实验性肝癌癌组织的发生和甲胎蛋白表达
作者：张继增
单位：张继增(兰州军区总医院病理科，兰州 730050)
关键词：肝肿瘤；试验性；增生；甲胎蛋白类；大鼠
临床与实验病理学杂志990313摘要 目的：研究实验性肝癌的组织发生过程中甲胎蛋白的表达，旨在为肝癌诊断奠定形态学基础。方法：Wistar大白鼠喂0.04% 3′-Me-DAB不同日程处死，36周处死完，观察动力形态变化和免疫组化AFP表达。结果：实验早期卵圆细胞增生，该细胞是多向分化的干细胞。它进一步分化成过渡细胞、胚胎性小肝细胞，后者可呈不典型增生，它们散在或群集，这些细胞AFP强阳性，群集不典型增生的小肝细胞形态上不同于肝细胞增生结节，前者和肝细胞癌形态相似。卵圆细胞向胆管分化形成纤维腺瘤样增生，其上皮细胞也见不典型增生。58只实验动物生成26例肝癌，其中肝细胞癌18例，混合癌8例，癌AFP强阳性，其周围宿主肝细胞和实验晚期无癌动物的肝细胞也见程度不同的AFP阳性表达。结论：小肝细胞和胆管上皮细胞的不典型增生是肝细胞癌和胆管癌的癌前病变。
, 百拇医药
分类号 R735.7 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0224-03
Carcinohistogenesis and expression of alpha fetoprotein in experimental hepatocarcinoma
Zhang Jizeng
(Dept of Pathol, General Hospital of Lanzhou Military Area, Lanzhou 730050)
ABSTRACT Purpose To investigate the carcinohistogenesis of hepatocarcinoma and AFP expression in oncogenesis and to lay a morpholoogical foundation for diagnosing and curing hepatocarcinoma. Methods Wistar rats were fed on 0.04% 3′-Me-DAB and killed according to different dates. All the animals were killed during 36 weeks. The morphologic changes of dynamics and expression of alpha fetoprotein (AFP) were observed with immunohistochemical method. Results Hyperplasia of oval cells occurred in the early experimemtal stage and the oval cells were multipotential stem cell. They further differentiated into transitional cell and embryoid small liver cell, and the latter may form atypical hyperplasia, scattered or crowded. AFP in these cells appeared to be strongly positive expression. The feature was different between dysplastic small hepatocytes with crowd and proliferative nodules of hepatocytes. The former was similar to hepatocytic carcinoma morphologic ally. The oval cells differeatiated towards biliary duct to form fibroadenomatoid structure, and atypical hyperplasia was seen in their epithelial cells. 26 of 58 experimental animals were cases of hepatocarcinoma, among whom 18 cases of hepatocytic carcinoma and 8 mixed carcinoma were found. The hepatocellular carcinoma showed stuongly AFP positive expression. In the host hepatocytes around cancer and hepatocytes of non-neoplastic animals of later experimental period also appered to be various degrees of positive expression of the AFP. Conclusion The precancerosis of hepatocellular carcinoma and bile duct caricnoma is atypical hyperplasia of small hepatocytes and epithelial cells of bile canaliculi.
, 百拇医药
KEY WORDS liver neoplasms, experimental; hyperplasia; alpha-fetoproteins; rats
1973年Anthony等〔1〕在乌干达研究人的肝硬化和肝癌时首次提出肝细胞不典型增生是癌前病变。Roncalli等〔2〕又把不典型增生的肝细胞分成大细胞和小细胞，认为后者对肝细胞癌的生成关系密切。1988年徐元鼎等〔3〕认为肝细胞癌来自肝细胞的嗜碱性和嗜酸性增生结节。诚然，癌组织发生是很复杂的，特别是AFP在肝癌形成中的变化。AFP是确定细胞分化和肿瘤的标记物〔4〕。此外，以往对胆管癌的组织发生以及小胆管上皮细胞不典型增生与癌发生的相关形态描述也较欠缺。为探讨肝癌发生的动力形态学，笔者试图结合甲胎蛋白的变化对肝癌的组织发生进行深入研究。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
Wistar大白鼠喂0.04% 3’-Me-DAB混合食物，其只数与诱癌时间见表1。在相应时间里取2只正常动物肝存档蜡块做切片对照。肝标本系10%中性福尔马林固定。AFP免疫组化用ABC法。一抗为兔抗大鼠AFP 1∶400稀释；二抗是生物素标记的马抗兔IgG血清1∶200稀释；三抗为ABC-HRP(Horseradish Peroxidase)1∶100稀释，切片显色用0.04-H2O2 DAB溶液，苏木素轻淡衬染，常规制片。对照片用正常羊血清代一抗。AFP阳性颗粒呈褐色，均匀地位于胞浆内。在400倍光镜下随意转动10个视野在网格内数阳性细胞，以百分率计阳性强度：“
”示阳性细胞≥41%，分布广，深褐色强染；“+”示≤10%，稀落分布，浅褐弱染；“
”示介于二者之间；“-”示阴性。为鉴别诊断而进行了细胞角蛋白和上皮细胞膜抗原染色。
, 百拇医药
表1 58只实验性大白鼠在不同日程内诱发的肝脏病变 病 变
实验日程(周)
<4
5～12
13～20
21～28
29～36
卵圆细胞增生
4
4
1
—
—
, 百拇医药
过渡细胞增生
—
4
3
—
—
胚胎性小肝细胞增生
—
—
6
6
8
肝细胞不典型增生
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—
5
6
33
肝细胞增生灶或结节
—
—
5
5
20
肝假小叶
—
—
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4
6
38
小胆管纤维腺瘤样增生
—
—
4
6
38
肝癌
—
—
2
3
, http://www.100md.com
21
处死动物只数
4
4
6
6
38
表2 58例实验性大白鼠肝脏病变中AFP阳性表达 病 变
n
AFP
+
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-
阳性率(%)
过渡细胞
7
1
4
—
2
71.4
胚胎样小肝细胞
20
4
6
10
, 百拇医药
—
100.0
不典型增生的肝细胞
44
7
10
27
—
100.0
肝细胞增生灶或结节
30
—
11
, 百拇医药
19
—
100.0
假小叶内的肝细胞
48
15
10
16
7
85.4
小胆管纤维腺瘤样增生的
上皮细胞
48
, http://www.100md.com
3
4
2
39
18.7
癌细胞*
26
—
10
16
—
100.0
*仅见肝细胞癌2 结果
, 百拇医药
正常对照的肝切片无病变，AFP阴性。58只实验动物主要肝病变见表1，AFP阳性表达见表2。实验13周见肝细胞增生灶或结节。肝细胞坏死增生破坏肝小叶形成假小叶。在假小叶和增生结节内有不典型增生的肝细胞散在其中，该细胞体积有大有小。由过渡细胞而来的胚胎性小肝细胞偶见异型性。不典型增生的小肝细胞常群集，它们与增生结节不同，不向周围组织压迫性生长，与周围无明显的界限(图1)，AFP以反应居多(图2)。不典型增生肝细胞有大小之分。不典型增生的小肝细胞常和肝细胞癌毗邻，有时和肝细胞癌不易分辨，但后者癌索或实片之间有血窦。肝细胞癌AFP是～阳性反应(图3)。此外也见癌细胞索与“正常”肝细胞索直接相连。肝小叶破坏后也能见到残留的肝细胞不典型增生变成怪异状核的小肝细胞。不典型增生的大肝细胞体积巨大，常为AFP阴性反应，它们位于不典型增生的小肝细胞群中或其附近(图2)。
, 百拇医药
图1 不典型增生的小肝细胞(右中下方)和肝癌细胞(左下方).HE×100
图2 不典型增生的小肝细胞AFP(+++),而大肝细胞AFP(-).ABC×200
图3 肝癌细胞AFP(+++).ABC×400
小胆管呈纤维腺瘤样增生，该处卵圆细胞消失腺瘤样增生的小胆管上皮细胞可见粘液分泌空泡；有的小管扩张其上皮细胞扁平(图4)。增生活跃的小胆管上皮细胞排成多层，拥挤，核深染。有6例胆管上皮细胞呈不典型增生，与胆管癌难鉴别，核变大，胞核淡染，含明显的嗜酸性核仁，有较多的核分裂象，它们拥挤成多层，细胞AFP～(图5)，可见它们过渡到胆管癌的组织象，这种胆管大小不等和不规则的迂曲扩张形成腺泡，基底膜模糊或消失。腺泡浸润于非常丰富的结缔组织中，有时和腺样肝细胞癌相间存在，胆管癌管腔内含粘液，细胞膜抗原和细胞角蛋白染色呈阳性反应，AFP染色呈阴性；腺样结构的肝细胞癌AFP阳性反应。
, 百拇医药
图4 小胆管的纤维腺瘤样增生.HE×200
图5 小胆管的不典型增生,AFP(++～+++).ABC×200
26例肝癌中肝细胞癌18例；混合癌8例。癌周肝细胞有不同程度的AFP阳性反应。实验晚期无癌动物的肝细胞亦呈不同程度的AFP阳性反应(图6)。
图6 无癌动物和肝细胞AFP(+～++).ABC×400
3 讨论
不典型增生小肝细胞应看作肝细胞癌的癌前细胞。它们散在于肝小叶，小叶破坏后的残留肝细胞也可形成，因近似胚胎早期的肝细胞故AFP强阳性反应。不典型增生的小肝细胞群和肝细胞增生结节不同，周围无压迫性境界。它们常和肝细胞癌相邻，有时两者也难以辨认，但后者瘤细胞索形成，其间存有血窦。综上所述，不典型增生在动力形态的改变过程中有自己的演变过程、形态特点和存在形成。
, 百拇医药
戴益民等〔5〕研究了人体肝癌癌周宿主肝细胞自己合成AFP。本研究中除肝细胞癌有AFP阳性表达外，在实验晚期无癌动物的肝细胞也有程度不同的AFP阳性表达。显然，这些细胞在致癌因子的作用下虽无形态上的异型性，但功能上已有返祖改变而处于胚胎状态，出现了AFP阳性表达。肝细胞癌相连的“正常”肝细胞索，可视为返祖功能改变的肝细胞被致癌因子启动失分化后形成的癌突变。实验晚期无癌动物的肝细胞AFP阳性为临床非肝癌病人血清AFP水平的增高或提示癌突变的可能性提供了实验依据。
众所周知，肝细胞和胆管细胞来源于同一胚芽。在实验性肝癌中Dempo〔6〕和Hixson等〔7〕指出卵圆细胞是胚胎性多潜能分化的干细胞，不言而喻，它既可生成肝细胞癌也可生成胆管癌和混合性肝癌。明显的小胆管纤维腺瘤样增生处卵圆细胞的消失与它向小胆管分化有关。不典型增生的小胆管上皮细胞在间变过程中返祖到与肝细胞同源的胚胎性质时即可出现AFP阳性表达，一旦这些细胞过渡到胆管癌时其本质已不是肝细胞，故AFP呈阴性反应，细胞角蛋白和上皮细胞膜抗原呈阳性反应，并以此同腺样结构的肝细胞癌鉴别。
, http://www.100md.com
作者简介：张继增，男，73岁，教授，主任医师。主要从事癌前病变的病理形态学研究
参考文献
1，Anthony PP, Vogel CL, Barker LF. Liver cell dysplasia. A premalignant condition. J Clin Pathology,1973;26(3):217～223
2，Roncalli M, Borzio M, Biagi GD et al. Liver cell dysplasia in cirrhosis serologic and immunhistochemical study. Cancer,1986;57(6):1515～1521
3，徐元鼎，张兆成，张金生等. 3′-Me-DAB诱发大鼠肝癌的实验病理研究. 中华病理学杂志，1998；17(2)：87～90
, 百拇医药
4，Khamzina L, Eraiser T, Borgeat P. Alpha fetoprotein (AFP) expression in clones of MCA-RH7777rat hepatoma: correlation with the occurrence of homogeneously staining regions on chromosome 14. Cancer Res,1995;55(16):3615～3622
5，戴益民，倪灿荣. 人体肝癌宿主肝细胞甲胎蛋白来源的初步探讨(附48例免疫组化分析). 中华病理学杂志，1988；17(4)：247～250
6，Dempo K, Shisak N, Yoshida Y et al. Immunofluorescent study on a-Fetoprotrin producing cell in the early stage of 3-Methyl-4dimethylaminoazobenzene. Cancer Res,1975;35(5):1282～1287
7，Hixson DC, Affigne S, Faris RA, McBride AC. Delineation of antigenic of ethionine induced liver cancer in the rat. Pathology,1996;64(2):79～90
收稿日期：1998-06-26, 百拇医药
单位：张继增(兰州军区总医院病理科，兰州 730050)
关键词：肝肿瘤；试验性；增生；甲胎蛋白类；大鼠
临床与实验病理学杂志990313摘要 目的：研究实验性肝癌的组织发生过程中甲胎蛋白的表达，旨在为肝癌诊断奠定形态学基础。方法：Wistar大白鼠喂0.04% 3′-Me-DAB不同日程处死，36周处死完，观察动力形态变化和免疫组化AFP表达。结果：实验早期卵圆细胞增生，该细胞是多向分化的干细胞。它进一步分化成过渡细胞、胚胎性小肝细胞，后者可呈不典型增生，它们散在或群集，这些细胞AFP强阳性，群集不典型增生的小肝细胞形态上不同于肝细胞增生结节，前者和肝细胞癌形态相似。卵圆细胞向胆管分化形成纤维腺瘤样增生，其上皮细胞也见不典型增生。58只实验动物生成26例肝癌，其中肝细胞癌18例，混合癌8例，癌AFP强阳性，其周围宿主肝细胞和实验晚期无癌动物的肝细胞也见程度不同的AFP阳性表达。结论：小肝细胞和胆管上皮细胞的不典型增生是肝细胞癌和胆管癌的癌前病变。
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分类号 R735.7 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0224-03
Carcinohistogenesis and expression of alpha fetoprotein in experimental hepatocarcinoma
Zhang Jizeng
(Dept of Pathol, General Hospital of Lanzhou Military Area, Lanzhou 730050)
ABSTRACT Purpose To investigate the carcinohistogenesis of hepatocarcinoma and AFP expression in oncogenesis and to lay a morpholoogical foundation for diagnosing and curing hepatocarcinoma. Methods Wistar rats were fed on 0.04% 3′-Me-DAB and killed according to different dates. All the animals were killed during 36 weeks. The morphologic changes of dynamics and expression of alpha fetoprotein (AFP) were observed with immunohistochemical method. Results Hyperplasia of oval cells occurred in the early experimemtal stage and the oval cells were multipotential stem cell. They further differentiated into transitional cell and embryoid small liver cell, and the latter may form atypical hyperplasia, scattered or crowded. AFP in these cells appeared to be strongly positive expression. The feature was different between dysplastic small hepatocytes with crowd and proliferative nodules of hepatocytes. The former was similar to hepatocytic carcinoma morphologic ally. The oval cells differeatiated towards biliary duct to form fibroadenomatoid structure, and atypical hyperplasia was seen in their epithelial cells. 26 of 58 experimental animals were cases of hepatocarcinoma, among whom 18 cases of hepatocytic carcinoma and 8 mixed carcinoma were found. The hepatocellular carcinoma showed stuongly AFP positive expression. In the host hepatocytes around cancer and hepatocytes of non-neoplastic animals of later experimental period also appered to be various degrees of positive expression of the AFP. Conclusion The precancerosis of hepatocellular carcinoma and bile duct caricnoma is atypical hyperplasia of small hepatocytes and epithelial cells of bile canaliculi.
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KEY WORDS liver neoplasms, experimental; hyperplasia; alpha-fetoproteins; rats
1973年Anthony等〔1〕在乌干达研究人的肝硬化和肝癌时首次提出肝细胞不典型增生是癌前病变。Roncalli等〔2〕又把不典型增生的肝细胞分成大细胞和小细胞，认为后者对肝细胞癌的生成关系密切。1988年徐元鼎等〔3〕认为肝细胞癌来自肝细胞的嗜碱性和嗜酸性增生结节。诚然，癌组织发生是很复杂的，特别是AFP在肝癌形成中的变化。AFP是确定细胞分化和肿瘤的标记物〔4〕。此外，以往对胆管癌的组织发生以及小胆管上皮细胞不典型增生与癌发生的相关形态描述也较欠缺。为探讨肝癌发生的动力形态学，笔者试图结合甲胎蛋白的变化对肝癌的组织发生进行深入研究。
1 材料与方法
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Wistar大白鼠喂0.04% 3’-Me-DAB混合食物，其只数与诱癌时间见表1。在相应时间里取2只正常动物肝存档蜡块做切片对照。肝标本系10%中性福尔马林固定。AFP免疫组化用ABC法。一抗为兔抗大鼠AFP 1∶400稀释；二抗是生物素标记的马抗兔IgG血清1∶200稀释；三抗为ABC-HRP(Horseradish Peroxidase)1∶100稀释，切片显色用0.04-H2O2 DAB溶液，苏木素轻淡衬染，常规制片。对照片用正常羊血清代一抗。AFP阳性颗粒呈褐色，均匀地位于胞浆内。在400倍光镜下随意转动10个视野在网格内数阳性细胞，以百分率计阳性强度：“
”示阳性细胞≥41%，分布广，深褐色强染；“+”示≤10%，稀落分布，浅褐弱染；“”示介于二者之间；“-”示阴性。为鉴别诊断而进行了细胞角蛋白和上皮细胞膜抗原染色。, 百拇医药
表1 58只实验性大白鼠在不同日程内诱发的肝脏病变 病 变
实验日程(周)
<4
5～12
13～20
21～28
29～36
卵圆细胞增生
4
4
1
—
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过渡细胞增生
—
4
3
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—
胚胎性小肝细胞增生
—
—
6
6
8
肝细胞不典型增生
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5
6
33
肝细胞增生灶或结节
—
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5
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20
肝假小叶
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4
6
38
小胆管纤维腺瘤样增生
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—
4
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38
肝癌
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2
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21
处死动物只数
4
4
6
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38
表2 58例实验性大白鼠肝脏病变中AFP阳性表达 病 变
n
AFP
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阳性率(%)
过渡细胞
7
1
4
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2
71.4
胚胎样小肝细胞
20
4
6
10
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100.0
不典型增生的肝细胞
44
7
10
27
—
100.0
肝细胞增生灶或结节
30
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11
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19
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100.0
假小叶内的肝细胞
48
15
10
16
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85.4
小胆管纤维腺瘤样增生的
上皮细胞
48
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3
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18.7
癌细胞*
26
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10
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100.0
*仅见肝细胞癌2 结果
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正常对照的肝切片无病变，AFP阴性。58只实验动物主要肝病变见表1，AFP阳性表达见表2。实验13周见肝细胞增生灶或结节。肝细胞坏死增生破坏肝小叶形成假小叶。在假小叶和增生结节内有不典型增生的肝细胞散在其中，该细胞体积有大有小。由过渡细胞而来的胚胎性小肝细胞偶见异型性。不典型增生的小肝细胞常群集，它们与增生结节不同，不向周围组织压迫性生长，与周围无明显的界限(图1)，AFP以
反应居多(图2)。不典型增生肝细胞有大小之分。不典型增生的小肝细胞常和肝细胞癌毗邻，有时和肝细胞癌不易分辨，但后者癌索或实片之间有血窦。肝细胞癌AFP是～阳性反应(图3)。此外也见癌细胞索与“正常”肝细胞索直接相连。肝小叶破坏后也能见到残留的肝细胞不典型增生变成怪异状核的小肝细胞。不典型增生的大肝细胞体积巨大，常为AFP阴性反应，它们位于不典型增生的小肝细胞群中或其附近(图2)。, 百拇医药
图1 不典型增生的小肝细胞(右中下方)和肝癌细胞(左下方).HE×100
图2 不典型增生的小肝细胞AFP(+++),而大肝细胞AFP(-).ABC×200
图3 肝癌细胞AFP(+++).ABC×400
小胆管呈纤维腺瘤样增生，该处卵圆细胞消失腺瘤样增生的小胆管上皮细胞可见粘液分泌空泡；有的小管扩张其上皮细胞扁平(图4)。增生活跃的小胆管上皮细胞排成多层，拥挤，核深染。有6例胆管上皮细胞呈不典型增生，与胆管癌难鉴别，核变大，胞核淡染，含明显的嗜酸性核仁，有较多的核分裂象，它们拥挤成多层，细胞AFP
～(图5)，可见它们过渡到胆管癌的组织象，这种胆管大小不等和不规则的迂曲扩张形成腺泡，基底膜模糊或消失。腺泡浸润于非常丰富的结缔组织中，有时和腺样肝细胞癌相间存在，胆管癌管腔内含粘液，细胞膜抗原和细胞角蛋白染色呈阳性反应，AFP染色呈阴性；腺样结构的肝细胞癌AFP阳性反应。, 百拇医药
图4 小胆管的纤维腺瘤样增生.HE×200
图5 小胆管的不典型增生,AFP(++～+++).ABC×200
26例肝癌中肝细胞癌18例；混合癌8例。癌周肝细胞有不同程度的AFP阳性反应。实验晚期无癌动物的肝细胞亦呈不同程度的AFP阳性反应(图6)。
图6 无癌动物和肝细胞AFP(+～++).ABC×400
3 讨论
不典型增生小肝细胞应看作肝细胞癌的癌前细胞。它们散在于肝小叶，小叶破坏后的残留肝细胞也可形成，因近似胚胎早期的肝细胞故AFP强阳性反应。不典型增生的小肝细胞群和肝细胞增生结节不同，周围无压迫性境界。它们常和肝细胞癌相邻，有时两者也难以辨认，但后者瘤细胞索形成，其间存有血窦。综上所述，不典型增生在动力形态的改变过程中有自己的演变过程、形态特点和存在形成。
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戴益民等〔5〕研究了人体肝癌癌周宿主肝细胞自己合成AFP。本研究中除肝细胞癌有AFP阳性表达外，在实验晚期无癌动物的肝细胞也有程度不同的AFP阳性表达。显然，这些细胞在致癌因子的作用下虽无形态上的异型性，但功能上已有返祖改变而处于胚胎状态，出现了AFP阳性表达。肝细胞癌相连的“正常”肝细胞索，可视为返祖功能改变的肝细胞被致癌因子启动失分化后形成的癌突变。实验晚期无癌动物的肝细胞AFP阳性为临床非肝癌病人血清AFP水平的增高或提示癌突变的可能性提供了实验依据。
众所周知，肝细胞和胆管细胞来源于同一胚芽。在实验性肝癌中Dempo〔6〕和Hixson等〔7〕指出卵圆细胞是胚胎性多潜能分化的干细胞，不言而喻，它既可生成肝细胞癌也可生成胆管癌和混合性肝癌。明显的小胆管纤维腺瘤样增生处卵圆细胞的消失与它向小胆管分化有关。不典型增生的小胆管上皮细胞在间变过程中返祖到与肝细胞同源的胚胎性质时即可出现AFP阳性表达，一旦这些细胞过渡到胆管癌时其本质已不是肝细胞，故AFP呈阴性反应，细胞角蛋白和上皮细胞膜抗原呈阳性反应，并以此同腺样结构的肝细胞癌鉴别。
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作者简介：张继增，男，73岁，教授，主任医师。主要从事癌前病变的病理形态学研究
参考文献
1，Anthony PP, Vogel CL, Barker LF. Liver cell dysplasia. A premalignant condition. J Clin Pathology,1973;26(3):217～223
2，Roncalli M, Borzio M, Biagi GD et al. Liver cell dysplasia in cirrhosis serologic and immunhistochemical study. Cancer,1986;57(6):1515～1521
3，徐元鼎，张兆成，张金生等. 3′-Me-DAB诱发大鼠肝癌的实验病理研究. 中华病理学杂志，1998；17(2)：87～90
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4，Khamzina L, Eraiser T, Borgeat P. Alpha fetoprotein (AFP) expression in clones of MCA-RH7777rat hepatoma: correlation with the occurrence of homogeneously staining regions on chromosome 14. Cancer Res,1995;55(16):3615～3622
5，戴益民，倪灿荣. 人体肝癌宿主肝细胞甲胎蛋白来源的初步探讨(附48例免疫组化分析). 中华病理学杂志，1988；17(4)：247～250
6，Dempo K, Shisak N, Yoshida Y et al. Immunofluorescent study on a-Fetoprotrin producing cell in the early stage of 3-Methyl-4dimethylaminoazobenzene. Cancer Res,1975;35(5):1282～1287
7，Hixson DC, Affigne S, Faris RA, McBride AC. Delineation of antigenic of ethionine induced liver cancer in the rat. Pathology,1996;64(2):79～90
收稿日期：1998-06-26, 百拇医药