肿瘤治疗新进展——内皮细胞生成抑制因子的发现与研究
作者：邱功阔 宋 波
单位：重庆市第三军医大学西南医院泌尿外科 重庆 400038
关键词：
医学新知杂志990307 肿瘤的生长及转移依赖于肿瘤血管生成(angiogenesis)，如果没有血管形成，实体瘤的体积只能维持在显微水平[1、2]，因此抑制肿瘤血管生成已成为不同于常规抗肿瘤治疗的新策略[3]。目前已发现了许多肿瘤血管生成抑制物，如TNP-470[4]，血小板因子4[5]，干扰素α[6]等。但这些抑制物要么因易形成耐药[6，7]，要么因抑制肿瘤血管生成作用不强使应用受到限制，因此，有必要寻找作用更强、无耐药性形成的肿瘤血管生成抑制物。1997年Folkman及其同事们就发现了具有这种作用的内皮细胞生成抑制因子——Endostatin。
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1 Endostatin的发现
Folkman等发现小鼠血管内皮细胞瘤原发瘤对转移瘤的生长有抑制作用，原发瘤切除后转移瘤生长加速。又发现血管内皮细胞瘤的细胞培养液能抑制毛细血管内皮细胞的增殖。分析这两种现象，推测血管内皮细胞瘤可能产生某种物质抑制内皮细胞增殖，用肝素sepharose层析柱从血管内皮细胞瘤细胞培养液中分离到一种20 KDa的蛋白片段，它能特异性的抑制内皮细胞增殖，命名为Endostatin[8]。
2 Endostatin的结构、来源及可能的产生机制
生化鉴定Endostatin为ⅩⅧ型胶原C-末端的184个氨基酸片段[9]，它对肝素有高度亲和性。小鼠血管内皮细胞瘤可产生Endostatin，未见其他肿瘤产生Endostatin的报道，人体血液循环中有极微量Endostatin存在[10]。ⅩⅧ型胶原特异性分布于血管基底膜中[11，12]，人和鼠的ⅩⅧ型胶原具有79%的同源性，同源性最高的部位位于Endostatin处[13]。ⅩⅧ型胶原本身并没有抑制血管生成的作用，其高表达小鼠并不出现血管形成异常[8]。Endostatin是由肿瘤细胞直接产生抑或分解ⅩⅧ型胶原产生尚不清楚。另外这种血管生成抑制物为什么会出现在血管形成旺盛的肿瘤组织中，其可能的机理有两种，一是肿瘤血管形成受血管形成刺激因素和抑制因素所调节，只不过是刺激因素强于抑制因素，所以肿瘤组织中存在着血管生成抑制物[14]；二是在血管形成过程中伴有蛋白激酶的增加，它可能分解某些前体蛋白产生血管形成抑制物[8]。
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3 Endostatin的生物学功能
3.1 Endostatin抑制内皮细胞增殖及血管形成 Folkman等用天然Endostatin进行体外试验，在内皮细胞株培养液中加入Endostatin,剂量为100ng/ml,内皮细胞增殖开始受抑制，随着剂量的增加，抑制作用增强，于600ng/ml时抑制作用最强。但Endostatin对非内皮起源的肿瘤细胞、平滑肌细胞、上皮细胞及成纤维细胞的增殖没有抑制作用。Endostatin抑制内皮细胞增殖，从而抑制血管形成，用鸡胚绒毛尿囊膜进行实验，每只鸡胚仅需10～20μg的Endostatin，血管形成就受到抑制[8]。Folkman等还重组了Endostatin cDNA，用棒状杆菌和Ecoli大肠杆菌表达Endostatin，试验证明，可溶性重组Endostatin与天然Endostatin有同样的作用。
3.2 Endostatin抑制原发瘤及转移瘤的生长 Endostatin可抑制肿瘤血管形成，进而抑制肿瘤生长及转移[15，16]。用重组Endostatin治疗小鼠100～200 mm3大小的Lewis肺癌皮下移植瘤，与对照组相比，给药剂量于2.5mg/kg/d，肿瘤生长53%被抑制，10 mg/kg/d,97%被抑制，20 mg/kg/d，肿瘤细胞凋亡指数比对照组高出7倍，治疗16 d后移植瘤消退到2 mm3以下[8]。纤维肉瘤、黑色素瘤及血管内皮细胞瘤经重组Endostatin治疗也完全缓解。Endostatin还抑制转移瘤的生长，使其完全消退到静止态的显微水平[8]。经Endostatin治疗小鼠行组织学检查见：静止态的残余瘤大小约0.06～2.23 mm3，肿瘤血管形成减少，血管壁变薄，内皮细胞处于静止状态，瘤灶内有局灶性坏死及白细胞浸润，其他部位未见转移灶。
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4 Endostatin与耐药性及毒副作用
获得性耐药和毒副作用是影响肿瘤治疗效果的主要因素[7]，而Endostatin治疗肿瘤可反复使用而不产生耐药，无毒副作用[17]。Boehm等用重组Endostatin治疗鼠350～400 mm3大小的lewis肺癌，当肿瘤消退后停止治疗，待肿瘤重新生长时再继续用药使肿瘤消退，经历时185 d的6个周期治疗，肿瘤消退到2 mm3以下的静止态，在各个周期治疗中肿瘤的消退率是相同的，鼠的体重不减轻，无耐药性形成，无毒副作用。在停止治疗到杀鼠行组织学检查的159 d里，肿瘤一直处于静止态，而且盐水治疗的对照组，肿瘤体积于27 d内增长到(10 005±1.36) mm3。用环磷酰胺化疗的对照组，于化疗前13 d，肿瘤体积保持相对稳定，然后很快获得耐药，鼠体重减轻，经两个周期治疗后相继死亡。用相同的方法对小鼠纤维肉瘤，黑色素瘤进行实验研究，结论相同。Endostatin治疗肿瘤之所以无耐药性产生，是因为它直接抑制肿瘤组织的内皮细胞增殖，从而抑制肿瘤血管形成。内皮细胞具有均质性和基因稳定性，故针对内皮细胞的抗肿瘤治疗不易产生耐药，而肿瘤细胞具有异质性和基因不稳定性，故针对肿瘤细胞的治疗容易形成耐药[18]。
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5 Endostatin与其他血管生成抑制物及传统治疗手段的联合应用
Endostatin与其他血管生成抑制物联合应用可增强抗肿瘤效果，Boehm用Endostatin与另一种血管稳定素(Endostatin)[19]联合治疗小鼠300 mm3大小的lewis肺癌，经25 d治疗肿瘤就完全消退，停止治疗后11个月内肿瘤无复发，组织学检查未见肿瘤[17]。有研究表明血管生成抑制剂与化疗药物联合应用可提高化疗药物的疗效[20]，这样Endostatin与其他化疗药物联合应用也可能成为抗肿瘤治疗的一种新手段。
6 展望
Endostatin能特异性抑制内皮细胞增殖，抑制肿瘤血管形成，试验动物经Endostatin治疗，原发瘤及转移瘤可消退到静止态的显微水平，且无耐药性形成及毒副作用。但Endostatin抑制内皮细胞增殖的作用机制及它是否抑制正常组织血管形成尚不清楚，其天然量极低，这些使Endostatin的应用受到限制。目前的关键是如何得到大量的Endostatin，进一步研究其作用机制，同时进行临床试验，观察其治疗人体肿瘤的作用如何，有无毒副作用及耐药性产生。这样随着研究的深入，有可能为抗肿瘤治疗开辟最有效途径。
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参考文献
1 Folkman J.What is evidence that tumors angiogenesis dependence.J Natl Cancer Inst, 1990,82:4～6
2 Zetter B R.Angiogensis and tumor metastasis. Annu-Kev-Med,1998,49:407～24
3 Eckhardt Sg,Pluda JM.Development of angiogensis inhibitors for cancer therapy.Ivest-New-Drugs, 1997,15(1)：1～3
4 Taki T,Ohnishi T.Anti-Proliferative effects of TNP-470 on human malignant glioma in vivo : potent inhitition of tumor angiogensis. J Neuro Oncol,1994,19:251～258
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5 Gupta S K.A potent inhibitof of endithlial cell proliferation is generated by proteolytic cleavage of the chemokine platelet factor4.Proc Natl Acad.Sci, USA,1992,7799～7803
6 Singh R K. Interferon α and β down regulate the expression of basis fibroblast growth factor in human carcinomas. Proc Natl Acad Sci Usa, 1995,92:4562～4566
7 Kerbel R S A cancer therapy resistent to resistance. Nature, 1997,390(6658):335～336
, 百拇医药
8 O'Reillyms,Folkman J.Edostatin:an endogenous inhibitor of angiogensis and tumor growth .Cell, 1997,88(2):277～285
9 Hohenester E,Sasaki T.Crystal stu cture of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5A resolution. EMBOJ,1998, 17(6):1656～1664
10 Stanker L,Schrader M. Isolution and characterization of the circulating form of human endostatin. FEBS-Lett, 1997,420(2～3):129～133
11 Yasuteru M. Mouse coll8al is expressed in a tissue specific manner as three alterative varinent and is localized in basement membrane zones. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:8763～8767
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12 Suk Paul O.Isolation and sequencing of cDNA for proteins with mutipledomains of Gly-Xaa-Yaa repeats indentify a distinct fiamily of collagenous proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91: 4229～4233
13 Saarela J.Cpmplete primary structure of two variant forms of human type ⅩⅧ collegen and tissue-specific difference in the expression of the correspondending transcripts. Matrix Bil, 1998,16(6):3193～28
14 Oho M, KuWano M.Angiogenesis and its inhibitors. Gen-To-Kagoku-Rvoho, 1997,24(11):1585～1593
, 百拇医药
15 Black W R,Agner R C.Tumor regression after endostatin therapy. Nature, 1998,29(6666):391～450
16 Sunassee K,Vile R. Hitting cancer where it hurts.Curr Biol, 1997,7(5):282～285
17 Boehm T,Folkman J. Antiangiogenic therapy of experimental does not induce acquired drug resistence. Nature, 1997,390(6658):404～407
18 Folkman J. Tumor angiogenesis and tssue factor. Nature Med, 1996,2:167～168
, 百拇医药
19 O'Reilly MS,Holmgren L.Angiostatin: A novel angigenesis inhibitor that mediates the suppression of metastasis by a lewis lung carcinoma. Cell, 1994,79(2):315～328
20 Teidher BA, Dupuis NP. Antiangiogeetic treatment increase tissue levels of anticancer drugs in mice bearing Lewis lung carcinoma. Onco Res, 1995,7(5):237～243
(1999-05-04 收稿), 百拇医药
单位：重庆市第三军医大学西南医院泌尿外科 重庆 400038
关键词：
医学新知杂志990307 肿瘤的生长及转移依赖于肿瘤血管生成(angiogenesis)，如果没有血管形成，实体瘤的体积只能维持在显微水平[1、2]，因此抑制肿瘤血管生成已成为不同于常规抗肿瘤治疗的新策略[3]。目前已发现了许多肿瘤血管生成抑制物，如TNP-470[4]，血小板因子4[5]，干扰素α[6]等。但这些抑制物要么因易形成耐药[6，7]，要么因抑制肿瘤血管生成作用不强使应用受到限制，因此，有必要寻找作用更强、无耐药性形成的肿瘤血管生成抑制物。1997年Folkman及其同事们就发现了具有这种作用的内皮细胞生成抑制因子——Endostatin。
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1 Endostatin的发现
Folkman等发现小鼠血管内皮细胞瘤原发瘤对转移瘤的生长有抑制作用，原发瘤切除后转移瘤生长加速。又发现血管内皮细胞瘤的细胞培养液能抑制毛细血管内皮细胞的增殖。分析这两种现象，推测血管内皮细胞瘤可能产生某种物质抑制内皮细胞增殖，用肝素sepharose层析柱从血管内皮细胞瘤细胞培养液中分离到一种20 KDa的蛋白片段，它能特异性的抑制内皮细胞增殖，命名为Endostatin[8]。
2 Endostatin的结构、来源及可能的产生机制
生化鉴定Endostatin为ⅩⅧ型胶原C-末端的184个氨基酸片段[9]，它对肝素有高度亲和性。小鼠血管内皮细胞瘤可产生Endostatin，未见其他肿瘤产生Endostatin的报道，人体血液循环中有极微量Endostatin存在[10]。ⅩⅧ型胶原特异性分布于血管基底膜中[11，12]，人和鼠的ⅩⅧ型胶原具有79%的同源性，同源性最高的部位位于Endostatin处[13]。ⅩⅧ型胶原本身并没有抑制血管生成的作用，其高表达小鼠并不出现血管形成异常[8]。Endostatin是由肿瘤细胞直接产生抑或分解ⅩⅧ型胶原产生尚不清楚。另外这种血管生成抑制物为什么会出现在血管形成旺盛的肿瘤组织中，其可能的机理有两种，一是肿瘤血管形成受血管形成刺激因素和抑制因素所调节，只不过是刺激因素强于抑制因素，所以肿瘤组织中存在着血管生成抑制物[14]；二是在血管形成过程中伴有蛋白激酶的增加，它可能分解某些前体蛋白产生血管形成抑制物[8]。
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3 Endostatin的生物学功能
3.1 Endostatin抑制内皮细胞增殖及血管形成 Folkman等用天然Endostatin进行体外试验，在内皮细胞株培养液中加入Endostatin,剂量为100ng/ml,内皮细胞增殖开始受抑制，随着剂量的增加，抑制作用增强，于600ng/ml时抑制作用最强。但Endostatin对非内皮起源的肿瘤细胞、平滑肌细胞、上皮细胞及成纤维细胞的增殖没有抑制作用。Endostatin抑制内皮细胞增殖，从而抑制血管形成，用鸡胚绒毛尿囊膜进行实验，每只鸡胚仅需10～20μg的Endostatin，血管形成就受到抑制[8]。Folkman等还重组了Endostatin cDNA，用棒状杆菌和Ecoli大肠杆菌表达Endostatin，试验证明，可溶性重组Endostatin与天然Endostatin有同样的作用。
3.2 Endostatin抑制原发瘤及转移瘤的生长 Endostatin可抑制肿瘤血管形成，进而抑制肿瘤生长及转移[15，16]。用重组Endostatin治疗小鼠100～200 mm3大小的Lewis肺癌皮下移植瘤，与对照组相比，给药剂量于2.5mg/kg/d，肿瘤生长53%被抑制，10 mg/kg/d,97%被抑制，20 mg/kg/d，肿瘤细胞凋亡指数比对照组高出7倍，治疗16 d后移植瘤消退到2 mm3以下[8]。纤维肉瘤、黑色素瘤及血管内皮细胞瘤经重组Endostatin治疗也完全缓解。Endostatin还抑制转移瘤的生长，使其完全消退到静止态的显微水平[8]。经Endostatin治疗小鼠行组织学检查见：静止态的残余瘤大小约0.06～2.23 mm3，肿瘤血管形成减少，血管壁变薄，内皮细胞处于静止状态，瘤灶内有局灶性坏死及白细胞浸润，其他部位未见转移灶。
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4 Endostatin与耐药性及毒副作用
获得性耐药和毒副作用是影响肿瘤治疗效果的主要因素[7]，而Endostatin治疗肿瘤可反复使用而不产生耐药，无毒副作用[17]。Boehm等用重组Endostatin治疗鼠350～400 mm3大小的lewis肺癌，当肿瘤消退后停止治疗，待肿瘤重新生长时再继续用药使肿瘤消退，经历时185 d的6个周期治疗，肿瘤消退到2 mm3以下的静止态，在各个周期治疗中肿瘤的消退率是相同的，鼠的体重不减轻，无耐药性形成，无毒副作用。在停止治疗到杀鼠行组织学检查的159 d里，肿瘤一直处于静止态，而且盐水治疗的对照组，肿瘤体积于27 d内增长到(10 005±1.36) mm3。用环磷酰胺化疗的对照组，于化疗前13 d，肿瘤体积保持相对稳定，然后很快获得耐药，鼠体重减轻，经两个周期治疗后相继死亡。用相同的方法对小鼠纤维肉瘤，黑色素瘤进行实验研究，结论相同。Endostatin治疗肿瘤之所以无耐药性产生，是因为它直接抑制肿瘤组织的内皮细胞增殖，从而抑制肿瘤血管形成。内皮细胞具有均质性和基因稳定性，故针对内皮细胞的抗肿瘤治疗不易产生耐药，而肿瘤细胞具有异质性和基因不稳定性，故针对肿瘤细胞的治疗容易形成耐药[18]。
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5 Endostatin与其他血管生成抑制物及传统治疗手段的联合应用
Endostatin与其他血管生成抑制物联合应用可增强抗肿瘤效果，Boehm用Endostatin与另一种血管稳定素(Endostatin)[19]联合治疗小鼠300 mm3大小的lewis肺癌，经25 d治疗肿瘤就完全消退，停止治疗后11个月内肿瘤无复发，组织学检查未见肿瘤[17]。有研究表明血管生成抑制剂与化疗药物联合应用可提高化疗药物的疗效[20]，这样Endostatin与其他化疗药物联合应用也可能成为抗肿瘤治疗的一种新手段。
6 展望
Endostatin能特异性抑制内皮细胞增殖，抑制肿瘤血管形成，试验动物经Endostatin治疗，原发瘤及转移瘤可消退到静止态的显微水平，且无耐药性形成及毒副作用。但Endostatin抑制内皮细胞增殖的作用机制及它是否抑制正常组织血管形成尚不清楚，其天然量极低，这些使Endostatin的应用受到限制。目前的关键是如何得到大量的Endostatin，进一步研究其作用机制，同时进行临床试验，观察其治疗人体肿瘤的作用如何，有无毒副作用及耐药性产生。这样随着研究的深入，有可能为抗肿瘤治疗开辟最有效途径。
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参考文献
1 Folkman J.What is evidence that tumors angiogenesis dependence.J Natl Cancer Inst, 1990,82:4～6
2 Zetter B R.Angiogensis and tumor metastasis. Annu-Kev-Med,1998,49:407～24
3 Eckhardt Sg,Pluda JM.Development of angiogensis inhibitors for cancer therapy.Ivest-New-Drugs, 1997,15(1)：1～3
4 Taki T,Ohnishi T.Anti-Proliferative effects of TNP-470 on human malignant glioma in vivo : potent inhitition of tumor angiogensis. J Neuro Oncol,1994,19:251～258
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5 Gupta S K.A potent inhibitof of endithlial cell proliferation is generated by proteolytic cleavage of the chemokine platelet factor4.Proc Natl Acad.Sci, USA,1992,7799～7803
6 Singh R K. Interferon α and β down regulate the expression of basis fibroblast growth factor in human carcinomas. Proc Natl Acad Sci Usa, 1995,92:4562～4566
7 Kerbel R S A cancer therapy resistent to resistance. Nature, 1997,390(6658):335～336
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8 O'Reillyms,Folkman J.Edostatin:an endogenous inhibitor of angiogensis and tumor growth .Cell, 1997,88(2):277～285
9 Hohenester E,Sasaki T.Crystal stu cture of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5A resolution. EMBOJ,1998, 17(6):1656～1664
10 Stanker L,Schrader M. Isolution and characterization of the circulating form of human endostatin. FEBS-Lett, 1997,420(2～3):129～133
11 Yasuteru M. Mouse coll8al is expressed in a tissue specific manner as three alterative varinent and is localized in basement membrane zones. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:8763～8767
, http://www.100md.com
12 Suk Paul O.Isolation and sequencing of cDNA for proteins with mutipledomains of Gly-Xaa-Yaa repeats indentify a distinct fiamily of collagenous proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91: 4229～4233
13 Saarela J.Cpmplete primary structure of two variant forms of human type ⅩⅧ collegen and tissue-specific difference in the expression of the correspondending transcripts. Matrix Bil, 1998,16(6):3193～28
14 Oho M, KuWano M.Angiogenesis and its inhibitors. Gen-To-Kagoku-Rvoho, 1997,24(11):1585～1593
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15 Black W R,Agner R C.Tumor regression after endostatin therapy. Nature, 1998,29(6666):391～450
16 Sunassee K,Vile R. Hitting cancer where it hurts.Curr Biol, 1997,7(5):282～285
17 Boehm T,Folkman J. Antiangiogenic therapy of experimental does not induce acquired drug resistence. Nature, 1997,390(6658):404～407
18 Folkman J. Tumor angiogenesis and tssue factor. Nature Med, 1996,2:167～168
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19 O'Reilly MS,Holmgren L.Angiostatin: A novel angigenesis inhibitor that mediates the suppression of metastasis by a lewis lung carcinoma. Cell, 1994,79(2):315～328
20 Teidher BA, Dupuis NP. Antiangiogeetic treatment increase tissue levels of anticancer drugs in mice bearing Lewis lung carcinoma. Onco Res, 1995,7(5):237～243
(1999-05-04 收稿), 百拇医药