具有重要作用[6]，当生长因子与受体结合后可激活受体细胞膜内部分的TPK，其TPK可催化靶蛋白分子中的酪氨酸磷酸化，通过细胞内信息传导的共同通道而调节细胞的生长和繁殖。
Quercetin属黄酮类物，是TPK的特异性抑制剂，本研究的结果显示Quercetin能显著地抑制PDGF诱导的PASMC增殖。FCM分析表明,Quercetin能阻断PASMC G0/G1期进入DNA合成的S期，Western Blot分析表明,Quercetin能抑制PDGF诱导的酪氨酸磷酸化程度，本文首次观察到Quercetin具有抑制低氧诱发的PHA作用，减轻右心室肥大，其机制主要是通过阻断肺小动脉平滑肌细胞增生而降低肺循环阻力。有报道Quercetin可以抑制某些缩血管活性物质(如5-HT,去甲肾上腺素)所致的离体肺血管收缩[7]及抑制生长因子所致的成纤维细胞增殖及细胞外基质的沉积[8]。我们的结果表明Quercetin有可能应用于肺动脉高压的防治，其作用机理有待进一步研究。
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参 考 文 献
1 Dzou VJ, Gibbons GH. Vascular remodeling: Nachanisms and inplication. J Cardiovas Pharm, 1993,21(suppl1):1-5.
2 赵三妹,夏人仪,王宗立,等. 动肺平滑肌细胞培养方法及应用.中华病理学杂志，1987,16:260-261.
3 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival:application to proliferation and cytoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55-65.
4 Bilder GE, Krawiec JA, Mevety K, et al. Tyrphostin inhibit PDGF-induced DNA synthesis and associated early events in smooth muscle cells. Am J Physiol, 1991,260:721-730.
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5 Sobin SS, Tremer HM, Hardy J, et al. Changes in arteriole in acute and chronic hypoxic pulmonary hypertension and fecovery in rat. J Physiol, 1983, 55:1445-1452.
6 冉丕鑫, 钟南山.生长因子、原癌基因与低氧性肺动脉高压，基础医学与临床,1996,16:1-4.
7 Duarte J, Petz VF, Zarzuelo A, et al. Inhibitory effects of Quercetin and staurasporine on phasic contractions in rat vascular smooth muscle. Eur J Pharmacol, 1994,262:149-154.
8 Delwiche F, Raines E, powell J, et al. Platelet derived growth factor enhances in vitro erythropoiesis via stimulation of mesenchymal cells. J Clin Invest, 1985,76 :137-139.
(收稿 1998-05-19 修回 1999-04-23), http://www.100md.com