骨肉瘤基因改变的研究现状
作者：殷国勇(综述) 费 俭 陶松年 董天华(审校)
单位：南京医科大学第一附属医院骨科(210029)；费 俭(中国科学院上海细胞生物学研究所)；董天华(苏州医学院附属第一医院骨科)
关键词：
江苏医药990314 骨肉瘤是骨的高度恶性肿瘤，从分子水平的角度看其形成机制：一是致癌基因的过度表达，一是抑癌基因的突变或被抑制。本文综述骨肉瘤的基因改变及其预后。
一、抑癌基因的改变
最常见的抑癌基因是p53，定位于染色体17pp13，野生型的p53的蛋白在NH2末端具有转录因子的活性，可与启动子上特异性的DNA序列相结合而激活靶基因(如p21)，如果启动子上没有可与p53结合的特异性的DNA序列，p53反过来就抑制转录。利用SSCP方法检查127例骨肉瘤标本的p53基因发现21例发生改变，其中13个属误义突变引起氨基酸序列的改变，6个属无意义的突变。大部分误义突变发生在氨基酸的保守序列，小部分发生在随机序列(162ILe突变成162Phe、193His突变成193Gln、259Asp突变成259Val)。使用Southern方法对11例骨肉瘤进行杂交分析，有10例p53基因的第一个内显子发生改变；在另一组11例骨肉瘤样本中有6例p53基因重新排序。对235例儿童骨肉瘤患者的外周血淋巴细胞进行DNA分析，其中18例p53基因发生改变，且全部发生在外显子5～8，外显子5的改变主要是第175位密码子碱基G向A的转变；外显子6是第213位密码子碱基A向G的转变；外显子7是第242位密码子碱基G向A的转变；外显子8是第271位密码子碱基A向T的转变和第273位密码子碱基C向A的转变。
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RB基因是另外一种肿瘤抑制基因，位于染色体13p14，编码一个110Kd的磷蛋白(p110)，p110拮抗基因转录的调节剂c-myc和c-fos，从而影响细胞从G1期向S期的转变。原发性骨肉瘤RB基因丧失其杂合性(Loss of heterozgssity，RBLOH)的约占50%。RBLOH可能是通过DNA的甲基化而出现基因组的嵌插，RBLOH在骨肉瘤的发生过程中起重要作用。Olivier Feugeas[1]研究了47例骨肉瘤标本其中有24例发生RBLOH，更重要的是没有发生RBLOH的骨肉瘤病人大部分对术前的化疗非常敏感，60个月的随访调查生存率达100%；反之，60个月的生存率只有60%。因此RBLOH可能是原发性骨肉瘤的预后差的早期预测指标。位于RB的p53基因可诱导p21的形成，反过来p21又抑制RB基因的磷酸化。RB编码的蛋白PR6是细胞循环的重要环节，未磷酸化的PR6和促进细胞增殖的E2F(另一种致癌基因)相结合并抑制了它的功能，肿瘤患者E2F的值显著升高且促进细胞的转型以及肿瘤的形成，如果PR6失去功能导致E2F的过度表达，就象c-myc一样引起细胞失去额外的有丝分裂而进入未成熟的S期，进一步就引发肿瘤。
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二、致癌基因的过度表达
MDM-2基因最初是从致瘤的鼠成纤维细胞系中发现的，随后人类的MDM-2也被鉴定出来并定位于染色体12q上。MDM-2基因所编码的蛋白质能与p53以及RB相结合并抑制它们的功能。约14%的人类骨肉瘤中有MDM-2基因扩增，而在有基因扩增的患者中大部分已发生肿瘤转移。Michael等[2]通过DNA杂交分析确定了MDM-2的基因扩增与骨肉瘤的复发和转移之间存在着显著的相关性却与临床病理分型无关。MDM-2通过和p53结合才能发挥功能，MDM-2包含491个氨基酸，只有N末端100个氨基酸序列和p53相结合，人为造成的MDM-2的突变[MDM-2(△222～437)]比野生型的MDM-2所导致的p53水平高20倍，说明这种突变的MDM-2能保护p53蛋白使其不被降解。如果对p53进行突变修饰p53△I(缺少氨基酸13～19)，它就不和MDM-2相结合但仍然具有野生型p53的功能，能够诱导细胞凋亡和阻细胞在G1期的增殖。
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致癌基因C-ErbB-2(亦称neu或HER2)，定位于染色体17q21，编码一个185KD的转膜蛋白(P185c-erbB-2)，其结构非常类似于表皮生长因子的受体(Epidermal growth factor receptor)，属PTK(type I receptor tyrosine kinase growth factor)家庭成员(EGFR HER2 HER3 HER4)。P185c-erbB-2是通过自分泌或旁分泌环路发挥作用的，适当的配体可以刺激它的表达。鼠的neu可以在跨膜区域进行点突变而被激活，人类的C-erbB-2只有过度表达而没有发现点突变。最近的研究表明人类骨肉瘤的C-erbB-2基因虽没有过度表达，但表达却占42%，因为正常的骨组织中很少有该基因的表达，因此有表达就显得特别有意义。Masanori等对27例骨肉瘤进行DNA杂交分析，其中11例有C-erbB-2的表达但没有过度表达，同时发现有C-erbB-2基因表达的骨肉瘤，其恶性程度越高，肿瘤的转移能力就越强[3]。但P185c-erbB-2的预测价值可能只和肿瘤的浸润、转移及拮抗化疗药物有关，和细胞的异常增殖无关[4]。
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c-myc原癌基因编码一个核蛋白，在正常细胞和肿瘤细胞内都有表达。由多瘤病毒所致的鼠的骨肉瘤细胞内有过度表达，对儿童骨肉瘤患者研究发现：骨肉瘤细胞内c-myc过度表达[5]。由于所调查的病例都是恶性程度很高的骨肉瘤，因此可能只在恶性骨肉瘤中才有c-myc基因的过度表达。目前认为c-myc可激活E2F的表达，因为E2F的启动子的活性依赖于多个myc结合位点。c-myc能使细胞周期素A和B的水平升高，而两者却能使PRb维持在高度磷酸化状态，从而使E2F在G1-S期持续高水平地表达。另外c-myc在肿瘤内常和TGF-α共同表达，这又促进了细胞周期素D1的高度表达，而后者却又阻止pRb的表达[6]。把野生型P53基因和c-myc基因同时转染进骨肉瘤细胞，其诱导的凋亡更加明显。同时JNK/SAPK(应激激活的蛋白激酶)的活性也明显升高，c-myc的过度表达并不直接激活JNK/SAPK，而是影响它的激动剂和抑制剂的活性从而影响JNK-SAPK的活性[7]。
gli基因因其在人类恶性神经胶质瘤细胞内过度扩增而命名，定位于染色体12q13-13.4，在胚胎细胞中正常表达，在成熟组织中不表达。对3例儿童骨肉瘤进行研究，其中1例gli基因扩增了15倍，它的过度表达使其它生长和分化的关键基因调节异常并最终导致恶性变[8]。
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CAPL(mtsl)基因编码的蛋白质属于S100Ca2+-结合蛋白，正常的S100蛋白的功能可能与信号传导途径以及细胞分化的调节有关。目前认为Ca2+/S100是肌肉收缩和细胞骨架结构内的巨蛋白激酶家族的生理激动剂。也有人认为[9]：mtsl编码的蛋白质可能调节细胞的运动并和靶分子(丝状肌动蛋白、肌球蛋白以及原肌球蛋白)结合影响肿瘤细胞的浸润和转移。人类骨肉瘤细胞系有较高的CAPL的基因表达，在表达有CAPL的骨肉瘤细胞内转染可降解CAPL mRNA的斧头状核酶的基因，其肿瘤的浸润和转移能力明显下降，说明骨肉瘤内CAPL表达量越高其恶性程度越高。
以上是较常见的骨肉瘤细胞的基因异常改变，虽然还有一些基因改变目前还未检测到，但是可以确信某些物质的改变肯定与某些基因改变有关，例如正常成骨细胞和成骨细胞性骨肉瘤之间核基质蛋白的差异[10]，热休克蛋白(Heat-shock protein 27，HSP27)、金属硫蛋白(Metallothioneins MTs)、谷胱苷肽-S-转移酶(Gluatathione-S-Transferase GST π)、肺阻抗相关蛋白(Lung-Resistance-Related protein，LRP)在骨肉瘤内的过度表达[11]；P-糖蛋白的异常表达等[12]都和相关的基因改变有关。
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可见骨肉瘤的基因改变是复杂的，它们之间既相互独立又相互作用，我们对引发这些基因改变的根本原因还不甚了解，未来的研究将着重于这一方面。目前国家的人类基因组计划将对此项研究十分有益。
参考文献
[1] Oliver， et al. J Clin Oncol 1996；14：467.
[2] Michael H G, et al. Nature 1997；387：299.
[3] Masanori, et al. Cancer 1996；77：71.
[4] Feng Ji Xu, et al. Clin Can Res 1997；3：1629.
[5] Email Bogenmann, et al. Cancer Res 1990；50：3808.
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[6] Vasily V, et al. Mol Cell Biol 1997；17：4877.
[7] Ker Yu, et al. Cell Growth Differ 1998；65：4321.
[8] W. Mark, et al. Cancer Res 1992；49：5407.
[9] Gunhild Mari, et al. Cancer Res 1996；56：5490.
[10] Joseph P， et al. Cancer Res 1994；54：28.
[11] Eric Santoni, et al. Cancer Res 1998；58：123.
[12] Katia Scotland, et al. Cancer Res 1996；56：2434., http://www.100md.com
单位：南京医科大学第一附属医院骨科(210029)；费 俭(中国科学院上海细胞生物学研究所)；董天华(苏州医学院附属第一医院骨科)
关键词：
江苏医药990314 骨肉瘤是骨的高度恶性肿瘤，从分子水平的角度看其形成机制：一是致癌基因的过度表达，一是抑癌基因的突变或被抑制。本文综述骨肉瘤的基因改变及其预后。
一、抑癌基因的改变
最常见的抑癌基因是p53，定位于染色体17pp13，野生型的p53的蛋白在NH2末端具有转录因子的活性，可与启动子上特异性的DNA序列相结合而激活靶基因(如p21)，如果启动子上没有可与p53结合的特异性的DNA序列，p53反过来就抑制转录。利用SSCP方法检查127例骨肉瘤标本的p53基因发现21例发生改变，其中13个属误义突变引起氨基酸序列的改变，6个属无意义的突变。大部分误义突变发生在氨基酸的保守序列，小部分发生在随机序列(162ILe突变成162Phe、193His突变成193Gln、259Asp突变成259Val)。使用Southern方法对11例骨肉瘤进行杂交分析，有10例p53基因的第一个内显子发生改变；在另一组11例骨肉瘤样本中有6例p53基因重新排序。对235例儿童骨肉瘤患者的外周血淋巴细胞进行DNA分析，其中18例p53基因发生改变，且全部发生在外显子5～8，外显子5的改变主要是第175位密码子碱基G向A的转变；外显子6是第213位密码子碱基A向G的转变；外显子7是第242位密码子碱基G向A的转变；外显子8是第271位密码子碱基A向T的转变和第273位密码子碱基C向A的转变。
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RB基因是另外一种肿瘤抑制基因，位于染色体13p14，编码一个110Kd的磷蛋白(p110)，p110拮抗基因转录的调节剂c-myc和c-fos，从而影响细胞从G1期向S期的转变。原发性骨肉瘤RB基因丧失其杂合性(Loss of heterozgssity，RBLOH)的约占50%。RBLOH可能是通过DNA的甲基化而出现基因组的嵌插，RBLOH在骨肉瘤的发生过程中起重要作用。Olivier Feugeas[1]研究了47例骨肉瘤标本其中有24例发生RBLOH，更重要的是没有发生RBLOH的骨肉瘤病人大部分对术前的化疗非常敏感，60个月的随访调查生存率达100%；反之，60个月的生存率只有60%。因此RBLOH可能是原发性骨肉瘤的预后差的早期预测指标。位于RB的p53基因可诱导p21的形成，反过来p21又抑制RB基因的磷酸化。RB编码的蛋白PR6是细胞循环的重要环节，未磷酸化的PR6和促进细胞增殖的E2F(另一种致癌基因)相结合并抑制了它的功能，肿瘤患者E2F的值显著升高且促进细胞的转型以及肿瘤的形成，如果PR6失去功能导致E2F的过度表达，就象c-myc一样引起细胞失去额外的有丝分裂而进入未成熟的S期，进一步就引发肿瘤。
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二、致癌基因的过度表达
MDM-2基因最初是从致瘤的鼠成纤维细胞系中发现的，随后人类的MDM-2也被鉴定出来并定位于染色体12q上。MDM-2基因所编码的蛋白质能与p53以及RB相结合并抑制它们的功能。约14%的人类骨肉瘤中有MDM-2基因扩增，而在有基因扩增的患者中大部分已发生肿瘤转移。Michael等[2]通过DNA杂交分析确定了MDM-2的基因扩增与骨肉瘤的复发和转移之间存在着显著的相关性却与临床病理分型无关。MDM-2通过和p53结合才能发挥功能，MDM-2包含491个氨基酸，只有N末端100个氨基酸序列和p53相结合，人为造成的MDM-2的突变[MDM-2(△222～437)]比野生型的MDM-2所导致的p53水平高20倍，说明这种突变的MDM-2能保护p53蛋白使其不被降解。如果对p53进行突变修饰p53△I(缺少氨基酸13～19)，它就不和MDM-2相结合但仍然具有野生型p53的功能，能够诱导细胞凋亡和阻细胞在G1期的增殖。
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致癌基因C-ErbB-2(亦称neu或HER2)，定位于染色体17q21，编码一个185KD的转膜蛋白(P185c-erbB-2)，其结构非常类似于表皮生长因子的受体(Epidermal growth factor receptor)，属PTK(type I receptor tyrosine kinase growth factor)家庭成员(EGFR HER2 HER3 HER4)。P185c-erbB-2是通过自分泌或旁分泌环路发挥作用的，适当的配体可以刺激它的表达。鼠的neu可以在跨膜区域进行点突变而被激活，人类的C-erbB-2只有过度表达而没有发现点突变。最近的研究表明人类骨肉瘤的C-erbB-2基因虽没有过度表达，但表达却占42%，因为正常的骨组织中很少有该基因的表达，因此有表达就显得特别有意义。Masanori等对27例骨肉瘤进行DNA杂交分析，其中11例有C-erbB-2的表达但没有过度表达，同时发现有C-erbB-2基因表达的骨肉瘤，其恶性程度越高，肿瘤的转移能力就越强[3]。但P185c-erbB-2的预测价值可能只和肿瘤的浸润、转移及拮抗化疗药物有关，和细胞的异常增殖无关[4]。
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c-myc原癌基因编码一个核蛋白，在正常细胞和肿瘤细胞内都有表达。由多瘤病毒所致的鼠的骨肉瘤细胞内有过度表达，对儿童骨肉瘤患者研究发现：骨肉瘤细胞内c-myc过度表达[5]。由于所调查的病例都是恶性程度很高的骨肉瘤，因此可能只在恶性骨肉瘤中才有c-myc基因的过度表达。目前认为c-myc可激活E2F的表达，因为E2F的启动子的活性依赖于多个myc结合位点。c-myc能使细胞周期素A和B的水平升高，而两者却能使PRb维持在高度磷酸化状态，从而使E2F在G1-S期持续高水平地表达。另外c-myc在肿瘤内常和TGF-α共同表达，这又促进了细胞周期素D1的高度表达，而后者却又阻止pRb的表达[6]。把野生型P53基因和c-myc基因同时转染进骨肉瘤细胞，其诱导的凋亡更加明显。同时JNK/SAPK(应激激活的蛋白激酶)的活性也明显升高，c-myc的过度表达并不直接激活JNK/SAPK，而是影响它的激动剂和抑制剂的活性从而影响JNK-SAPK的活性[7]。
gli基因因其在人类恶性神经胶质瘤细胞内过度扩增而命名，定位于染色体12q13-13.4，在胚胎细胞中正常表达，在成熟组织中不表达。对3例儿童骨肉瘤进行研究，其中1例gli基因扩增了15倍，它的过度表达使其它生长和分化的关键基因调节异常并最终导致恶性变[8]。
, 百拇医药
CAPL(mtsl)基因编码的蛋白质属于S100Ca2+-结合蛋白，正常的S100蛋白的功能可能与信号传导途径以及细胞分化的调节有关。目前认为Ca2+/S100是肌肉收缩和细胞骨架结构内的巨蛋白激酶家族的生理激动剂。也有人认为[9]：mtsl编码的蛋白质可能调节细胞的运动并和靶分子(丝状肌动蛋白、肌球蛋白以及原肌球蛋白)结合影响肿瘤细胞的浸润和转移。人类骨肉瘤细胞系有较高的CAPL的基因表达，在表达有CAPL的骨肉瘤细胞内转染可降解CAPL mRNA的斧头状核酶的基因，其肿瘤的浸润和转移能力明显下降，说明骨肉瘤内CAPL表达量越高其恶性程度越高。
以上是较常见的骨肉瘤细胞的基因异常改变，虽然还有一些基因改变目前还未检测到，但是可以确信某些物质的改变肯定与某些基因改变有关，例如正常成骨细胞和成骨细胞性骨肉瘤之间核基质蛋白的差异[10]，热休克蛋白(Heat-shock protein 27，HSP27)、金属硫蛋白(Metallothioneins MTs)、谷胱苷肽-S-转移酶(Gluatathione-S-Transferase GST π)、肺阻抗相关蛋白(Lung-Resistance-Related protein，LRP)在骨肉瘤内的过度表达[11]；P-糖蛋白的异常表达等[12]都和相关的基因改变有关。
, http://www.100md.com
可见骨肉瘤的基因改变是复杂的，它们之间既相互独立又相互作用，我们对引发这些基因改变的根本原因还不甚了解，未来的研究将着重于这一方面。目前国家的人类基因组计划将对此项研究十分有益。
参考文献
[1] Oliver， et al. J Clin Oncol 1996；14：467.
[2] Michael H G, et al. Nature 1997；387：299.
[3] Masanori, et al. Cancer 1996；77：71.
[4] Feng Ji Xu, et al. Clin Can Res 1997；3：1629.
[5] Email Bogenmann, et al. Cancer Res 1990；50：3808.
, http://www.100md.com
[6] Vasily V, et al. Mol Cell Biol 1997；17：4877.
[7] Ker Yu, et al. Cell Growth Differ 1998；65：4321.
[8] W. Mark, et al. Cancer Res 1992；49：5407.
[9] Gunhild Mari, et al. Cancer Res 1996；56：5490.
[10] Joseph P， et al. Cancer Res 1994；54：28.
[11] Eric Santoni, et al. Cancer Res 1998；58：123.
[12] Katia Scotland, et al. Cancer Res 1996；56：2434., http://www.100md.com