缺氧性肺动脉高压时内皮素的变化及其意义
作者：梁延杰 李国红 陆江阳 王晓虹 杨毅 佟欣
单位：梁延杰 李国红 陆江阳 王晓虹 杨毅 佟欣(解放军三○四医院病理科，北京 100037)
关键词：高血压；肺性；内皮缩血管肽类；免疫组织化学；低氧
临床与实验病理学杂志990315摘要 目的：探讨内皮素-1(ET-1)与缺氧性肺动脉高压(HPH)的相互关系。方法：对缺氧组(H组)及正常对照组(C组)大鼠，用免疫组织化学方法观察ET-1在肺组织内的表达及分布，并采用放射免疫方法测定大鼠血浆中ET-1的含量。结果：C组大鼠肺组织仅大血管及支气管有少量ET-1阳性物质表达，H组ET-1阳性表达不仅可见于大血管内皮、平滑肌，而且存在于小血管内皮、平滑肌及支气管平滑肌中；血浆ET-1含量在H组较C组明显升高(P<0.05)，但各H组之间ET-1含量无明显差异性(P>0.05)；H组大鼠右心室较C组明显肥大。结论：缺氧可促进肺血管内皮和平滑肌合成释放ET-1量增加，并导致血浆内ET-1含量的升高，由此影响HPH的发生和发展。
, 百拇医药
分类号 R544；R392.11 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0230-03
An experimental study on the change of endothelin and its significance in hypoxic pulmonary hypertension
Liang Yanjie, Li Guohong, Lu Jiangyang et al
(Dept of Pathol, 304th Hospital of PLA, Beijing 100037)
ABSTRACT Purpose To study the effects of Endothelin-1(ET-1) in hypoxic pulmonary hypertension (HPH) and its relationship with HPH. Methods Immunohistochemical staining and radio-immunological method were used to detect the expression of ET-1 in lung tissue and the content of ET-1 in plasma of the rats. Results In normoxia group, weak expression of ET-1 was located in the endothelium and smooth muscle of pulmonary blood vessels and in the epithelium and smooth muscle of bronchi. But in hypoxic group, intensive expression of ET-1 in above positions. The content of ET-1 in plasma was increased obviously after hypoxia. Conclusion Hypoxia may promate synthesis and release of ET-1, and elevate the content of ET-1 in plasma, so that the ET-1 have certainly influence on HPH.
, 百拇医药
KEY WORDS hypertension, pulmonary; endothelins; immunohistochemistry; anoxia
缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)时血浆中内皮素(endothelin, ET)的变化已有文献报道〔1〕。我科对大鼠缺氧性肺动脉高压时肺动脉的变化也曾进行过研究〔2〕。现在我们对大鼠HPH模型，用免疫组织化学方法观察ET-1在正常和缺氧大鼠肺组织中的表达与分布，并用放免法测定缺氧时血浆中ET-1的含量变化，同时测定其右心室肥大指数，与正常对照组做比较，探讨ET-1在缺氧性肺动脉高压(HPH)发病中的意义。
1 材料和方法
1.1 动物模型复制 纯种雌性Wistar大鼠60只(购自中国医学科学院动物中心)平均体重209.54±11.39 g，随机分为正常对照组(C组，12只)及缺氧组(H组，48只)。缺氧组大鼠分别置于常压低氧舱内，持续缺氧1、2、3、5周(H-1，H-2，H-3，H-5，各12只)，舱内氧浓度维持在10%±1%的范围之内，用标准固体食料，自由进食及饮水。对照组则于正常氧浓度的环境中自由进食和饮水。
, http://www.100md.com
1.2 ET-1免疫组化检测(ABC法) 肺经气管原位灌注(4%多聚甲醛-0.1mol。L-1磷酸缓冲液)，在左、右肺各叶近肺门处取材，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片。一抗为兔抗ET-1，稀释度1∶2 000(瑞典产品，第四军医大学病理教研室李青教授惠赠)。二抗为生物素化羊抗兔IgG 1∶150(美国Vector Laboratories Inc产品)；三抗为Streptavidin-HRP复合物1∶150(美国Zymed Laboratories Inc产品)；DAB显色。以PBS液和非免疫的正常兔血清代替第一抗体进行免疫染色作为阴性对照。
免疫染色切片肺动脉及支气管计数：每组10例，每例每张切片在100倍镜下计数4～5个肺动脉及支气管。
1.3 血浆ET-1放射免疫测定 称大鼠体重(BW)后用20%乌拉坦(按1.5～2 g。kg-1体重)腹腔注射麻醉，剖腹抽取主动脉血2 ml，立即放入预冷的含有10%EDTA 30 μl和抑肽酶40 μl的试管中混匀，随即4℃，3000 r。min-1离心20 min，抽出血浆，置于-80℃冰箱中冰冻保存，用放射免疫直接测定法测定〔3〕。
, 百拇医药
1.4 心室肥大指数测定 于心脏房室间沟处剪去两心房及大血管，然后沿室间隔右心室边缘剪离右心室，用分析天平，分别称量右心室(Rv,mg)及左心室加室间隔(Lv+S,mg)的重量；并由此计算右心室与体重的比(Rv/BW, mg/g)、左心室+室间隔与体重的比(Lv+S/BW, mg/g)和右心室肥大指数(Rv/Lv+S, mg/mg)。右心室肥大指数>0.33者判为右心室肥大。
1.5 统计学处理 以上计量指标均以均数±标准差
±s表示。
2 结果
2.1 ET-1免疫组织化学染色 C组：肺内动脉直径大于200 μm(Ⅰ级血管)者，其内皮及平滑肌ET-1呈弱阳性表达，但内皮较平滑肌稍明显；直径小于200 μm(Ⅱ级血管)者，其内皮和平滑肌ET-1呈阴性表达。各级支气管粘膜上皮及平滑肌均呈弱阳性。H组：肺动脉无论其直径大小，内皮和平滑肌ET-1阳性表达均较C组增强，且自H-1至H-5组，阳性表达有递增趋势；支气管粘膜上皮细胞及平滑肌细胞虽呈ET-1阳性表达，但无增强趋势。对照组和各缺氧组肺组织的ET-1免疫染色结果见表1。
, 百拇医药
表1 各组肺组织内ET-1的表达与定位分布 部 位
C
H-1
H-2
H-3
H-5
肺血管内皮Ⅰ级血管
+
+
+～
+～
, 百拇医药
+～
Ⅱ级血管
-
±
+
+
+
平滑肌细胞Ⅰ级血管
+
+
+～～
, 百拇医药
Ⅱ级血管
-
±
+
+
+
支气管
±
+
+
+
+
支气管粘膜上皮
±
, 百拇医药
+
+
+
+
+～：阳性表达及强度；-：阴性表达；±：弱阳性表达2.2 血浆ET-1的动态变化 缺氧各组血浆ET-1含量均显著高于对照组(P<0.05)，但各缺氧组之间无显著性差异(P>0.05，表2)。
表2 各组血浆ET-1的动态变化 组别
血浆(ng。L-1)
C
, http://www.100md.com 126.34±32.90
H-1
170.65±29.25*
H-2
202.15±38.44*
H-3
193.96±45.73*
H-5
189.27±40.03*
各缺氧组与对照组相比，*P<0.052.3 心室肥大指数 缺氧各组右心室的相对重量均明显高于对照组，H-5组与H-1组相比显著差异(P<0.05)，但H-5、H-3与H-2之间显著性差异(P>0.05)。右心室重量增加表明右心室因HPH而发生肥大。
, http://www.100md.com
表3 各组心室肥大指数 组别
Rv/BW
Lv+S/BW
Rv/Lv+S
C
0.493±0.07
2.098±0.246
0.236±0.034
H-1
0.955±0.12*
2.570±0.287
0.375±0.053*
, 百拇医药
H-2
1.076±0.17*
2.596±0.376
0.419±0.073*
H-3
1.093±0.07*
2.592±0.142
0.420±0.033*
H-5
1.173±0.22*
, http://www.100md.com 2.466±0.301
0.485±0.062*
H组与C组相比，*P<0.053 讨论
肺是内皮素(ET)合成代谢的重要器官之一。肺内不仅能合成ET，而且还有ET的受体，它们广布于肺血管内皮、支气管粘膜上皮以及平滑肌细胞(包括血管及支气管平滑肌)。ET有ET-1、2、3三种，其中ET-1是肺内主要的组成成分，其具有强烈的缩血管作用及促进平滑肌和成纤维细胞分裂作用〔4〕。此种缩血管物质(ET-1)与舒血管物质(如NO)维持动态平衡则保持正常的肺动脉压，失去平衡则肺动脉压不能保持正常状态。因此，研究缺氧状态下ET含量的变化对探讨肺动脉高压的发生、发展有重要意义。
本研究对缺氧性肺动脉高压模型，经免疫组化及放免法检测肺组织内及血浆中ET-1的含量，结果证明，缺氧状态下肺组织内及血浆中ET-1的阳性表达及含量均增高，这提示缺氧性肺动脉高压与ET-1之间有密切关系。以往对内皮素与缺氧性肺动脉高压关系的研究，主要是检测血浆或肺组织匀浆ET的含量变化〔1〕，而我们除检测血浆中ET-1的含量外，尚用免疫组化法检测了ET-1在肺内的定位分布。本实验免疫组化证明缺氧时ET-1的阳性表达较对照组增强，且主要在肺血管内皮细胞，而支气管粘膜上皮和血管与支气管的平滑肌也较对照组表达也增强。这表明缺氧时肺组织血管内皮等部位ET-1的合成增加。至于血浆中ET-1含量增加的解释，Kourembanas等认为缺氧是种刺激，肺血管内皮等受到刺激后合成ET-1与释放功能增加〔5〕；Yoshibayashi等〔6〕则认为缺氧时肺组织对ET的清除能力下降，致使血浆中ET含量增加。
, http://www.100md.com
关于ET-1含量增高与HPH的关系，除与ET-1含量增高使血管持续收缩的作用有关以外，还与ET-1促进平滑肌细胞及成纤维细胞增生使肺血管壁变厚、管腔变小、阻力增高有关。Dicado等〔7〕对缺氧2周大鼠给予ET-1受体特异性拮抗剂BQ-123则能逆转HPH的发生与发展。
此外，本实验心室肥大指数的测定显示各缺氧组右心室相对重量均明显高于对照组(P<0.05)，表明缺氧后形成了缺氧性肺动脉高压。
作者简介：梁延杰，男，71岁，教授，主任医师，硕士生导师
参考文献
1，陈 霞，黄丽英，曾 强等.缺氧性肺动脉高压大鼠内皮素的变化. 中华医学杂志，1993；73(7)：400～402
2，朱 涌，梁延杰，杨建法等.常压缺氧下大鼠肺动脉的变化.中华病理学杂志，1996；25(1)：44～45
, http://www.100md.com
3，曾 强，李振甲，余霞君等.内皮素的放射免疫分析.解放军医学杂志，1991；16(6)：403～406
4，王 涛，罗文侗.内皮素对细胞增殖的调节.国外医学生理、病理科学与临床分册，1995；15(2)：94～96
5，Kourembanas S, Phllip AM, Lynda PM et al. Hypoxia induces endothelin gene expression and secretion in cultured human endothelium. J Clin Invest, 1991;88:1054～1057
6，Yoshibayashi M, Nishioka K, Nakoo K et al. Plasma endothelin comcentnation in pationts with pulmonary hypertension associated with congenital heart defects: evidence for increased production of endothelin in pulmonary circulation. Circulation, 1991;84:2280～2285
7，Dicarlo VS, Chen ST, Meng QC et al. ET-A receptor antagonist prevent and reverse chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol, 1995;269:L690～L697
收稿日期：1998-09-02, http://www.100md.com
单位：梁延杰 李国红 陆江阳 王晓虹 杨毅 佟欣(解放军三○四医院病理科，北京 100037)
关键词：高血压；肺性；内皮缩血管肽类；免疫组织化学；低氧
临床与实验病理学杂志990315摘要 目的：探讨内皮素-1(ET-1)与缺氧性肺动脉高压(HPH)的相互关系。方法：对缺氧组(H组)及正常对照组(C组)大鼠，用免疫组织化学方法观察ET-1在肺组织内的表达及分布，并采用放射免疫方法测定大鼠血浆中ET-1的含量。结果：C组大鼠肺组织仅大血管及支气管有少量ET-1阳性物质表达，H组ET-1阳性表达不仅可见于大血管内皮、平滑肌，而且存在于小血管内皮、平滑肌及支气管平滑肌中；血浆ET-1含量在H组较C组明显升高(P<0.05)，但各H组之间ET-1含量无明显差异性(P>0.05)；H组大鼠右心室较C组明显肥大。结论：缺氧可促进肺血管内皮和平滑肌合成释放ET-1量增加，并导致血浆内ET-1含量的升高，由此影响HPH的发生和发展。
, 百拇医药
分类号 R544；R392.11 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0230-03
An experimental study on the change of endothelin and its significance in hypoxic pulmonary hypertension
Liang Yanjie, Li Guohong, Lu Jiangyang et al
(Dept of Pathol, 304th Hospital of PLA, Beijing 100037)
ABSTRACT Purpose To study the effects of Endothelin-1(ET-1) in hypoxic pulmonary hypertension (HPH) and its relationship with HPH. Methods Immunohistochemical staining and radio-immunological method were used to detect the expression of ET-1 in lung tissue and the content of ET-1 in plasma of the rats. Results In normoxia group, weak expression of ET-1 was located in the endothelium and smooth muscle of pulmonary blood vessels and in the epithelium and smooth muscle of bronchi. But in hypoxic group, intensive expression of ET-1 in above positions. The content of ET-1 in plasma was increased obviously after hypoxia. Conclusion Hypoxia may promate synthesis and release of ET-1, and elevate the content of ET-1 in plasma, so that the ET-1 have certainly influence on HPH.
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KEY WORDS hypertension, pulmonary; endothelins; immunohistochemistry; anoxia
缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)时血浆中内皮素(endothelin, ET)的变化已有文献报道〔1〕。我科对大鼠缺氧性肺动脉高压时肺动脉的变化也曾进行过研究〔2〕。现在我们对大鼠HPH模型，用免疫组织化学方法观察ET-1在正常和缺氧大鼠肺组织中的表达与分布，并用放免法测定缺氧时血浆中ET-1的含量变化，同时测定其右心室肥大指数，与正常对照组做比较，探讨ET-1在缺氧性肺动脉高压(HPH)发病中的意义。
1 材料和方法
1.1 动物模型复制 纯种雌性Wistar大鼠60只(购自中国医学科学院动物中心)平均体重209.54±11.39 g，随机分为正常对照组(C组，12只)及缺氧组(H组，48只)。缺氧组大鼠分别置于常压低氧舱内，持续缺氧1、2、3、5周(H-1，H-2，H-3，H-5，各12只)，舱内氧浓度维持在10%±1%的范围之内，用标准固体食料，自由进食及饮水。对照组则于正常氧浓度的环境中自由进食和饮水。
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1.2 ET-1免疫组化检测(ABC法) 肺经气管原位灌注(4%多聚甲醛-0.1mol。L-1磷酸缓冲液)，在左、右肺各叶近肺门处取材，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片。一抗为兔抗ET-1，稀释度1∶2 000(瑞典产品，第四军医大学病理教研室李青教授惠赠)。二抗为生物素化羊抗兔IgG 1∶150(美国Vector Laboratories Inc产品)；三抗为Streptavidin-HRP复合物1∶150(美国Zymed Laboratories Inc产品)；DAB显色。以PBS液和非免疫的正常兔血清代替第一抗体进行免疫染色作为阴性对照。
免疫染色切片肺动脉及支气管计数：每组10例，每例每张切片在100倍镜下计数4～5个肺动脉及支气管。
1.3 血浆ET-1放射免疫测定 称大鼠体重(BW)后用20%乌拉坦(按1.5～2 g。kg-1体重)腹腔注射麻醉，剖腹抽取主动脉血2 ml，立即放入预冷的含有10%EDTA 30 μl和抑肽酶40 μl的试管中混匀，随即4℃，3000 r。min-1离心20 min，抽出血浆，置于-80℃冰箱中冰冻保存，用放射免疫直接测定法测定〔3〕。
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1.4 心室肥大指数测定 于心脏房室间沟处剪去两心房及大血管，然后沿室间隔右心室边缘剪离右心室，用分析天平，分别称量右心室(Rv,mg)及左心室加室间隔(Lv+S,mg)的重量；并由此计算右心室与体重的比(Rv/BW, mg/g)、左心室+室间隔与体重的比(Lv+S/BW, mg/g)和右心室肥大指数(Rv/Lv+S, mg/mg)。右心室肥大指数>0.33者判为右心室肥大。
1.5 统计学处理 以上计量指标均以均数±标准差
±s表示。2 结果
2.1 ET-1免疫组织化学染色 C组：肺内动脉直径大于200 μm(Ⅰ级血管)者，其内皮及平滑肌ET-1呈弱阳性表达，但内皮较平滑肌稍明显；直径小于200 μm(Ⅱ级血管)者，其内皮和平滑肌ET-1呈阴性表达。各级支气管粘膜上皮及平滑肌均呈弱阳性。H组：肺动脉无论其直径大小，内皮和平滑肌ET-1阳性表达均较C组增强，且自H-1至H-5组，阳性表达有递增趋势；支气管粘膜上皮细胞及平滑肌细胞虽呈ET-1阳性表达，但无增强趋势。对照组和各缺氧组肺组织的ET-1免疫染色结果见表1。
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表1 各组肺组织内ET-1的表达与定位分布 部 位
C
H-1
H-2
H-3
H-5
肺血管内皮Ⅰ级血管
+
+
+～
+～
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Ⅱ级血管
-
±
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平滑肌细胞Ⅰ级血管
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～, 百拇医药
Ⅱ级血管
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支气管
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支气管粘膜上皮
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：阳性表达及强度；-：阴性表达；±：弱阳性表达2.2 血浆ET-1的动态变化 缺氧各组血浆ET-1含量均显著高于对照组(P<0.05)，但各缺氧组之间无显著性差异(P>0.05，表2)。表2 各组血浆ET-1的动态变化 组别
血浆(ng。L-1)
C
, http://www.100md.com 126.34±32.90
H-1
170.65±29.25*
H-2
202.15±38.44*
H-3
193.96±45.73*
H-5
189.27±40.03*
各缺氧组与对照组相比，*P<0.052.3 心室肥大指数 缺氧各组右心室的相对重量均明显高于对照组，H-5组与H-1组相比显著差异(P<0.05)，但H-5、H-3与H-2之间显著性差异(P>0.05)。右心室重量增加表明右心室因HPH而发生肥大。
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表3 各组心室肥大指数 组别
Rv/BW
Lv+S/BW
Rv/Lv+S
C
0.493±0.07
2.098±0.246
0.236±0.034
H-1
0.955±0.12*
2.570±0.287
0.375±0.053*
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H-2
1.076±0.17*
2.596±0.376
0.419±0.073*
H-3
1.093±0.07*
2.592±0.142
0.420±0.033*
H-5
1.173±0.22*
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0.485±0.062*
H组与C组相比，*P<0.053 讨论
肺是内皮素(ET)合成代谢的重要器官之一。肺内不仅能合成ET，而且还有ET的受体，它们广布于肺血管内皮、支气管粘膜上皮以及平滑肌细胞(包括血管及支气管平滑肌)。ET有ET-1、2、3三种，其中ET-1是肺内主要的组成成分，其具有强烈的缩血管作用及促进平滑肌和成纤维细胞分裂作用〔4〕。此种缩血管物质(ET-1)与舒血管物质(如NO)维持动态平衡则保持正常的肺动脉压，失去平衡则肺动脉压不能保持正常状态。因此，研究缺氧状态下ET含量的变化对探讨肺动脉高压的发生、发展有重要意义。
本研究对缺氧性肺动脉高压模型，经免疫组化及放免法检测肺组织内及血浆中ET-1的含量，结果证明，缺氧状态下肺组织内及血浆中ET-1的阳性表达及含量均增高，这提示缺氧性肺动脉高压与ET-1之间有密切关系。以往对内皮素与缺氧性肺动脉高压关系的研究，主要是检测血浆或肺组织匀浆ET的含量变化〔1〕，而我们除检测血浆中ET-1的含量外，尚用免疫组化法检测了ET-1在肺内的定位分布。本实验免疫组化证明缺氧时ET-1的阳性表达较对照组增强，且主要在肺血管内皮细胞，而支气管粘膜上皮和血管与支气管的平滑肌也较对照组表达也增强。这表明缺氧时肺组织血管内皮等部位ET-1的合成增加。至于血浆中ET-1含量增加的解释，Kourembanas等认为缺氧是种刺激，肺血管内皮等受到刺激后合成ET-1与释放功能增加〔5〕；Yoshibayashi等〔6〕则认为缺氧时肺组织对ET的清除能力下降，致使血浆中ET含量增加。
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关于ET-1含量增高与HPH的关系，除与ET-1含量增高使血管持续收缩的作用有关以外，还与ET-1促进平滑肌细胞及成纤维细胞增生使肺血管壁变厚、管腔变小、阻力增高有关。Dicado等〔7〕对缺氧2周大鼠给予ET-1受体特异性拮抗剂BQ-123则能逆转HPH的发生与发展。
此外，本实验心室肥大指数的测定显示各缺氧组右心室相对重量均明显高于对照组(P<0.05)，表明缺氧后形成了缺氧性肺动脉高压。
作者简介：梁延杰，男，71岁，教授，主任医师，硕士生导师
参考文献
1，陈 霞，黄丽英，曾 强等.缺氧性肺动脉高压大鼠内皮素的变化. 中华医学杂志，1993；73(7)：400～402
2，朱 涌，梁延杰，杨建法等.常压缺氧下大鼠肺动脉的变化.中华病理学杂志，1996；25(1)：44～45
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3，曾 强，李振甲，余霞君等.内皮素的放射免疫分析.解放军医学杂志，1991；16(6)：403～406
4，王 涛，罗文侗.内皮素对细胞增殖的调节.国外医学生理、病理科学与临床分册，1995；15(2)：94～96
5，Kourembanas S, Phllip AM, Lynda PM et al. Hypoxia induces endothelin gene expression and secretion in cultured human endothelium. J Clin Invest, 1991;88:1054～1057
6，Yoshibayashi M, Nishioka K, Nakoo K et al. Plasma endothelin comcentnation in pationts with pulmonary hypertension associated with congenital heart defects: evidence for increased production of endothelin in pulmonary circulation. Circulation, 1991;84:2280～2285
7，Dicarlo VS, Chen ST, Meng QC et al. ET-A receptor antagonist prevent and reverse chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol, 1995;269:L690～L697
收稿日期：1998-09-02, http://www.100md.com