脂质体载体法转染成纤维细胞的最佳条件
作者：梁惠珍 谢举临 文剑明
单位：梁惠珍 谢举临 文剑明(中山医科大学病理学教研室，广州 510089)
关键词：脂质体；转染；Lipofectamine；成纤维细胞
临床与实验病理学杂志990336分类号 R394；R977.6 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0273-02
目前基因转染的方法有多种，其中磷酸钙-DNA沉淀法应用较为广泛，但其转化效率不高，且不太适用于悬浮细胞和原代细胞培养的上皮细胞的转化〔1〕。本文介绍的Lipofectamine是一种新的多阴离子转染脂质体，其独特的精胺基团强负电子头部可自发地与DNA形成复合物，因而具有很强的转染能力〔2〕。作者研究了影响成纤维细胞转染效率的相关因素，建立了较为满意的转染条件，为研究外源基因在成纤维细胞中的表达奠定基础。
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1 材料和方法
1.1 材料 细胞来源：人肺组织成纤维细胞。质粒：含al(2)型前胶原基因片断的重组质粒。主要试剂：Lipofectamine脂质体，遗传霉素G418，1640培养基，小牛血清。
1.2 方法〔3，4〕
1.2.1 将2×105个细胞接种于35 mm培养皿中，在37℃ CO2培养箱培养24～36 h，使细胞生成单层，处于生长对数期，细胞生长面积达培养皿的70%～80%融合。
1.2.2 在1.5 ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将2.0 μg质粒DNA溶于100 μl无血清培养液中；管B，将20 μl Lipofectamine溶于80 μl无血清培养液中。
, 百拇医药 1.2.3 将管A和管B混匀，室温下置45 min。
1.2.4 吸去细胞培养液，用无血清培养液洗涤细胞2次。
1.2.5 加1 ml无血清培养液至Lipofectamine-DNA混合物中轻轻混匀，再滴加至细胞培养皿内，然后加入1 ml无血清培养液。
1.2.6 在CO2培养箱培养10 h。
1.2.7 吸出转染液，加4 ml完全培养液继续培养16 h。
1.2.8 弃去培养液，更换浓度为400 mg。L-1的G418培养液继续培养。
1.2.9 8～10天后选择单个细胞集落进行亚克隆，扩大培养后再加大G418浓度到800 mg。L-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代，用于体外表达的研究。
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2 体会
经过观察使用上述转染的成纤维细胞8～10天内可见抗性克隆，在所实验的20瓶细胞中，每瓶均有50个以上的抗性克隆，这表明转染效率是满意的。综合以上结果，我们总结了几点提高转染效率的体会。
2.1 受体细胞的选择 实验所用的细胞必须是单层、生长旺盛、有足够活力的对数生长期细胞，而且细胞数量也直接影响转染效率，最好选择在70%～80%融合度为佳，细胞太少转染效率低，太多则易导致细胞间接触抑制而影响细胞DNA合成。
2.2 质粒DNA浓度的影响 不同的受体细胞对所需的DNA的最适剂量不同，有的作者认为10～20 μg转染效率最高，但因质粒DNA对细胞有明显的毒性，可影响细胞的生长，我们分别比较了2、10和15 μg的转染效率，结果2 μg的效率不比高剂量组低，且对细胞的生长影响也不大。
2.3 Lipofectamine-DNA的作用时间 一般说转染率随着Lipofectamine-DNA作用时间的加长而提高，但由于质粒DNA对细胞生长有影响，因而与细胞的作用时间需控制，孵育时间太短转染效率偏低，过长则影响细胞的活性，因此，经过筛选比较，我们认为10 h较为合适。
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2.4 G418浓度的影响 G418是一种氨基甙类抗生素，能影响80 s核糖体的功能和蛋白质合成，因而能杀死正常的真核细胞。但如将neo基因的编码序列克隆于真核细胞转录单位并使之有效表达，则转染后的细胞能耐受G418的作用，由于不同的细胞系对G418的选择浓度有较大的差异，经过筛选，我们认为400 mg。L-1较为合适。
2.5 G418加入时间的影响 G418是一种筛选抗生素，过早加入将明显影响细胞的活性，抑制单个转染细胞的克隆生长。过晚加入，未转染细胞的过渡生长则会抑制转染细胞的生长，我们认为转染后16 h加入G418较为合适。
总之，受体细胞、质粒DNA浓度及作用时间，G418浓度和加入时间，与转染效率关系密切，优化其中因素，将可大大提高转化效率，从而为进一步的研究工作奠定基础。
作者简介：梁惠珍，女，44岁，技师
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参考文献
1，萨姆布鲁克，EF弗里著.金冬雁译.分子克隆技术指南.北京：科学出版社，1992：21
2，Chen C, Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol, 1987;7(8):2745
3，鄂 征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1988：56
4，姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：152
收稿日期：1998-12-24, http://www.100md.com
单位：梁惠珍 谢举临 文剑明(中山医科大学病理学教研室，广州 510089)
关键词：脂质体；转染；Lipofectamine；成纤维细胞
临床与实验病理学杂志990336分类号 R394；R977.6 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0273-02
目前基因转染的方法有多种，其中磷酸钙-DNA沉淀法应用较为广泛，但其转化效率不高，且不太适用于悬浮细胞和原代细胞培养的上皮细胞的转化〔1〕。本文介绍的Lipofectamine是一种新的多阴离子转染脂质体，其独特的精胺基团强负电子头部可自发地与DNA形成复合物，因而具有很强的转染能力〔2〕。作者研究了影响成纤维细胞转染效率的相关因素，建立了较为满意的转染条件，为研究外源基因在成纤维细胞中的表达奠定基础。
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1 材料和方法
1.1 材料 细胞来源：人肺组织成纤维细胞。质粒：含al(2)型前胶原基因片断的重组质粒。主要试剂：Lipofectamine脂质体，遗传霉素G418，1640培养基，小牛血清。
1.2 方法〔3，4〕
1.2.1 将2×105个细胞接种于35 mm培养皿中，在37℃ CO2培养箱培养24～36 h，使细胞生成单层，处于生长对数期，细胞生长面积达培养皿的70%～80%融合。
1.2.2 在1.5 ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将2.0 μg质粒DNA溶于100 μl无血清培养液中；管B，将20 μl Lipofectamine溶于80 μl无血清培养液中。
, 百拇医药 1.2.3 将管A和管B混匀，室温下置45 min。
1.2.4 吸去细胞培养液，用无血清培养液洗涤细胞2次。
1.2.5 加1 ml无血清培养液至Lipofectamine-DNA混合物中轻轻混匀，再滴加至细胞培养皿内，然后加入1 ml无血清培养液。
1.2.6 在CO2培养箱培养10 h。
1.2.7 吸出转染液，加4 ml完全培养液继续培养16 h。
1.2.8 弃去培养液，更换浓度为400 mg。L-1的G418培养液继续培养。
1.2.9 8～10天后选择单个细胞集落进行亚克隆，扩大培养后再加大G418浓度到800 mg。L-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代，用于体外表达的研究。
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2 体会
经过观察使用上述转染的成纤维细胞8～10天内可见抗性克隆，在所实验的20瓶细胞中，每瓶均有50个以上的抗性克隆，这表明转染效率是满意的。综合以上结果，我们总结了几点提高转染效率的体会。
2.1 受体细胞的选择 实验所用的细胞必须是单层、生长旺盛、有足够活力的对数生长期细胞，而且细胞数量也直接影响转染效率，最好选择在70%～80%融合度为佳，细胞太少转染效率低，太多则易导致细胞间接触抑制而影响细胞DNA合成。
2.2 质粒DNA浓度的影响 不同的受体细胞对所需的DNA的最适剂量不同，有的作者认为10～20 μg转染效率最高，但因质粒DNA对细胞有明显的毒性，可影响细胞的生长，我们分别比较了2、10和15 μg的转染效率，结果2 μg的效率不比高剂量组低，且对细胞的生长影响也不大。
2.3 Lipofectamine-DNA的作用时间 一般说转染率随着Lipofectamine-DNA作用时间的加长而提高，但由于质粒DNA对细胞生长有影响，因而与细胞的作用时间需控制，孵育时间太短转染效率偏低，过长则影响细胞的活性，因此，经过筛选比较，我们认为10 h较为合适。
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2.4 G418浓度的影响 G418是一种氨基甙类抗生素，能影响80 s核糖体的功能和蛋白质合成，因而能杀死正常的真核细胞。但如将neo基因的编码序列克隆于真核细胞转录单位并使之有效表达，则转染后的细胞能耐受G418的作用，由于不同的细胞系对G418的选择浓度有较大的差异，经过筛选，我们认为400 mg。L-1较为合适。
2.5 G418加入时间的影响 G418是一种筛选抗生素，过早加入将明显影响细胞的活性，抑制单个转染细胞的克隆生长。过晚加入，未转染细胞的过渡生长则会抑制转染细胞的生长，我们认为转染后16 h加入G418较为合适。
总之，受体细胞、质粒DNA浓度及作用时间，G418浓度和加入时间，与转染效率关系密切，优化其中因素，将可大大提高转化效率，从而为进一步的研究工作奠定基础。
作者简介：梁惠珍，女，44岁，技师
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参考文献
1，萨姆布鲁克，EF弗里著.金冬雁译.分子克隆技术指南.北京：科学出版社，1992：21
2，Chen C, Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol, 1987;7(8):2745
3，鄂 征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1988：56
4，姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：152
收稿日期：1998-12-24, http://www.100md.com