胆管癌胆囊收缩素受体mRNA的表达及意义
作者：何振平 马宽生 王曙光 李昆
单位：第三军医大学西南医院肝胆外科中心(重庆400038)
关键词：胆管癌；胆囊收缩素；受体mRNA
肝胆胰外科杂志9903 摘 要 目的 观察胆囊收缩素受体mRNA在胆管癌中的表达。方法 应用原位杂交技术检测了42例胆管癌标本中胆囊收缩素-A、胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA的表达。结果 38例(90.5%)胆管癌标本有胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA的表达，20例(47.6%)标本有胆囊收缩素-A受体mRNA的表达，15例标本同时表达胆囊收缩素-A受体mRNA和胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA；胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA表达量显著高于胆囊收缩素-A受体mRNA；两种受体mRNA的表达量与胆管癌的部位无关，而与其分化程度有关，分化程度越高，表达量越多。结论 胆管癌有胆囊收缩素受体mRNA表达，表达量与分化程度密切相关。
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Expression and significance of cholecystokinin receptors mRNA in cholangiocarcinoma
He Zhenpin,Ma Kuansheng,Wang Shuguang,et al.Department of Hepatobiliary,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,630038
Abstract Objective To investigate the expression of cholecystokinin(CCK)receptors mRNA in Cholangiocarcinoma and provide theoric basis for biological treatment to the cancer.Methods Expression of CCK-A receptor and CCK-B receptor mRNA were detected in 42 samples of bile duct cancer with the technique of in situ hybridization hitochemistry.Resules The researches showed that CCK-B/Gastrin receptor mRNA expressed in 38(90.5%) samples,20(47.6%)samples possessed mRNA of CCK-A receptor,two kinds of mRNA were detected in 15(35.7%)samples.The expressive amount of CCK-B/Gastrin receptor mRNA was significantly higher than of CCK-A receptor mRNA.The expression amount of two receptor mRNA was not related to the cancer position,but had close relationship to differentiation.The higher the differentiation,the more the expression.Conclusion CCK receptor mRNA were experssed in cholangiocarcinoma,and the amount of expression was close relationship to the differentiation of the cancer.
, 百拇医药
Key word Cholangiocarcinoma Cholecystokinin Receptor mRNA
已研究证实在胰腺癌、胃癌、结肠癌及小细胞肺癌有胆囊收缩素-A和(或)胆囊收缩素-B/胃泌素受体(Cholecystokinin-A Receptor,CCK-AR;Cholecystokinin-B/Gastrin Receptor,CCK-B/GastrinR)表达，CCK、Gastrin可通过癌细胞膜上两种受体促进肿瘤的增殖[1]。胆管癌由于发病率较低[2]，与CCK关系的研究很少，尤其胆管癌表达CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA方面未见报道。有鉴于此，本课题首次检测了胆管癌标本中CCK-AR和CCK-B/GastrinR mRNA的表达情况，并探讨其与临床病理的关系。
1 材料和方法
1.1 临床资料 收集本校附属一、二院胆管癌手术切除新鲜标本42例，立即放液氮中保存，检测前再集中进行冰冻切片和原位杂交。42例中，男20例(47.6%)，女22(52.4%)例；平均年龄53.1±10.5(26～78)岁。有20例(47.6%)肿瘤病灶完整切除，作为根治切除组，该组无手术死亡。另外22例(52.4%)姑息性手术治疗，死亡2例(4.7%)，为姑息手术组。组织学类型：粘液腺癌4例(9.5%)，乳头状腺癌2例(4.7%)，腺鳞癌1例(2.4%)，其余35例(83.3%)为腺癌。表1显示胆管癌的部位与分化程度。
, 百拇医药
表1 胆管癌部位与分化程度
高分化
中分化
低分化
合计
肝内胆管
4
2
2
8(19%)
肝门部胆管
10
6
, 百拇医药
4
20(47.6%)
胆总管中段
1
1
1
3(7%)
胆总管下段
4
3
4
11(26.2%)
1.2 主要试剂 含有CCK-AR cDNA的质粒TA由Mitsuhiro Ito(kobe University School of Medicine,JAPAN)教授惠赠，含有CCK-B/GastrinR cDNA的质粒FBRH由Alan S.Kopin(New England Medical Center,AMERICAN)教授惠赠。限制性内切酶EclRⅠ、HinDⅢ、HinfⅠ，地高辛标记及检测试剂盒由宝灵曼公司提供。
, 百拇医药
1.3 原位杂交 参照文献[3]方法进行CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA阳性细胞的定性、定位、定量，显色后CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA阳性细胞内含有蓝黑色颗粒。在光镜下任选10个视野用图像分析仪(CAMIAS007真彩色图像分析系统，北京航天大学、空军总医院联合研制)对阳性细胞进行定量计数，计算面密度：面密度=目标面积(每个视野中阳性颗粒所占面积)/统计场面积(每个视野总面积，定为1)。原位杂交切片采用以下3种对照方式：(1)阴性对照，杂交前用RNA酶处理切片；(2)空白对照，杂交液中不加探针；(3)封闭对照，杂交液用未标记裸探针预杂交，再用标记探针杂交。
1.4 统计分析 实验结果χ±s表示，用未配对资料的t检验比较组间差异。
2 结果
2.1 三种对照切片中均未发现原位杂交产物。
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2.2 42例胆管癌标本中，有38例(90.5%)表达CCK-B/GastrinR mRNA，20例(47.6%)表达CCK-AR mRNA，15例(35.7%)同时表达CCK-A受体、CCK-B/GastrinR mRNA。表2、3显示胆管癌的位置、分化程度与两种受体mRNA表达情况。
表2 胆管癌的位置与两种受体mRNA的表达
CCK-AR mRNA
CCK-B/GastrinR mRNA
肝内胆管
3
7
肝门部胆管
10
, 百拇医药
19
胆总管中段
1
2
胆总管下段
6
10
合计
20(47.6%)
38(90.5%)
注：有15例(35.7%)胆管癌同时表达两种受体mRNA。表3 胆管癌分化程度与两种受体mRNA表达情况
CCK-AR mRNA
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CCK-B/GastrinR mRNA
高分化
14
19
中分化
4
10
低分化
2
9
合计
20(47.6%)
38(90.5%)
, 百拇医药
图1表明，不论胆管癌部位如何，CCK-B/GastrinR mRNA表达的量(面密度)均高于同一部位的CCK-AR mRNA(P<0.05)；从同一种受体mRNA表达情况看，不同的位置之间面密度无显著性差异(P>0.05)。说明两种受体mRNA的表达量与胆管癌部位无关。
图1 胆管癌位置与两受体mRNA表达量
图2 胆管癌分化程度与两受体mRNA表达量
图2显示，相同分化程度的胆管癌两种受体mRNA的表达量，CCK-B/GastrinR mRNA比CCK-AR mRNA明显增多(P<0.05)；随着分化程度的增高，同一种受体mRNA表达强度则显著增强。表明CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA的表达与胆管癌细胞的分化程度关系密切，分化程度越高，表达越强。
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3 讨论
生理情况下，CCK可促进胆管上皮细胞的增殖。有关CCK与胆管癌关系的研究较少。Hudd[4]1985年首次报道CCK-8可抑制移植于裸鼠的人胆管癌细胞Slu-132的生长，推测Slu-132有CCK受体存在。但后来的报告却认为CCK对移植于裸鼠的胆管癌细胞Slu-132的增殖无明显影响[5]。Mark[6]和Evers[7]观察了CCK释放促进剂消胆胺和CCK释放抑制剂牛磺胆酸盐对移植于裸鼠的Slu-132有CCK受体存在。但后来的报告却认为CCK对移植于裸鼠的胆管癌细胞Slu-132细胞生长的作用，发现消胆胺组中肿瘤的重量、蛋白质、DNA和RNA含量均明显低于对照组，而牛磺胆酸盐组则明显高于对照组，证实内源性CCK也具有抑制胆管癌增殖的作用。至今，国外发表的CCK与胆管癌关系的文献仅限于对胆管癌细胞株Slu-132增殖影响的研究，结果也不一致。近来，Ikematsu[8]发现CCK显著促进了BOP诱导肝内外胆管癌的发生，此作用可被胆囊收缩素-A受体拮剂剂L18抑制。再次证明CCK对胆管癌的发生和发展起促进作用。
, 百拇医药
有关消化道激素受体的表达与消化道肿瘤分化程度关系的研究结果也不一致[9]。一些学者发现随着肿瘤恶性程度的增强，其表达消化道激素受体细胞的数量及受体类型愈多；但也有相反报道[10]，即消化道受体表达的量愈多，则分化程度越高，功能也愈接近正常的细胞。
本实验发现，胆管癌标本有CCK-A和(或)CCK-B/GastrinR mRNA表达；表达的CCK-AR和CCK-B/GastrinR mRNA的量与肿瘤的位置无关，而与肿瘤的分化程度有关，高分化>中分化>低分化，即随着肿瘤分化程度增高，其表达两种受体mRNA的量渐增多。正常胆管上皮细胞主要表达CCK-A受体[11]，介导CCK刺激胆囊收缩，在胆汁形成和浓缩过程中也起重要作用；胆道上皮的CCK-B/Gastrin受体表达较弱。而本实验发现胆管癌细胞表达CCK-B/Gastrin受体mRNA的量显著大于CCK-A，可能与胆管癌细胞发生及发展过程中基因的变异有关。
, 百拇医药
*本课题为国家自然科学基金资助项目
4 参考文献
[1] 樊代明，陈元方，尤涵.胃肠肽类激素对消化系统肿瘤生物学行为的调控作用.中华消化杂志，1996，16(4)∶229～231
[2] Pichlmayr R,Weimann A,Klempnauer J,et al.Surgical treatment in proximal bile duct cancer.A single-center experience.Ann Surg,1996,224(5)∶628～638
[3] 蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子技术.成都：四川科学技术出版社，1994.406～435
[4] Hudd C,Euhus DM,Laregina MC,et al.Effect of cholecystokinin on human cholangiocarcinoma xenografted into nude mice.Cancer Res,1985,5(3)∶1372～1377
, 百拇医药
[5] Hudd C,Laregina MC,Devine JE,et al.Respone to Exogenous cholecystokinin of Six Human Gastrointestinal Cancers Xenografted in Nude Mice.Am J Surg,1989,157∶386
[6] Mark EB.Endogenous cholecystokinin regulates growth of human cholangiocarcinoma.Ann Surg,1989,210(3)∶317
[7] Evers BM,Gomez G,Townsend CM,et al.Endogenous cholecystokinin regulates growth of human cholangiocarcinoma.Ann Surg,1989,210(3)∶317～322
, 百拇医药
[8] Ikematsu Y,Tomioka T,Tajima Y,et al.Enhancement of biliary carcinogenesis in hamsteers by cholecystokinini.World J Surg,1995,19(6)∶847～850
[9] Park JG,Choe GY,Helman LJ,et al.Chromogranin-A expression in gastric and colon cancer tissues.Int J Cancer,1992,51(2)∶189～194
[10] 励春健.胃肠道癌肿内分泌治疗的进展.国外医学外科学分册，1996，23(4)∶203～204
[11] Calam J.CCK/gastrin antagonists-clinical perspectives.Acta Gastroenterol Belg,1993,56(3～4)∶251～256
收稿：1999-04-10，修回：1999-06-10, 百拇医药
单位：第三军医大学西南医院肝胆外科中心(重庆400038)
关键词：胆管癌；胆囊收缩素；受体mRNA
肝胆胰外科杂志9903 摘 要 目的 观察胆囊收缩素受体mRNA在胆管癌中的表达。方法 应用原位杂交技术检测了42例胆管癌标本中胆囊收缩素-A、胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA的表达。结果 38例(90.5%)胆管癌标本有胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA的表达，20例(47.6%)标本有胆囊收缩素-A受体mRNA的表达，15例标本同时表达胆囊收缩素-A受体mRNA和胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA；胆囊收缩素-B/胃泌素受体mRNA表达量显著高于胆囊收缩素-A受体mRNA；两种受体mRNA的表达量与胆管癌的部位无关，而与其分化程度有关，分化程度越高，表达量越多。结论 胆管癌有胆囊收缩素受体mRNA表达，表达量与分化程度密切相关。
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Expression and significance of cholecystokinin receptors mRNA in cholangiocarcinoma
He Zhenpin,Ma Kuansheng,Wang Shuguang,et al.Department of Hepatobiliary,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,630038
Abstract Objective To investigate the expression of cholecystokinin(CCK)receptors mRNA in Cholangiocarcinoma and provide theoric basis for biological treatment to the cancer.Methods Expression of CCK-A receptor and CCK-B receptor mRNA were detected in 42 samples of bile duct cancer with the technique of in situ hybridization hitochemistry.Resules The researches showed that CCK-B/Gastrin receptor mRNA expressed in 38(90.5%) samples,20(47.6%)samples possessed mRNA of CCK-A receptor,two kinds of mRNA were detected in 15(35.7%)samples.The expressive amount of CCK-B/Gastrin receptor mRNA was significantly higher than of CCK-A receptor mRNA.The expression amount of two receptor mRNA was not related to the cancer position,but had close relationship to differentiation.The higher the differentiation,the more the expression.Conclusion CCK receptor mRNA were experssed in cholangiocarcinoma,and the amount of expression was close relationship to the differentiation of the cancer.
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Key word Cholangiocarcinoma Cholecystokinin Receptor mRNA
已研究证实在胰腺癌、胃癌、结肠癌及小细胞肺癌有胆囊收缩素-A和(或)胆囊收缩素-B/胃泌素受体(Cholecystokinin-A Receptor,CCK-AR;Cholecystokinin-B/Gastrin Receptor,CCK-B/GastrinR)表达，CCK、Gastrin可通过癌细胞膜上两种受体促进肿瘤的增殖[1]。胆管癌由于发病率较低[2]，与CCK关系的研究很少，尤其胆管癌表达CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA方面未见报道。有鉴于此，本课题首次检测了胆管癌标本中CCK-AR和CCK-B/GastrinR mRNA的表达情况，并探讨其与临床病理的关系。
1 材料和方法
1.1 临床资料 收集本校附属一、二院胆管癌手术切除新鲜标本42例，立即放液氮中保存，检测前再集中进行冰冻切片和原位杂交。42例中，男20例(47.6%)，女22(52.4%)例；平均年龄53.1±10.5(26～78)岁。有20例(47.6%)肿瘤病灶完整切除，作为根治切除组，该组无手术死亡。另外22例(52.4%)姑息性手术治疗，死亡2例(4.7%)，为姑息手术组。组织学类型：粘液腺癌4例(9.5%)，乳头状腺癌2例(4.7%)，腺鳞癌1例(2.4%)，其余35例(83.3%)为腺癌。表1显示胆管癌的部位与分化程度。
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表1 胆管癌部位与分化程度
高分化
中分化
低分化
合计
肝内胆管
4
2
2
8(19%)
肝门部胆管
10
6
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4
20(47.6%)
胆总管中段
1
1
1
3(7%)
胆总管下段
4
3
4
11(26.2%)
1.2 主要试剂 含有CCK-AR cDNA的质粒TA由Mitsuhiro Ito(kobe University School of Medicine,JAPAN)教授惠赠，含有CCK-B/GastrinR cDNA的质粒FBRH由Alan S.Kopin(New England Medical Center,AMERICAN)教授惠赠。限制性内切酶EclRⅠ、HinDⅢ、HinfⅠ，地高辛标记及检测试剂盒由宝灵曼公司提供。
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1.3 原位杂交 参照文献[3]方法进行CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA阳性细胞的定性、定位、定量，显色后CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA阳性细胞内含有蓝黑色颗粒。在光镜下任选10个视野用图像分析仪(CAMIAS007真彩色图像分析系统，北京航天大学、空军总医院联合研制)对阳性细胞进行定量计数，计算面密度：面密度=目标面积(每个视野中阳性颗粒所占面积)/统计场面积(每个视野总面积，定为1)。原位杂交切片采用以下3种对照方式：(1)阴性对照，杂交前用RNA酶处理切片；(2)空白对照，杂交液中不加探针；(3)封闭对照，杂交液用未标记裸探针预杂交，再用标记探针杂交。
1.4 统计分析 实验结果χ±s表示，用未配对资料的t检验比较组间差异。
2 结果
2.1 三种对照切片中均未发现原位杂交产物。
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2.2 42例胆管癌标本中，有38例(90.5%)表达CCK-B/GastrinR mRNA，20例(47.6%)表达CCK-AR mRNA，15例(35.7%)同时表达CCK-A受体、CCK-B/GastrinR mRNA。表2、3显示胆管癌的位置、分化程度与两种受体mRNA表达情况。
表2 胆管癌的位置与两种受体mRNA的表达
CCK-AR mRNA
CCK-B/GastrinR mRNA
肝内胆管
3
7
肝门部胆管
10
, 百拇医药
19
胆总管中段
1
2
胆总管下段
6
10
合计
20(47.6%)
38(90.5%)
注：有15例(35.7%)胆管癌同时表达两种受体mRNA。表3 胆管癌分化程度与两种受体mRNA表达情况
CCK-AR mRNA
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CCK-B/GastrinR mRNA
高分化
14
19
中分化
4
10
低分化
2
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合计
20(47.6%)
38(90.5%)
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图1表明，不论胆管癌部位如何，CCK-B/GastrinR mRNA表达的量(面密度)均高于同一部位的CCK-AR mRNA(P<0.05)；从同一种受体mRNA表达情况看，不同的位置之间面密度无显著性差异(P>0.05)。说明两种受体mRNA的表达量与胆管癌部位无关。
图1 胆管癌位置与两受体mRNA表达量
图2 胆管癌分化程度与两受体mRNA表达量
图2显示，相同分化程度的胆管癌两种受体mRNA的表达量，CCK-B/GastrinR mRNA比CCK-AR mRNA明显增多(P<0.05)；随着分化程度的增高，同一种受体mRNA表达强度则显著增强。表明CCK-AR、CCK-B/GastrinR mRNA的表达与胆管癌细胞的分化程度关系密切，分化程度越高，表达越强。
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3 讨论
生理情况下，CCK可促进胆管上皮细胞的增殖。有关CCK与胆管癌关系的研究较少。Hudd[4]1985年首次报道CCK-8可抑制移植于裸鼠的人胆管癌细胞Slu-132的生长，推测Slu-132有CCK受体存在。但后来的报告却认为CCK对移植于裸鼠的胆管癌细胞Slu-132的增殖无明显影响[5]。Mark[6]和Evers[7]观察了CCK释放促进剂消胆胺和CCK释放抑制剂牛磺胆酸盐对移植于裸鼠的Slu-132有CCK受体存在。但后来的报告却认为CCK对移植于裸鼠的胆管癌细胞Slu-132细胞生长的作用，发现消胆胺组中肿瘤的重量、蛋白质、DNA和RNA含量均明显低于对照组，而牛磺胆酸盐组则明显高于对照组，证实内源性CCK也具有抑制胆管癌增殖的作用。至今，国外发表的CCK与胆管癌关系的文献仅限于对胆管癌细胞株Slu-132增殖影响的研究，结果也不一致。近来，Ikematsu[8]发现CCK显著促进了BOP诱导肝内外胆管癌的发生，此作用可被胆囊收缩素-A受体拮剂剂L18抑制。再次证明CCK对胆管癌的发生和发展起促进作用。
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有关消化道激素受体的表达与消化道肿瘤分化程度关系的研究结果也不一致[9]。一些学者发现随着肿瘤恶性程度的增强，其表达消化道激素受体细胞的数量及受体类型愈多；但也有相反报道[10]，即消化道受体表达的量愈多，则分化程度越高，功能也愈接近正常的细胞。
本实验发现，胆管癌标本有CCK-A和(或)CCK-B/GastrinR mRNA表达；表达的CCK-AR和CCK-B/GastrinR mRNA的量与肿瘤的位置无关，而与肿瘤的分化程度有关，高分化>中分化>低分化，即随着肿瘤分化程度增高，其表达两种受体mRNA的量渐增多。正常胆管上皮细胞主要表达CCK-A受体[11]，介导CCK刺激胆囊收缩，在胆汁形成和浓缩过程中也起重要作用；胆道上皮的CCK-B/Gastrin受体表达较弱。而本实验发现胆管癌细胞表达CCK-B/Gastrin受体mRNA的量显著大于CCK-A，可能与胆管癌细胞发生及发展过程中基因的变异有关。
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*本课题为国家自然科学基金资助项目
4 参考文献
[1] 樊代明，陈元方，尤涵.胃肠肽类激素对消化系统肿瘤生物学行为的调控作用.中华消化杂志，1996，16(4)∶229～231
[2] Pichlmayr R,Weimann A,Klempnauer J,et al.Surgical treatment in proximal bile duct cancer.A single-center experience.Ann Surg,1996,224(5)∶628～638
[3] 蔡文琴，王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子技术.成都：四川科学技术出版社，1994.406～435
[4] Hudd C,Euhus DM,Laregina MC,et al.Effect of cholecystokinin on human cholangiocarcinoma xenografted into nude mice.Cancer Res,1985,5(3)∶1372～1377
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[5] Hudd C,Laregina MC,Devine JE,et al.Respone to Exogenous cholecystokinin of Six Human Gastrointestinal Cancers Xenografted in Nude Mice.Am J Surg,1989,157∶386
[6] Mark EB.Endogenous cholecystokinin regulates growth of human cholangiocarcinoma.Ann Surg,1989,210(3)∶317
[7] Evers BM,Gomez G,Townsend CM,et al.Endogenous cholecystokinin regulates growth of human cholangiocarcinoma.Ann Surg,1989,210(3)∶317～322
, 百拇医药
[8] Ikematsu Y,Tomioka T,Tajima Y,et al.Enhancement of biliary carcinogenesis in hamsteers by cholecystokinini.World J Surg,1995,19(6)∶847～850
[9] Park JG,Choe GY,Helman LJ,et al.Chromogranin-A expression in gastric and colon cancer tissues.Int J Cancer,1992,51(2)∶189～194
[10] 励春健.胃肠道癌肿内分泌治疗的进展.国外医学外科学分册，1996，23(4)∶203～204
[11] Calam J.CCK/gastrin antagonists-clinical perspectives.Acta Gastroenterol Belg,1993,56(3～4)∶251～256
收稿：1999-04-10，修回：1999-06-10, 百拇医药
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