慢性肝病明胶酶A基因表达的研究
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作者：王爱民 杨跃伟 江龙安 张云斌 杜双存 王宝恩
单位：王爱民 杨跃伟 江龙安 张云斌 杜双存 解放军252医院实验中心(保定 071000)；王宝恩 北京友谊医院肝病研究中心
关键词：慢性肝炎；肝硬化；明胶酶A；基因表达；逆转录PCR(RT-PCR)
临床消化病杂志990207 摘 要 目的：了解慢性肝炎、肝硬化患者明胶酶A基因表达的变化。方法：慢性肝炎12例，肝硬化13例及正常对照8例肝穿取肝组织，用逆转录定量PCR方法，测定慢性肝病患者明胶酶A(MMP2)的基因表达水平。结果：正常人有明胶酶A(MMP2)的基因表达；慢性肝炎、肝硬化患者MMP2基因表达较正常对照明显增强；慢性肝炎患者MMP2基因表达水平明显高于肝硬化患者。结论：明胶酶A在慢性肝病的发生、发展中可能起重要作用。
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Gelatinase A Gene Expression in Patients with Chronic Liver Disease
Wang Ai-min, Wang Bao-en, Yang Yao-wei, et al
Central Laboratory of 252 Hospital of PLA
Abstract Purpose: To investigate the alteration of gelatinase A (MMP2) gene expression in patients with chronic hepatitis and live r cirrhosis. Methods: 12 patients with chronic hepatitis, 13 patients with liver cirrhosis and 8 normal control were selected and liver tis sue was obtained by liver biopsy. MMP2 gene expression level was me asured by quantitative analysis of reverse transcription polymerase chai n reaction. Results: MMP2 gene expression could be detected in norma l subject. MMP2 gene expression levels in patients with chronic hepa titis and liver cirrhosis were higher than that of normal control. Th e gene expression level in patients with chronic hepatitis was higher in comparison with that in patients with liver cirrhosis. Conclusion: MMP2 might play an important role in the pathogenesis and developm ent of chronic liver disease.
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Key words Chronic hepatitis Liver cirrhosis Gelatinase A Gene e xpression Reverse transcription polymerase chain reaction
慢性肝炎、肝硬化的病理基础是细胞外基质蛋白的蓄积。其发生与基 质蛋白的合成代谢及降解代谢有关。研究表明参与细胞外基质降解的主要是基质金属蛋白酶类(Matrix metalloproteinases,MMPs)。MMPs根据降解底物不同可分为3大类：间质胶原 酶类，Ⅳ型胶原酶/明胶酶类和基质分解素类。目前，慢性肝病间质胶原酶的研究已有一些报道[1，2]，Ⅳ型胶原酶/明胶酶的研究则报道很少。我们采用逆转录定量PCR方法研究了慢性肝炎、肝硬化患者明胶酶A(72KDaⅣ型胶原酶/明胶酶，MMP2)基因表达水平的 变化，现报道如下。
1 材料与方法
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1.1 研究对象：慢性肝炎12例，男9例，女3例，平均年龄43±6岁。肝硬化13例 ，男11例，女2例，平均年龄48±9岁。肝穿取肝组织，部分留病理检查，余迅速投入液氮，组织学检查证实为慢性活动性肝炎和肝硬化。正常对照8例，男3例，女5例，平均年龄46±7岁，为胆囊切除患者，征得患者同意，术中取小块肝组织，部分送病理检查，余迅速投入液氮。组织学检查为正常肝组织。
1.2 试剂：总RNA提取试剂盒(Total RNA Isolation System)、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Olig(dt)15 Primers、Tag酶、PCR Markers、琼脂糖均为Promega公司产品。
1.3 仪器：毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统：Kodak digital science system DC-40。
1.4 RNA提取：用Promega公司生产的Toal RNA Isolation System提取肝组织总RNA。RNA提取工作在标本留取后1周内进行。采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，OD260/OD280需在1.8～2.0间。
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1.5 cDNA合成：采用10μl逆转录反应体系；含待测RNA100ng,AM V15u,RNA酶抑制剂20 u,Oligdt(15Primer)50μg/ml及适量dNTP(10mM)、5×RTbuffer,42℃反应1小时；95℃5分钟灭活AMV。
1.6 共扩增-PCR：参照Noonan KE[3]等的方法进行。明胶酶 A(MMP2)引物的设计参照Genebank资料及Lichtinghagen R[4]等的设计；内参对 照β-actin的引物设计参照Genebank资料。两对引物的序列见表1。
表1 MMP2及β-actin PCR引物的序列 MMP2
5’Primer(sense)
5'-CGT GGA TCC TAT GGG GCC TCT CCT G-3’
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3'Primer(antisense)
5'-GCG GAA TTC ACT CGC TGG ACA TCA GGG-3’
β-actin
5'primer(sense)
5'-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3’
3'Primer(antisense)
5'-GAT CTT CAT GAG GTA GTC AG-3’
PCR反应体系为20μl，内含cDNA 2μl，10×buffer 2μl,4×dNTP(2mM)2μ l,MMP2、β-actin引物(10mM)各2μl，Tag酶1u,用水补至20μl。PCR反应在0 .2ml薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增。PCR反应参数为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸50秒，30个循环；72℃后延伸7分钟。
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1.7 扩增产物定量分析：扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，MMP2 和β-actin的扩增产物分别为386bp和234bp。对扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析，用MMP2/β-actin的比值表示MMP2的相对表达水平。
1.8 PCR产物测序：对MMP2 PCR扩增产物测序证实为人MMP2的序列 。
1.9 统计学处理：结果以表示，用单因素方差分析进行处理。
2 结 果
正常对照可见MMP2的基因表达。慢性肝炎、肝硬化患者MMP2基因表达均高于正常对照 (P值均<0.001)。慢性肝炎患者MMP2基因表达水平较肝硬化患者显著为高(P<0.001)(见表2、附图)。表2 慢性肝病患者明胶酶A(MMP2)基因表达的改变
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例数
MMP2/β-actin
正常对照组
8
0.33±0.08
慢性肝炎
12
1.02±0.26*
肝硬化
13
0.68±0.17*△
*与正常对照组相比 P<0.001 △与慢性肝炎相比P<0.001
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附图 正常人与肝病患者MMP2基 因素达对照
1道为正常对照；2道为慢性肝炎；3道为肝硬化；4道为PCR。分子量标准，从大到小分别为1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp。
3 讨 论
明胶酶A，又称为72 KDa Ⅳ型胶原酶/明胶酶(MMP2)，是Ⅳ型胶原酶/明胶酶的一种；另一种为明胶酶B(92 KDa Ⅳ型胶原酶/明胶酶，MMP9)。它们降解的底物主要是明胶、Ⅳ型和Ⅴ型胶原，而非间质胶原(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原)。肝纤维化Ⅳ型胶原酶/明胶酶的研究尚少。
本实验结果表明：慢性肝病患者MMP2基因表达水平显著高于正常对照。慢性肝炎患者MMP2基因表达水平较肝硬化患者亦显著为高。这与我们对慢性肝病患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性的研究结果相符。
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目前关于MMP2在肝纤维化发生、发展中所起的作用尚有争议。Milanis[5]等认为Ⅳ型胶原是Disse氏腔中基底膜基质的主要成份。肝细胞与正常肝脏基质的相互作用对保 持它们特殊的功能(如白蛋白和细胞色素P-450基因表达)和维持贮脂细胞于一种静止的未分 化的非成纤维表型都是很重要的[6]。肝纤维化时MMP2基因表达增强，对正常基 底膜Ⅳ型胶原的降解增强，激活Disse氏腔中的贮脂细胞，使它们向成纤维表型转化，促进 肝纤维化的发生、发展。TakaharaT[7]等则有完全不同的观点。他们认为肝纤维 化时Ⅳ型胶原合成增加，导致Disse氏腔中Ⅳ型胶原沉积。机体通过自身的反馈调节增加MMP 2的基因表达，降解沉积的Ⅳ型胶原以维持细胞功能和内环境的平衡，阻止肝纤维化的发 生和发展。MMP2在肝纤维化、慢性肝病中的作用尚未明了。结合本研究结果及我们对实验 性肝纤维化明胶酶A基因表达的研究，我们认为MMP2在肝纤维化的不同阶段可能有不同的 作用：在肝纤维化发生的早期MMP2降解正常基质，活化贮脂细胞，是促进肝纤维化发生的 因素。而随着肝纤维化发展，Disse氏腔中Ⅳ型胶原沉积增多，MMP2基因表达增强，降解 沉积的Ⅳ型胶原，防止肝窦毛细血管化，是防止肝纤维化进展的因素。
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慢性肝病MMP2基因表达增强的机理目前尚不清楚，TGF-β基因表达增加促进MMP2产生可能是其中一个因素[6]，然而还有许多问题有待于进一步研究。
参考文献
1 Manuyama K, Feinman L, Fainsilber Z, et al. Mammalian col lagenase inerease in carly alcoholic liver disease and decrease with c irrhosis. Life Science，1982,30∶1379.
2 王爱民，王宝恩，董忠，等.慢性肝病患者血清间质胶原酶活性的研究.中华肝脏病 杂志，1996，4∶223.
3 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR1(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polyme rase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA，1990,87∶7160.
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4 Lichtinghagen R, Helmbrecht T, AmdtB, et al. Expression pattern of matrix metalloproteinases in human liver. Eur J Clin Chem Clin Bioch em，1995,33∶65.
5 Milani S, Herbst H, Schuppan D, et al. Differential expression of matrix metalloproteinase-1 and-2 genes in normal and fibrotic human liver. Am J Pathol，1994,144∶528.
6 Friedman SL, Roll FJ, Boyles J, et al. Maintenance of defferentia ted phenotype of cultured rat hepatic lipocytes by basement membrane m atrix. J Biol Chem，1989,264∶10756.
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7 Takahara T, Furui K, Funaki J, et al. Increased expression of ma trix metalloproteinase-Ⅱ in experimental liver fibrosis in rats. Hepat ology，1995,21∶787.
8 Overall CM, Wrana JL, Sodek J. Transcriptional and post-transcript ional regulation of 72KDa gelatinase/type Ⅳ collagenase by transforming growth factor-betal in human fibroblast. J Biol Chem，1991,266∶14064 .
(1998 11 02收稿), 百拇医药