肝细胞生长因子对TPN大鼠小肠粘膜的保护作用
作者：李可洲 鲍 扬 李 宁 黎介寿
单位：
关键词：肝细胞生长因子；完全胃肠外营养；肠粘膜，形态学；细胞增殖
肠外与肠内营养990213 摘要 目的：探讨肝细胞生长因子(HGF)对TPN大鼠小肠粘膜的保护作用。 方法：将30只近交系Wistar大鼠随机分为对照组、TPN组及TPN-HGF组(HGF，75 μg/kg.d-1)，实验为期14天，结束后观察小肠粘膜的形态学变化和细胞增殖情况。 结果：TPN组大鼠肠粘膜绒毛高度、中段直径及隐窝深度均较对照组明显降低，增殖指数也明显降低，与TPN组相比，TPN-HGF组上述指标明显升高。 结论：使用HGF能促进TPN大鼠肠粘膜细胞增殖，维持其正常形态，从而保护了肠粘膜的机械屏障功能。
中图法分类号 R459.3
, http://www.100md.com
Influence of hepatocyte growth factor on small intestine
morphology and epithelial cells proliferation in TPN-fed rats
Li Kezhou,Li Ling,Li Jieshou et al
Research Institute of General Surgery,JinLing Hospital(Nanjing,210002)
Abstract Objectives:This study was designed to examine if systemic administrated HGF can stimulate intestine epithelial cell mass and cell proliferation. Methods:Thirty young adult Wistar(RT1K) rats were clarified into three groups.With ten rats served as sham operation control,20 rats had catheters inserted into the superior vena cava,of which ten was sustained with standard TPN and another ten with TPN plus HGF(75 μg/kg.d-1) for ten days. Results: Animals receiving only standard TPN had a significant decrease in small intestine villi hight,width and crypt depth. Epithelial cell proliferation index(PI) was also very low compared to control.In TPN-HGF treated rats morphological parameters and proliferation index were all much higher than standard TPN-fed rats(P<0.01).There was no apparent difference between TPN-HGF group and sham operation control group. Conclusions:These results suggest that HGF may be used to decrease the mucosal atrophy that commonly occurs after TPN sustentation or other gastrointestinal inhibition state.
, http://www.100md.com
Key words Hepatocyte growth factor Total parenteral nutrition Morphology Proliferation
全胃肠外营养(TPN)是临床营养支持的重要手段，但可导致肠道粘膜形态、吸收功能及免疫功能的抑制，随着对细菌易位及肠源性感染的逐步认识，保护TPN时的肠粘膜屏障功能愈显重要。肝细胞生长因子(HGF)最初被发现存在于肝部分切除后的残肝组织中，并可促进残余肝细胞的生长及DNA合成。近年的研究发现其作用较为广泛，对肾小管上皮细胞、胃粘膜细胞的生长均有促进作用〔1〕。本实验拟探讨HGF对TPN大鼠小肠粘膜的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 雄性近交系Wistar大鼠(上海中科院实验动物中心提供)、体重200～250 g/只，随机分为三组(每组各10只)：A组为对照组，行虚拟手术，普通饲料喂养和自由饮水；B组(TPN组)给予常规TPN；C组(TPN-HGF组)在常规TPN的同时给予75 μg/(kg.d)人胎肝细胞生长因子(军事医学科学院提供)。
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1.2 大鼠TPN模型 氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，右颈部作弧形切口显露右颈外静脉，插入内径0.8 mm硅胶管至上腔静脉(1.5～2.0 mm)内，硅胶管引出接保护弹簧及自制旋转输液装置于代谢笼内观察。对照组行右颈外静脉结扎。
1.3 TPN营养液 TPN配方组成见表1。每1 000 ml TPN液含氮7.5 g，非蛋白热量3 700 kJ，糖∶脂为6∶4，非蛋白热量与氮的比值为118∶1，输注速度为200 ml/(kg.d)。
表1 TPN营养液配方组成 (ml/L)
Tab. 1 TPN infusion formlas 营养素
数量
50%葡萄糖
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266
30%脂肪乳
118
10%复方氨基酸
536
10%氯化钠
35
10%氯化钾
15
10%葡萄糖酸钙
10
水乐维他
10
, 百拇医药
维他利匹特
10
安达美
10
1.4 标本采集 各组于术后14天实验结束时，以氯胺酮麻醉后剖腹取距Treitz韧带20 cm处空肠5 cm，其中3 cm以10%福马林固定做病理标本，另2 cm用预冷戊二醛保存做透射电镜检查。另取空肠5 cm刮取肠粘膜制成单细胞悬液做流式细胞仪检查。
1.5 小肠粘膜形态学检查 常规石蜡包埋切片，HE染色，中性树脂封片。选择绒毛、隐窝形态完整的切片，于光镜下用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统测定绒毛高度、中段直径及隐窝深度。
1.6 流式细胞学检查 取近端空肠纵向剖开，用预冷的复方乳酸钠溶液冲洗干净肠内容物及粘液，用载玻片刮下肠粘膜，加等渗盐水研磨后用300目金属筛网过滤成单细胞悬液，经PBS漂洗3次，调整细胞浓度为1×109/L，后取1 ml行1 800 r/min离心10 min，弃上清，加1 ml低渗碘化丙啶溶液对肠粘膜细胞核中的DNA染色，4℃过夜，次日上Epics XL流式细胞仪分析。其结果表示为细胞增殖指数(PI)，即PI=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)
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1.7 电镜检查 将小肠标本切割为1 mm×1 mm的组织块，依次脱水、包埋、超薄切片及双重染色，在透射电镜下观察小肠粘膜细胞超微结构变化。
1.8 统计学处理 结果以均数±标准差表示，以Spss(5.0)软件行t检验。P<0.05为差异显著。
2 结 果
2.1 小肠粘膜形态学变化 TPN组大鼠小肠各层均变薄，粘膜明显萎缩，其绒毛高度、面积及隐窝深度均较对照组明显降低(P<0.01)；TPN-HGF组绒毛高度、面积及隐窝深度均较TPN组明显升高(P<0.01)，与对照组之间差异不显著(P>0.05)(表2)。
表2 各实验组绒毛高度、宽度、面积及隐窝深度(μm)
Tab. 2 Mucosal structure 组 别
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n
绒毛高度
中段直径
隐窝深度
对照组
10
685±24.5
94.5±13.2
165±8.4
TPN组
10
528±30.3*
, 百拇医药 75.4±14.5*
113±10.2*
TPN-HGF组
10
667±22.4Δ
95.3±13.5Δ
158±8.1Δ
*与对照组比较，P<0.01 Δ与TPN组比较，P<0.01
2.2 肠粘膜细胞增殖指数变化 TPN组PI较对照组明显降低(P<0.01)；TPN-HGF组PI明显升高(P<0.01)，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。
, 百拇医药
表3 各实验组小肠粘膜上皮细胞增殖指数变化
Tab. 3 Proliferation index 组 别
增殖指数
对照组
5.51±2.14
TPN组
3.76±1.42*
TPN-HGF组
5.75±2.25Δ
*与对照组比较，P<0.01 Δ与TPN组比较，P<0.01
, 百拇医药
2.3 透射电镜检查结果 对照组肠粘摸上皮细胞呈高柱状，排列规则，微绒毛丰富，胞质内线粒体及内质网丰富，结构完整。TPN组上皮细胞胞质内线粒体减少，常染色质减少。TPN-HGF组胞质内线粒体较丰富，常染色质也较多。
3 讨论
长期肠外营养因禁食而缺乏肠道内食糜对肠粘膜的有效刺激，致使肠蠕动减慢，门静脉血流减少，同时胃肠道激素及胰液、胆汁分泌也减少，因而对肠粘膜的作用亦减弱；TPN也对肠粘膜有直接的抑制作用，研究表明，行TPN仅3天即可导致大鼠空肠粘膜体积和功能的下降，在其后2周的实验过程中表现为渐进性的粘膜丢失，并伴有蛋白质及DNA含量的降低。TPN对麦芽糖酶、乳糖酶、蔗糖酶、D-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶等一系列肠粘膜刷状缘功能酶活性都有较大的影响，同时对糖类及氨基酸的吸收功能也大大下降〔2〕。最终导致肠粘膜萎缩、肠功能下降和通透性增加，进而发生细菌易位，引起感染和多器官功能衰竭等。这不仅影响了TPN的效果，甚至还危及病人生命。因此，在TPN过程中如何维持肠粘膜的完整性、保护肠粘膜屏障功能具有极其重要的临床意义。本实验的组织形态学观察结果表明，进行TPN支持后，小肠粘膜隐窝深度、绒毛高度和宽度，以及绒毛面积均呈显著的下降，当使用HGF后这些指标均有明显改善，接近正常对照组。这表明在TPN时加用肝细胞生长因子确能有效地防止小肠粘膜的萎缩。
, http://www.100md.com
生理状态下胃肠道粘膜处于不断的新生和死亡脱落的动态平衡中，特别是小肠上皮细胞生长旺盛，更新快，细胞增殖周期短，回肠粘膜细胞增殖周期仅为22～36 h；若肠粘膜细胞营养状况不良，又缺少促生长因素刺激，则表现为生长速度减慢，增殖状态低下，故肠粘膜的增殖情况反映了肠粘膜的生长状态。既往多通过对病理切片的观察、计数具有分裂潜能的隐窝细胞数，从而间接地了解粘膜生长情况〔3〕。采用流式细胞仪直接检测肠粘膜细胞所处的细胞周期，由计算机根据处于生长期和静止期细胞的比例以确定整个粘膜的增殖状态，使结果更加准确、可靠。在本实验中，仅行TPN的大鼠肠粘膜细胞增殖指数明显下降；在同时使用HGF的大鼠增殖指数则可上升至接近正常饮食大鼠。说明在TPN过程中细胞增殖低下、生长缓慢、是导致粘膜萎缩的重要原因，而HGF通过促进肠粘膜细胞的生长，从而维持了基本正常的粘膜形态。
HGF是由一个分子量为69 000的α亚单位及一个分子量为34 000的β亚单位组成的异二聚体。既往研究发现，人HGF的氨基酸序列约有90%与大鼠HGF相同，而且HGF的生物学活性没有种属差异〔4〕；其受体c-Met，一种具有磷酸激酶活性的跨膜蛋白也在小肠有表达。HGF不仅能促进肝细胞的有丝分裂，同时也证实能促进培养的小肠上皮细胞的增殖和迁移。这说明HGF可能在小肠上皮细胞的调节中起着重要的作用〔5〕。Taylor的实验表明，在行80%的小肠切除后仅6 h，即有HGF的mRNA表达水平上升，远早于肠上皮细胞增殖，提示HGF在小肠的适应性变化过程中可能起着促进粘膜细胞增殖的作用〔6〕。
, http://www.100md.com
本实验结果表明，HGF能促进大鼠小肠粘膜细胞增殖，防止TPN所致的肠粘膜萎缩，使肠粘膜维持正常。
参考文献
1 Watanabe S,Hirose M,Wang XE et al. Hepatocyte growth factor accelerate the wound repaire of cultured gastric mucosal cells. Bioche Binothys Res Commun,1994,199:1453
2 Miura S,Tanaka S,Yoshioka M et al. Changes in intestinal absorption of nutrients and brush border glycoproteins after total parenteral nutrition in rats. Gut,1992,33:484
, 百拇医药
3 Godlod RA,Lee CY,Wright NA. Cell proliferation in the small intestine and colon of intravenously fed rats: effects of urogastron-epidermal growth factor. Cell Prolif,1992,25:393
4 Tashiro K,Hagiya M,Nishixawa et al. Deduced primary struture of rat hepatocyte growth factor and expression of the mRNA in rat tissues. Proc Natl Acad Sci USA，1990,87:3200
5 Dignass AU,Lynch-Devaney K,Podolsky DK. Hepatocye gowth factor/scatter factor modulates intestine epithelial cell proliferation and migration. Biochem Biophys Res Commun,1994,202:701
6 Taylor R,Beveridge D,Nakamura T et al. Hepatocyte growth factor gene expression after massive small bowel resection:Lack of stimulation in lung and liver. Exp Clin Endocrinol,1995,103:58
(1998-09-10收稿), 百拇医药
单位：
关键词：肝细胞生长因子；完全胃肠外营养；肠粘膜，形态学；细胞增殖
肠外与肠内营养990213 摘要 目的：探讨肝细胞生长因子(HGF)对TPN大鼠小肠粘膜的保护作用。 方法：将30只近交系Wistar大鼠随机分为对照组、TPN组及TPN-HGF组(HGF，75 μg/kg.d-1)，实验为期14天，结束后观察小肠粘膜的形态学变化和细胞增殖情况。 结果：TPN组大鼠肠粘膜绒毛高度、中段直径及隐窝深度均较对照组明显降低，增殖指数也明显降低，与TPN组相比，TPN-HGF组上述指标明显升高。 结论：使用HGF能促进TPN大鼠肠粘膜细胞增殖，维持其正常形态，从而保护了肠粘膜的机械屏障功能。
中图法分类号 R459.3
, http://www.100md.com
Influence of hepatocyte growth factor on small intestine
morphology and epithelial cells proliferation in TPN-fed rats
Li Kezhou,Li Ling,Li Jieshou et al
Research Institute of General Surgery,JinLing Hospital(Nanjing,210002)
Abstract Objectives:This study was designed to examine if systemic administrated HGF can stimulate intestine epithelial cell mass and cell proliferation. Methods:Thirty young adult Wistar(RT1K) rats were clarified into three groups.With ten rats served as sham operation control,20 rats had catheters inserted into the superior vena cava,of which ten was sustained with standard TPN and another ten with TPN plus HGF(75 μg/kg.d-1) for ten days. Results: Animals receiving only standard TPN had a significant decrease in small intestine villi hight,width and crypt depth. Epithelial cell proliferation index(PI) was also very low compared to control.In TPN-HGF treated rats morphological parameters and proliferation index were all much higher than standard TPN-fed rats(P<0.01).There was no apparent difference between TPN-HGF group and sham operation control group. Conclusions:These results suggest that HGF may be used to decrease the mucosal atrophy that commonly occurs after TPN sustentation or other gastrointestinal inhibition state.
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Key words Hepatocyte growth factor Total parenteral nutrition Morphology Proliferation
全胃肠外营养(TPN)是临床营养支持的重要手段，但可导致肠道粘膜形态、吸收功能及免疫功能的抑制，随着对细菌易位及肠源性感染的逐步认识，保护TPN时的肠粘膜屏障功能愈显重要。肝细胞生长因子(HGF)最初被发现存在于肝部分切除后的残肝组织中，并可促进残余肝细胞的生长及DNA合成。近年的研究发现其作用较为广泛，对肾小管上皮细胞、胃粘膜细胞的生长均有促进作用〔1〕。本实验拟探讨HGF对TPN大鼠小肠粘膜的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 雄性近交系Wistar大鼠(上海中科院实验动物中心提供)、体重200～250 g/只，随机分为三组(每组各10只)：A组为对照组，行虚拟手术，普通饲料喂养和自由饮水；B组(TPN组)给予常规TPN；C组(TPN-HGF组)在常规TPN的同时给予75 μg/(kg.d)人胎肝细胞生长因子(军事医学科学院提供)。
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1.2 大鼠TPN模型 氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，右颈部作弧形切口显露右颈外静脉，插入内径0.8 mm硅胶管至上腔静脉(1.5～2.0 mm)内，硅胶管引出接保护弹簧及自制旋转输液装置于代谢笼内观察。对照组行右颈外静脉结扎。
1.3 TPN营养液 TPN配方组成见表1。每1 000 ml TPN液含氮7.5 g，非蛋白热量3 700 kJ，糖∶脂为6∶4，非蛋白热量与氮的比值为118∶1，输注速度为200 ml/(kg.d)。
表1 TPN营养液配方组成 (ml/L)
Tab. 1 TPN infusion formlas 营养素
数量
50%葡萄糖
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266
30%脂肪乳
118
10%复方氨基酸
536
10%氯化钠
35
10%氯化钾
15
10%葡萄糖酸钙
10
水乐维他
10
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维他利匹特
10
安达美
10
1.4 标本采集 各组于术后14天实验结束时，以氯胺酮麻醉后剖腹取距Treitz韧带20 cm处空肠5 cm，其中3 cm以10%福马林固定做病理标本，另2 cm用预冷戊二醛保存做透射电镜检查。另取空肠5 cm刮取肠粘膜制成单细胞悬液做流式细胞仪检查。
1.5 小肠粘膜形态学检查 常规石蜡包埋切片，HE染色，中性树脂封片。选择绒毛、隐窝形态完整的切片，于光镜下用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统测定绒毛高度、中段直径及隐窝深度。
1.6 流式细胞学检查 取近端空肠纵向剖开，用预冷的复方乳酸钠溶液冲洗干净肠内容物及粘液，用载玻片刮下肠粘膜，加等渗盐水研磨后用300目金属筛网过滤成单细胞悬液，经PBS漂洗3次，调整细胞浓度为1×109/L，后取1 ml行1 800 r/min离心10 min，弃上清，加1 ml低渗碘化丙啶溶液对肠粘膜细胞核中的DNA染色，4℃过夜，次日上Epics XL流式细胞仪分析。其结果表示为细胞增殖指数(PI)，即PI=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)
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1.7 电镜检查 将小肠标本切割为1 mm×1 mm的组织块，依次脱水、包埋、超薄切片及双重染色，在透射电镜下观察小肠粘膜细胞超微结构变化。
1.8 统计学处理 结果以均数±标准差表示，以Spss(5.0)软件行t检验。P<0.05为差异显著。
2 结 果
2.1 小肠粘膜形态学变化 TPN组大鼠小肠各层均变薄，粘膜明显萎缩，其绒毛高度、面积及隐窝深度均较对照组明显降低(P<0.01)；TPN-HGF组绒毛高度、面积及隐窝深度均较TPN组明显升高(P<0.01)，与对照组之间差异不显著(P>0.05)(表2)。
表2 各实验组绒毛高度、宽度、面积及隐窝深度(μm)
Tab. 2 Mucosal structure 组 别
, http://www.100md.com
n
绒毛高度
中段直径
隐窝深度
对照组
10
685±24.5
94.5±13.2
165±8.4
TPN组
10
528±30.3*
, 百拇医药 75.4±14.5*
113±10.2*
TPN-HGF组
10
667±22.4Δ
95.3±13.5Δ
158±8.1Δ
*与对照组比较，P<0.01 Δ与TPN组比较，P<0.01
2.2 肠粘膜细胞增殖指数变化 TPN组PI较对照组明显降低(P<0.01)；TPN-HGF组PI明显升高(P<0.01)，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。
, 百拇医药
表3 各实验组小肠粘膜上皮细胞增殖指数变化
Tab. 3 Proliferation index 组 别
增殖指数
对照组
5.51±2.14
TPN组
3.76±1.42*
TPN-HGF组
5.75±2.25Δ
*与对照组比较，P<0.01 Δ与TPN组比较，P<0.01
, 百拇医药
2.3 透射电镜检查结果 对照组肠粘摸上皮细胞呈高柱状，排列规则，微绒毛丰富，胞质内线粒体及内质网丰富，结构完整。TPN组上皮细胞胞质内线粒体减少，常染色质减少。TPN-HGF组胞质内线粒体较丰富，常染色质也较多。
3 讨论
长期肠外营养因禁食而缺乏肠道内食糜对肠粘膜的有效刺激，致使肠蠕动减慢，门静脉血流减少，同时胃肠道激素及胰液、胆汁分泌也减少，因而对肠粘膜的作用亦减弱；TPN也对肠粘膜有直接的抑制作用，研究表明，行TPN仅3天即可导致大鼠空肠粘膜体积和功能的下降，在其后2周的实验过程中表现为渐进性的粘膜丢失，并伴有蛋白质及DNA含量的降低。TPN对麦芽糖酶、乳糖酶、蔗糖酶、D-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶等一系列肠粘膜刷状缘功能酶活性都有较大的影响，同时对糖类及氨基酸的吸收功能也大大下降〔2〕。最终导致肠粘膜萎缩、肠功能下降和通透性增加，进而发生细菌易位，引起感染和多器官功能衰竭等。这不仅影响了TPN的效果，甚至还危及病人生命。因此，在TPN过程中如何维持肠粘膜的完整性、保护肠粘膜屏障功能具有极其重要的临床意义。本实验的组织形态学观察结果表明，进行TPN支持后，小肠粘膜隐窝深度、绒毛高度和宽度，以及绒毛面积均呈显著的下降，当使用HGF后这些指标均有明显改善，接近正常对照组。这表明在TPN时加用肝细胞生长因子确能有效地防止小肠粘膜的萎缩。
, http://www.100md.com
生理状态下胃肠道粘膜处于不断的新生和死亡脱落的动态平衡中，特别是小肠上皮细胞生长旺盛，更新快，细胞增殖周期短，回肠粘膜细胞增殖周期仅为22～36 h；若肠粘膜细胞营养状况不良，又缺少促生长因素刺激，则表现为生长速度减慢，增殖状态低下，故肠粘膜的增殖情况反映了肠粘膜的生长状态。既往多通过对病理切片的观察、计数具有分裂潜能的隐窝细胞数，从而间接地了解粘膜生长情况〔3〕。采用流式细胞仪直接检测肠粘膜细胞所处的细胞周期，由计算机根据处于生长期和静止期细胞的比例以确定整个粘膜的增殖状态，使结果更加准确、可靠。在本实验中，仅行TPN的大鼠肠粘膜细胞增殖指数明显下降；在同时使用HGF的大鼠增殖指数则可上升至接近正常饮食大鼠。说明在TPN过程中细胞增殖低下、生长缓慢、是导致粘膜萎缩的重要原因，而HGF通过促进肠粘膜细胞的生长，从而维持了基本正常的粘膜形态。
HGF是由一个分子量为69 000的α亚单位及一个分子量为34 000的β亚单位组成的异二聚体。既往研究发现，人HGF的氨基酸序列约有90%与大鼠HGF相同，而且HGF的生物学活性没有种属差异〔4〕；其受体c-Met，一种具有磷酸激酶活性的跨膜蛋白也在小肠有表达。HGF不仅能促进肝细胞的有丝分裂，同时也证实能促进培养的小肠上皮细胞的增殖和迁移。这说明HGF可能在小肠上皮细胞的调节中起着重要的作用〔5〕。Taylor的实验表明，在行80%的小肠切除后仅6 h，即有HGF的mRNA表达水平上升，远早于肠上皮细胞增殖，提示HGF在小肠的适应性变化过程中可能起着促进粘膜细胞增殖的作用〔6〕。
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本实验结果表明，HGF能促进大鼠小肠粘膜细胞增殖，防止TPN所致的肠粘膜萎缩，使肠粘膜维持正常。
参考文献
1 Watanabe S,Hirose M,Wang XE et al. Hepatocyte growth factor accelerate the wound repaire of cultured gastric mucosal cells. Bioche Binothys Res Commun,1994,199:1453
2 Miura S,Tanaka S,Yoshioka M et al. Changes in intestinal absorption of nutrients and brush border glycoproteins after total parenteral nutrition in rats. Gut,1992,33:484
, 百拇医药
3 Godlod RA,Lee CY,Wright NA. Cell proliferation in the small intestine and colon of intravenously fed rats: effects of urogastron-epidermal growth factor. Cell Prolif,1992,25:393
4 Tashiro K,Hagiya M,Nishixawa et al. Deduced primary struture of rat hepatocyte growth factor and expression of the mRNA in rat tissues. Proc Natl Acad Sci USA，1990,87:3200
5 Dignass AU,Lynch-Devaney K,Podolsky DK. Hepatocye gowth factor/scatter factor modulates intestine epithelial cell proliferation and migration. Biochem Biophys Res Commun,1994,202:701
6 Taylor R,Beveridge D,Nakamura T et al. Hepatocyte growth factor gene expression after massive small bowel resection:Lack of stimulation in lung and liver. Exp Clin Endocrinol,1995,103:58
(1998-09-10收稿), 百拇医药