沙土鼠感染幽门螺杆菌后胃粘膜病理学改变的研究
作者：迟晶 傅宝玉 九岛亮治 服部隆则
单位：迟晶 傅宝玉 中国医科大学第一临床学院消化内科(沈阳 110001)；九岛亮治 服部隆则 日本滋贺医科大学病理第一讲座
关键词：幽门螺杆菌；沙土鼠；动物模型
临床消化病杂志990205 摘 要 目的和方法：应用HP标准菌株ATCC 43504，增菌培养后接种于6周龄沙土鼠胃内。分别于2周、12周后杀死实验鼠。鼠胃经过福尔马林固定，石蜡切片，进行HP组 化染色、AB/PAS染色及Brdu.PCNA免疫组化染色。结果：接种HP2周后，胃粘膜上皮细胞间 有中性粒细胞、淋巴细胞浸润，上皮细胞及腺窝内可见大量HP存在，AB/PAS染色处见肥大细 胞增多。Brdu.PCNA呈阳性表达，明显高于对照组。接种HP12周后，胃窦部出现溃疡(2/ 3)，胃粘膜上皮细胞可见核分裂相及淋巴滤泡。结论：①接种HP2周后的沙土鼠胃粘膜呈 急性炎症改变，HP定植于胃窦粘膜呈慢性炎症改变。提示沙土鼠是研究HP感染性胃病有价值 的动物模型；②HP感染性胃粘膜Brdu.PCNA呈阳性高表达，表明HP感染过程中，伴有细胞部 增值性变化。
, 百拇医药
Study of Gastric Mucosal Pathology in Mongolian Gerbils Infec ted by Helicobacter Pylori
Chi Jing， Fu Bao-yu, Jiudao Liangzhi, et al
Department Gastroentevology, First Clinical College, Chinese Medical Un iversity
Abstrect Purpose and methods: This study selected Helicobacter p ylori (HP) standard strain ATCC 43504. After amplification end culture, the strain was vaccinated to mongolian gerbils with 6 weeks old. Th e animals were killed 2 weeks and 12 weeks later, formaldehyde fixed, paraffin sectioned brdu PCNA immunchistochemistry stained. Results: 2 weeks after vaccination, neutrophils and lymphocytes infiltrated between gastric epithelial cells a large number of HP existed in epithelial cells and fossa. Mast cells proliferated by AB/PAS staining, positive expression of Bromodexyuridine (Brdu). PCNA was higher than that of controls. 12 weeks after vaccination, ulcer appeared in gastrc antrum (2/3), karyokinesis and lymphocyte follicle could be seen in mucosal e pithelial cells. Conclusion: Mongolian gerbils appeared acute gastritis 2 weeks after vaccination. HP planted in gastric antrum mucosa. It wa s chronic inflammatory change 12 weeks later which suggested that mong olian gerbils was a valusble animal model for studying HP infection. For HP infected gastric mucosa, Brdu. PCNA positive expression was hig her, it suggested HP infection was accompanied with the change of cel l proliferation.
, 百拇医药
Key word Helicobacter pylori(HP) Mongolian gerbils Animal model
1983年由Warren等[1]从胃粘膜第一次分离出幽门螺杆菌(Hel icobacter pylori，HP)以来，HP研究已引起越来越多学者的重视，对定居于胃内HP的特 性认识更深入。1991年Yokota[2]、1996年Hirayama[3]报道了沙土鼠HP感染胃炎、胃溃疡的动物实验。建立动物感染模型，再现同一病变，观察感染后病理的动态变 化及发病机制，进一步了解其在胃内的生存机制及致病性，研究HP感染对胃粘膜向胃癌演进 过程中胃上皮细胞增殖的影响，阐明HP感染在胃癌发生、发展中的作用都具有重要意义。所 以本文建立沙土鼠HP感染模型，以病理学改变为中心，阐述其病理组织学改变。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
实验动物沙土鼠(Mongolian gerbil)MGS/SEA(SPF)，6周龄，雄性，体重50～55g。
HP：使用标准菌株ATCC43504(American Tissue Culture Collection).
HP增菌培养后调制成感染菌液2X 108 CFU 0.5 ml，用胃管向绝食24小时的沙土鼠胃内 注入，30分钟以内接种。然后再绝食4小时，连续3天接种，但后2天不绝食。接种前30分钟40%酒精胃管内注入0.5ml。对照组1同样条件下只给培养液，对照组2单纯给予40%酒精。接种后2周、4周、8周、12周、20周分别皮下注射标记细胞周期S期的5-溴脱氧尿核苷(Brom odexyuridine， Brdu)100mg/kg，1小时后杀死沙土鼠，取出全胃，沿大弯切开，暴露胃粘膜，肉眼观察胃粘膜改变，然后分别经过3.5%福尔马林，Carnoy's及MFAA(甲醇、福尔马林，醋酸)及4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成3～4μm切片。
, 百拇医药
HE染色观察组织病理学改变及炎症细胞浸润情况，Giemsa染色，HP免疫组织化学染色用于 HP判定；Brdu及上皮细胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen， PCNA) 免疫组织化学染色标记增殖期细胞，标记指数(LI%)。具体免疫组化染色方法：常规脱水脱 蜡，抗原赋活用胰蛋白酶处理10分钟，Brdu染色前用IN盐酸处理，破坏DNA双链结构，3%过 氧化氢加甲醇30分钟阻断内源性过氧化物酶活性，10%的正常羊(兔)血清10分钟阻断非特异 性反应，第一抗体为兔抗人HP抗体，鼠抗Brdu.PCNA抗体(日本DAKO生产)，用LsAB免疫组化方法染色，DAB发色，苏木素染核，脱水，树胶封片。
2 结 果
组织学改变：感染早期2周以幽门粘膜为中心的胃粘膜上皮细胞、腺窝上皮细胞间及固有 层中可见以中性粒细胞浸润为主的急性炎性改变，8周以后转变为以淋巴细胞、单核细胞浸 润为主的慢性炎性改变。炎症细胞浸润一般在腺体颈部明显。在炎症部位胃粘膜固有层，淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞也和中性粒细胞一样明显增多。炎症细胞浸润 情况另文发表。而且胃粘膜下层血管扩张、水肿，其内皮细胞肿大，炎性细胞浸润随着感染 的持续而逐渐加重，粘膜下层及固有层出现淋巴细胞聚集，形成淋巴滤泡。3个月后在胃窦部及幽门部出现胃溃疡，溃疡累及到肌层，未出现胃溃疡沙土鼠也看到了明显的炎症变化，胃腺窝加深，管腔变大、不规则。上皮细胞核染色质增多，呈现多形性。并可见多数核分裂 相存在。胃小凹上皮细胞变性，过形成及异型性出现。这样炎症性改变在所有试验组沙土鼠 内都能见到。对照组没有HP感染的沙土鼠组，2周后肉眼及组织学无改变。单纯酒精给予组1 个月后胃粘膜糜烂也恢复正常。
, 百拇医药
HE染色、Giemsa染色、HP免疫组织化学染色，在上皮细胞表层粘液及腺窝内可明显看到HP 存在。一部分菌体在粘液凝胶层内成浮游状态，一部分菌体侵入上皮细胞间。菌体量和菌体 的存在部位与细胞损害和炎性细胞浸润的程度有关。
Brdu和PCNA染色在粘膜固有层炎症部位可见细胞增殖带增宽，被标识的阳性细胞比正常粘 膜明显增多，而且炎症越重，细胞增殖越明显。提示HP感染胃病，细胞增殖亢进。
3 讨 论
众所周知，HP可导致多种胃、十二指肠疾病，是胃炎和十二指肠溃疡的主要致病因素。本 文结果证明HP感染可引起胃粘膜慢性和活动性胃炎及胃溃疡，主要特征为中性粒细胞、淋巴 细胞浸润，粘膜固有层及粘膜下层大量淋巴滤泡形成。引起胃粘膜病变主要以胃窦和胃体为 主，早期以胃窦和幽门部为重，胃体部较轻。而且感染的胃粘膜细胞增殖加快，从细胞动力 学角度探讨HP感染与胃癌发生的关系已成为近年的研究热点。细胞增殖速度的增加被认为是 肿瘤发生的标志之一。在HP相关的慢性胃炎患者中，胃粘膜上皮细胞的增殖和凋亡的速度显 著高于无HP感染者。根除HP后这种增殖和凋亡的速度基本可恢复正常[4]。提示HP 感染可能在胃癌的发生过程中起着启动因子的作用。治愈HP可能有助于胃癌及癌前病变的预 防。HP感染的胃粘膜病理形态学改变不仅与HP的直接作用及粘膜对菌体抗原的机理反应有关 ，还与HP所致粘膜障碍，粘膜屏障破坏，外来抗原侵入过多有关。目前认为，HP引起胃粘膜 炎症改变，作为致癌因子在起作用。40%酒精的先给予，一般认为能够助长沙土鼠HP接种后 胃粘膜病变的进展，增加胃粘膜对HP的易感性。胃粘膜细胞周转的异常和基因水平的不稳定 性，突变引起的恶变将是今后的重要研究课题。为什么沙土鼠HP感染会引起与人类类似的变 化，HP的长期感染实验及除菌治疗，HP与胃癌的关系研究目前正在继续研究中。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved bacilli on gas tric epithelium in active chronic gastritis. Lancet,1983,1273.
2 Yokota K, Kurebayashi Y, Takayama Y, et al. Colonization of helic obacter pylori in the gastric mucosa of mongolian gerbils. Microbiol I mmunol,1991,35(6)∶475-480.
3 Hirayama F, Takagi S, Kusuhara M, et al. Induction of gastric ul cer and intestinal metaplasia in mongolian gerbils infected with helico bacter pylori. J Gastroenterol,1996,31∶24-28.
4 Jones NI, Shannon PT, Cutz E, et al. Increase in proliferation a nd apoptosis of gastric epithelial cells early in the natural history of a haelicobacter pylori infection. Am J Pathol,1997,151(6)∶1995.
(1998 12 25收稿), http://www.100md.com
单位：迟晶 傅宝玉 中国医科大学第一临床学院消化内科(沈阳 110001)；九岛亮治 服部隆则 日本滋贺医科大学病理第一讲座
关键词：幽门螺杆菌；沙土鼠；动物模型
临床消化病杂志990205 摘 要 目的和方法：应用HP标准菌株ATCC 43504，增菌培养后接种于6周龄沙土鼠胃内。分别于2周、12周后杀死实验鼠。鼠胃经过福尔马林固定，石蜡切片，进行HP组 化染色、AB/PAS染色及Brdu.PCNA免疫组化染色。结果：接种HP2周后，胃粘膜上皮细胞间 有中性粒细胞、淋巴细胞浸润，上皮细胞及腺窝内可见大量HP存在，AB/PAS染色处见肥大细 胞增多。Brdu.PCNA呈阳性表达，明显高于对照组。接种HP12周后，胃窦部出现溃疡(2/ 3)，胃粘膜上皮细胞可见核分裂相及淋巴滤泡。结论：①接种HP2周后的沙土鼠胃粘膜呈 急性炎症改变，HP定植于胃窦粘膜呈慢性炎症改变。提示沙土鼠是研究HP感染性胃病有价值 的动物模型；②HP感染性胃粘膜Brdu.PCNA呈阳性高表达，表明HP感染过程中，伴有细胞部 增值性变化。
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Study of Gastric Mucosal Pathology in Mongolian Gerbils Infec ted by Helicobacter Pylori
Chi Jing， Fu Bao-yu, Jiudao Liangzhi, et al
Department Gastroentevology, First Clinical College, Chinese Medical Un iversity
Abstrect Purpose and methods: This study selected Helicobacter p ylori (HP) standard strain ATCC 43504. After amplification end culture, the strain was vaccinated to mongolian gerbils with 6 weeks old. Th e animals were killed 2 weeks and 12 weeks later, formaldehyde fixed, paraffin sectioned brdu PCNA immunchistochemistry stained. Results: 2 weeks after vaccination, neutrophils and lymphocytes infiltrated between gastric epithelial cells a large number of HP existed in epithelial cells and fossa. Mast cells proliferated by AB/PAS staining, positive expression of Bromodexyuridine (Brdu). PCNA was higher than that of controls. 12 weeks after vaccination, ulcer appeared in gastrc antrum (2/3), karyokinesis and lymphocyte follicle could be seen in mucosal e pithelial cells. Conclusion: Mongolian gerbils appeared acute gastritis 2 weeks after vaccination. HP planted in gastric antrum mucosa. It wa s chronic inflammatory change 12 weeks later which suggested that mong olian gerbils was a valusble animal model for studying HP infection. For HP infected gastric mucosa, Brdu. PCNA positive expression was hig her, it suggested HP infection was accompanied with the change of cel l proliferation.
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Key word Helicobacter pylori(HP) Mongolian gerbils Animal model
1983年由Warren等[1]从胃粘膜第一次分离出幽门螺杆菌(Hel icobacter pylori，HP)以来，HP研究已引起越来越多学者的重视，对定居于胃内HP的特 性认识更深入。1991年Yokota[2]、1996年Hirayama[3]报道了沙土鼠HP感染胃炎、胃溃疡的动物实验。建立动物感染模型，再现同一病变，观察感染后病理的动态变 化及发病机制，进一步了解其在胃内的生存机制及致病性，研究HP感染对胃粘膜向胃癌演进 过程中胃上皮细胞增殖的影响，阐明HP感染在胃癌发生、发展中的作用都具有重要意义。所 以本文建立沙土鼠HP感染模型，以病理学改变为中心，阐述其病理组织学改变。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
实验动物沙土鼠(Mongolian gerbil)MGS/SEA(SPF)，6周龄，雄性，体重50～55g。
HP：使用标准菌株ATCC43504(American Tissue Culture Collection).
HP增菌培养后调制成感染菌液2X 108 CFU 0.5 ml，用胃管向绝食24小时的沙土鼠胃内 注入，30分钟以内接种。然后再绝食4小时，连续3天接种，但后2天不绝食。接种前30分钟40%酒精胃管内注入0.5ml。对照组1同样条件下只给培养液，对照组2单纯给予40%酒精。接种后2周、4周、8周、12周、20周分别皮下注射标记细胞周期S期的5-溴脱氧尿核苷(Brom odexyuridine， Brdu)100mg/kg，1小时后杀死沙土鼠，取出全胃，沿大弯切开，暴露胃粘膜，肉眼观察胃粘膜改变，然后分别经过3.5%福尔马林，Carnoy's及MFAA(甲醇、福尔马林，醋酸)及4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成3～4μm切片。
, 百拇医药
HE染色观察组织病理学改变及炎症细胞浸润情况，Giemsa染色，HP免疫组织化学染色用于 HP判定；Brdu及上皮细胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen， PCNA) 免疫组织化学染色标记增殖期细胞，标记指数(LI%)。具体免疫组化染色方法：常规脱水脱 蜡，抗原赋活用胰蛋白酶处理10分钟，Brdu染色前用IN盐酸处理，破坏DNA双链结构，3%过 氧化氢加甲醇30分钟阻断内源性过氧化物酶活性，10%的正常羊(兔)血清10分钟阻断非特异 性反应，第一抗体为兔抗人HP抗体，鼠抗Brdu.PCNA抗体(日本DAKO生产)，用LsAB免疫组化方法染色，DAB发色，苏木素染核，脱水，树胶封片。
2 结 果
组织学改变：感染早期2周以幽门粘膜为中心的胃粘膜上皮细胞、腺窝上皮细胞间及固有 层中可见以中性粒细胞浸润为主的急性炎性改变，8周以后转变为以淋巴细胞、单核细胞浸 润为主的慢性炎性改变。炎症细胞浸润一般在腺体颈部明显。在炎症部位胃粘膜固有层，淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞也和中性粒细胞一样明显增多。炎症细胞浸润 情况另文发表。而且胃粘膜下层血管扩张、水肿，其内皮细胞肿大，炎性细胞浸润随着感染 的持续而逐渐加重，粘膜下层及固有层出现淋巴细胞聚集，形成淋巴滤泡。3个月后在胃窦部及幽门部出现胃溃疡，溃疡累及到肌层，未出现胃溃疡沙土鼠也看到了明显的炎症变化，胃腺窝加深，管腔变大、不规则。上皮细胞核染色质增多，呈现多形性。并可见多数核分裂 相存在。胃小凹上皮细胞变性，过形成及异型性出现。这样炎症性改变在所有试验组沙土鼠 内都能见到。对照组没有HP感染的沙土鼠组，2周后肉眼及组织学无改变。单纯酒精给予组1 个月后胃粘膜糜烂也恢复正常。
, 百拇医药
HE染色、Giemsa染色、HP免疫组织化学染色，在上皮细胞表层粘液及腺窝内可明显看到HP 存在。一部分菌体在粘液凝胶层内成浮游状态，一部分菌体侵入上皮细胞间。菌体量和菌体 的存在部位与细胞损害和炎性细胞浸润的程度有关。
Brdu和PCNA染色在粘膜固有层炎症部位可见细胞增殖带增宽，被标识的阳性细胞比正常粘 膜明显增多，而且炎症越重，细胞增殖越明显。提示HP感染胃病，细胞增殖亢进。
3 讨 论
众所周知，HP可导致多种胃、十二指肠疾病，是胃炎和十二指肠溃疡的主要致病因素。本 文结果证明HP感染可引起胃粘膜慢性和活动性胃炎及胃溃疡，主要特征为中性粒细胞、淋巴 细胞浸润，粘膜固有层及粘膜下层大量淋巴滤泡形成。引起胃粘膜病变主要以胃窦和胃体为 主，早期以胃窦和幽门部为重，胃体部较轻。而且感染的胃粘膜细胞增殖加快，从细胞动力 学角度探讨HP感染与胃癌发生的关系已成为近年的研究热点。细胞增殖速度的增加被认为是 肿瘤发生的标志之一。在HP相关的慢性胃炎患者中，胃粘膜上皮细胞的增殖和凋亡的速度显 著高于无HP感染者。根除HP后这种增殖和凋亡的速度基本可恢复正常[4]。提示HP 感染可能在胃癌的发生过程中起着启动因子的作用。治愈HP可能有助于胃癌及癌前病变的预 防。HP感染的胃粘膜病理形态学改变不仅与HP的直接作用及粘膜对菌体抗原的机理反应有关 ，还与HP所致粘膜障碍，粘膜屏障破坏，外来抗原侵入过多有关。目前认为，HP引起胃粘膜 炎症改变，作为致癌因子在起作用。40%酒精的先给予，一般认为能够助长沙土鼠HP接种后 胃粘膜病变的进展，增加胃粘膜对HP的易感性。胃粘膜细胞周转的异常和基因水平的不稳定 性，突变引起的恶变将是今后的重要研究课题。为什么沙土鼠HP感染会引起与人类类似的变 化，HP的长期感染实验及除菌治疗，HP与胃癌的关系研究目前正在继续研究中。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved bacilli on gas tric epithelium in active chronic gastritis. Lancet,1983,1273.
2 Yokota K, Kurebayashi Y, Takayama Y, et al. Colonization of helic obacter pylori in the gastric mucosa of mongolian gerbils. Microbiol I mmunol,1991,35(6)∶475-480.
3 Hirayama F, Takagi S, Kusuhara M, et al. Induction of gastric ul cer and intestinal metaplasia in mongolian gerbils infected with helico bacter pylori. J Gastroenterol,1996,31∶24-28.
4 Jones NI, Shannon PT, Cutz E, et al. Increase in proliferation a nd apoptosis of gastric epithelial cells early in the natural history of a haelicobacter pylori infection. Am J Pathol,1997,151(6)∶1995.
(1998 12 25收稿), http://www.100md.com