老年大鼠体内NO、NOS、AGEs和SOD水平与衰老的关系
作者：孔德娟 陈永春 李 恩 佟晓旭
单位：河北医科大学生化教研室，石家庄 050017
关键词：衰老；一氧化氮；晚期糖化终末产物；超氧化物歧化酶
中国老年学杂志/990329 摘 要 目的 探讨一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、晚期糖化终末产物(AGEs)和超氧化物歧化酶(SOD)在衰老中的作用。方法 测定20月龄和3月龄大鼠体内NO、NOS、AGEs和SOD的活性。结果 20月龄大鼠骨胶原中AGEs显著增加(P<0.05)，血浆中NO明显高于3月龄对照组，NOS活性增高(分别为P<0.02和P<0.001)，而SOD活性显著降低(P<0.02)。结论 从NO生理功能可知，此结果与老年体内发生的生理变化相矛盾。推测可能由于随着年龄的增长SOD合成减少，对
灭活减少，更多的与NO反应生成OONO·，使NO生物学活性降低。另一方面，AGEs通过化学反应直接灭活NO，故而导致老年体内表现出众多NO缺乏的体征。
, 百拇医药
近来的许多研究表明，一氧化氮(NO)具有广泛的生物学作用，其功能降低与衰老及许多老年性疾病如高血压、动脉粥样硬化等的发生有关，但其功能降低的原因目前不清楚。晚期糖化终末产物(AGEs)对NO有灭活作用〔1〕，而超氧化物歧化酶(SOD)的底物——超氧阴离子()可与NO迅速结合产生具有强氧化作用的过氧亚硝酸〔2〕。但有关NO、AGEs和SOD之间相互作用对老年机体影响的研究未见报道。本文通过测定大鼠体内NO、NOS、AGEs和SOD的变化，以期探讨它们之间的相互作用对机体衰老的影响，为延缓衰老和老年性疾病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组 10只2月龄、10只19月龄SD大鼠，雌雄各半，由河北省实验动物中心提供，各组大鼠分笼饲养，饲喂标准大鼠饲料，自由进食饮水。
, 百拇医药
1.2 标本采集 两组大鼠经常规喂养1个月后，清醒状态下股动脉放血处死，收集血液，离心分离血清，-20 ℃保存待测。取大鼠右侧股骨和胫骨剔除软组织，-70 ℃贮存。
1.3 检测方法
1.3.1 血清NO、NOS和SOD的测定 NO测定采用硝酸还原酶比色法。NOS测定采用比色法，酶活力的定义为每升血清每分钟生成1μmol NO为酶的一个活力单位。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶比色法。以上3种试剂盒均为南京建成生物工程研究所生产。测试仪器为722型分光光度计，操作均按试剂盒说明书要求进行。
1.3.2 骨胶原AGEs的测定 参照Tomasek等〔3〕的方法，去除大鼠股骨和胫骨的干骺端，沿骨长轴剪开，用PBS冲洗骨髓腔，过滤，纸吸干多余水份，骨皮质置于液氮中，30 min后取出，研磨为20目以下颗粒状骨粉。称取骨粉20mg，在0.5mol/L EDTA(pH 7.4)中，4 ℃，脱钙72 h，每24 h换液一次。脱钙骨粉经5 ml氯仿：甲醇(2∶1)脱脂12h。加入甲醇2ml、蒸馏水0.5ml，650g离心，吸弃上清，沉淀经5ml甲醇洗3次，蒸馏水洗3次，再用含0.1mol/LCaCl2和0.02mol/L，Hepes(BufferH)缓冲液(pH7.5)冲洗2次，BufferH中4℃过夜。离心，除去BufferH，骨颗粒沉淀重新悬浮在1.0ml含280UⅦ胶原酶(sigma)的BufferH中，加入2μl氯仿和2μl甲苯以防细菌生长，水浴摇床中37℃消化24h，10000g离心5min。以激发波长370nm，发射波长440nm测定上清中的荧光强度，含胶原酶的BufferH作空白对照。上清经6N盐酸水解后，用于羟脯氨酸的测定，以胶原中羟脯氨酸的含量为14%，计算出胶原含量。AGEs的量以每毫克胶原中相对荧光强度表示。仪器为日立F4500荧光分光光度计。
, 百拇医药
1.4 统计方法 方差齐性检验，两样本均数比较t和t＇检验。
2 结果与讨论
20月龄大鼠和3月龄大鼠比较，20月龄大鼠血清中NO含量显著增加(P<0.02)，NOS活性升高(P<0.001)，而血清SOD活性降低(P<0.02)(表1)。骨胶原中AGEs的相对含量，20月龄大鼠显著高于3月龄大鼠(P<0.05)(表2)。
表1 大鼠NO含量、NOS和SOD活性(
±s) 组别
n
NO(μmol/L)
NOS(U/L)
, 百拇医药
SOD(NU/L)
3月龄
10
19.1±2.8
27.7±2.3
233.3±6.8
20月龄
9
31.9±12.31)
36.3±5.92)
219.6±12.51)
, http://www.100md.com
与3月龄组比较，1)P<0.02，2)P<0.001
表2 骨胶原中AGEs的相对含量(±s) 大鼠组别
n
AGEs(U/mg胶原)
3月龄
10
38.9±10.6
20月龄
9
88.0±25.31)
, http://www.100md.com
与3月龄组比较：1)P<0.05
NO在体内具有广泛的生理功能，它作为一种生物调节剂对心血管、血小板、神经传递和免疫方面都具有重要的意义，通过激活可溶性鸟苷酸环化酶，升高细胞内环磷酸鸟苷的水平，而诱导血管平滑肌松弛、抑制血小板聚集和参与神经传递等。本研究发现，老年大鼠体内NO含量增加，NOS活性增高。此结果似乎与老年机体内发生的变化相矛盾，如随着年龄的增加，血管的舒张能力降低，动脉粥样硬化和高血压等的发生。NO在体内发挥作用并不是孤立的，往往与其他物质共同起作用。最近的研究表明，NO在体内可与O÷2发生反应，且这一反应的速率常数很高〔3〕。这就意味着当体内SOD的活性降低时，对的灭活减少，过多的与NO反应，而使NO的生物活性降低，本实验发现血清中SOD的活性降低。过多的与NO反应，生成更具氧化活性的OONO·后者具有很强的细胞毒性，可损伤线粒体氧化酶体系，使细胞内能量生成减少。同时OONO·能够促进脂质过氧化的发生〔3〕，因此，NO的舒血管活性降低和OONO·的强氧化作用可能是老年机体容易发生高血压和动脉粥样硬化的原因之一。
, 百拇医药
另一方面，目前的许多研究表明：随着增龄，体内一类被称作高级糖化终末产物的物质增加〔4～6〕，这种糖化终末产物是糖的醛基或酮基与蛋白质等物质的自由氨基经非酶促反应形成的一类物质。因此，在含有较多自由氨基的胶原组织中AGEs的形成较多，如皮肤、血管壁和骨骼中。本实验通过测定骨组织中AGEs的相对含量发现老龄大鼠骨骼中AGEs明显升高，推测其他组织中AGEs的含量也会相应升高。AGEs通过与NO发生化学反应，迅速将其灭活，而使其不能发挥生理作用〔1，7〕。因此，老年机体血浆中虽然NOS活性升高，NO的含量增加，但由于老年机体内过多的AGEs对NO的灭活，以及SOD活性的降低，使NO与更多的反应生成OONO·，降低了NO的生物学效应，致使老年机体表现为NO缺乏的体征，而实际上NO生成是增加的，但也不能否认在某些组织细胞内NO生成减少的可能性。因此，对于老年性疾病的治疗，不能单纯给予NO的供体或NO的抑制剂。NO的生成及其作用的发挥与体内其他许多因素有关，如某些细胞因子、AGEs和SOD等。
, http://www.100md.com
作者简介：孔德娟，女，34岁，讲师，博士
3 参考文献
1 Bucalar M，Tracey KJ，Cerami A.Advanced Glycosylation products quench nitric oxide and mediate defective endothelium-dependent vasodilation in experimental diabetes.J Clin Invest，1991；87：432
2 王瑾雯，陈 瑗，周 玫.一氧化氮、超氧阴离子和过氧亚硝酸的作用和相互关系的研究进展.生命的化学，1998；18(3)：3
3 Tomasek JJ，Meyers SW，Basinger JB et al.Diabetic and age-related enhancement of collagen-linked fluorecence in cortical bones of rats.Life Sci，1994；55(11)：85
, 百拇医药
4 Pall RG，Bailey AJ.Glycation of collagen,the basic of its central role in the late complications of Ageing and diabetes.Int J Biochem Cell Biol，1996；28(12)：1 297
5 Wu JT.Advanced Glycosylation end products:A new disease mar-
ker for diabetes and ageing.J Clin Lab Anal，1993；7(5)：252
6 Munch G，Thome J,Foley P et al.Advanced glycation end products in ageing and Alzheimer's disease.Brain Res Rev，1997；23(1～2)：134
7 Hogan M，Cerami A,Bucalal R.Advanced glycosylation end products block the antiliferative effect of nitric oxide.J Clin Invest，1992；90：110
〔1998-06-05收稿 1998-09-24修回〕, http://www.100md.com
单位：河北医科大学生化教研室，石家庄 050017
关键词：衰老；一氧化氮；晚期糖化终末产物；超氧化物歧化酶
中国老年学杂志/990329 摘 要 目的 探讨一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、晚期糖化终末产物(AGEs)和超氧化物歧化酶(SOD)在衰老中的作用。方法 测定20月龄和3月龄大鼠体内NO、NOS、AGEs和SOD的活性。结果 20月龄大鼠骨胶原中AGEs显著增加(P<0.05)，血浆中NO明显高于3月龄对照组，NOS活性增高(分别为P<0.02和P<0.001)，而SOD活性显著降低(P<0.02)。结论 从NO生理功能可知，此结果与老年体内发生的生理变化相矛盾。推测可能由于随着年龄的增长SOD合成减少，对
灭活减少，更多的与NO反应生成OONO·，使NO生物学活性降低。另一方面，AGEs通过化学反应直接灭活NO，故而导致老年体内表现出众多NO缺乏的体征。, 百拇医药
近来的许多研究表明，一氧化氮(NO)具有广泛的生物学作用，其功能降低与衰老及许多老年性疾病如高血压、动脉粥样硬化等的发生有关，但其功能降低的原因目前不清楚。晚期糖化终末产物(AGEs)对NO有灭活作用〔1〕，而超氧化物歧化酶(SOD)的底物——超氧阴离子(
)可与NO迅速结合产生具有强氧化作用的过氧亚硝酸〔2〕。但有关NO、AGEs和SOD之间相互作用对老年机体影响的研究未见报道。本文通过测定大鼠体内NO、NOS、AGEs和SOD的变化，以期探讨它们之间的相互作用对机体衰老的影响，为延缓衰老和老年性疾病的防治提供理论依据。1 材料与方法
1.1 动物分组 10只2月龄、10只19月龄SD大鼠，雌雄各半，由河北省实验动物中心提供，各组大鼠分笼饲养，饲喂标准大鼠饲料，自由进食饮水。
, 百拇医药
1.2 标本采集 两组大鼠经常规喂养1个月后，清醒状态下股动脉放血处死，收集血液，离心分离血清，-20 ℃保存待测。取大鼠右侧股骨和胫骨剔除软组织，-70 ℃贮存。
1.3 检测方法
1.3.1 血清NO、NOS和SOD的测定 NO测定采用硝酸还原酶比色法。NOS测定采用比色法，酶活力的定义为每升血清每分钟生成1μmol NO为酶的一个活力单位。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶比色法。以上3种试剂盒均为南京建成生物工程研究所生产。测试仪器为722型分光光度计，操作均按试剂盒说明书要求进行。
1.3.2 骨胶原AGEs的测定 参照Tomasek等〔3〕的方法，去除大鼠股骨和胫骨的干骺端，沿骨长轴剪开，用PBS冲洗骨髓腔，过滤，纸吸干多余水份，骨皮质置于液氮中，30 min后取出，研磨为20目以下颗粒状骨粉。称取骨粉20mg，在0.5mol/L EDTA(pH 7.4)中，4 ℃，脱钙72 h，每24 h换液一次。脱钙骨粉经5 ml氯仿：甲醇(2∶1)脱脂12h。加入甲醇2ml、蒸馏水0.5ml，650g离心，吸弃上清，沉淀经5ml甲醇洗3次，蒸馏水洗3次，再用含0.1mol/LCaCl2和0.02mol/L，Hepes(BufferH)缓冲液(pH7.5)冲洗2次，BufferH中4℃过夜。离心，除去BufferH，骨颗粒沉淀重新悬浮在1.0ml含280UⅦ胶原酶(sigma)的BufferH中，加入2μl氯仿和2μl甲苯以防细菌生长，水浴摇床中37℃消化24h，10000g离心5min。以激发波长370nm，发射波长440nm测定上清中的荧光强度，含胶原酶的BufferH作空白对照。上清经6N盐酸水解后，用于羟脯氨酸的测定，以胶原中羟脯氨酸的含量为14%，计算出胶原含量。AGEs的量以每毫克胶原中相对荧光强度表示。仪器为日立F4500荧光分光光度计。
, 百拇医药
1.4 统计方法 方差齐性检验，两样本均数比较t和t＇检验。
2 结果与讨论
20月龄大鼠和3月龄大鼠比较，20月龄大鼠血清中NO含量显著增加(P<0.02)，NOS活性升高(P<0.001)，而血清SOD活性降低(P<0.02)(表1)。骨胶原中AGEs的相对含量，20月龄大鼠显著高于3月龄大鼠(P<0.05)(表2)。
表1 大鼠NO含量、NOS和SOD活性(
±s) 组别n
NO(μmol/L)
NOS(U/L)
, 百拇医药
SOD(NU/L)
3月龄
10
19.1±2.8
27.7±2.3
233.3±6.8
20月龄
9
31.9±12.31)
36.3±5.92)
219.6±12.51)
, http://www.100md.com
与3月龄组比较，1)P<0.02，2)P<0.001
表2 骨胶原中AGEs的相对含量(
±s) 大鼠组别n
AGEs(U/mg胶原)
3月龄
10
38.9±10.6
20月龄
9
88.0±25.31)
, http://www.100md.com
与3月龄组比较：1)P<0.05
NO在体内具有广泛的生理功能，它作为一种生物调节剂对心血管、血小板、神经传递和免疫方面都具有重要的意义，通过激活可溶性鸟苷酸环化酶，升高细胞内环磷酸鸟苷的水平，而诱导血管平滑肌松弛、抑制血小板聚集和参与神经传递等。本研究发现，老年大鼠体内NO含量增加，NOS活性增高。此结果似乎与老年机体内发生的变化相矛盾，如随着年龄的增加，血管的舒张能力降低，动脉粥样硬化和高血压等的发生。NO在体内发挥作用并不是孤立的，往往与其他物质共同起作用。最近的研究表明，NO在体内可与O÷2发生反应，且这一反应的速率常数很高〔3〕。这就意味着当体内SOD的活性降低时，对
的灭活减少，过多的与NO反应，而使NO的生物活性降低，本实验发现血清中SOD的活性降低。过多的与NO反应，生成更具氧化活性的OONO·后者具有很强的细胞毒性，可损伤线粒体氧化酶体系，使细胞内能量生成减少。同时OONO·能够促进脂质过氧化的发生〔3〕，因此，NO的舒血管活性降低和OONO·的强氧化作用可能是老年机体容易发生高血压和动脉粥样硬化的原因之一。, 百拇医药
另一方面，目前的许多研究表明：随着增龄，体内一类被称作高级糖化终末产物的物质增加〔4～6〕，这种糖化终末产物是糖的醛基或酮基与蛋白质等物质的自由氨基经非酶促反应形成的一类物质。因此，在含有较多自由氨基的胶原组织中AGEs的形成较多，如皮肤、血管壁和骨骼中。本实验通过测定骨组织中AGEs的相对含量发现老龄大鼠骨骼中AGEs明显升高，推测其他组织中AGEs的含量也会相应升高。AGEs通过与NO发生化学反应，迅速将其灭活，而使其不能发挥生理作用〔1，7〕。因此，老年机体血浆中虽然NOS活性升高，NO的含量增加，但由于老年机体内过多的AGEs对NO的灭活，以及SOD活性的降低，使NO与更多的
反应生成OONO·，降低了NO的生物学效应，致使老年机体表现为NO缺乏的体征，而实际上NO生成是增加的，但也不能否认在某些组织细胞内NO生成减少的可能性。因此，对于老年性疾病的治疗，不能单纯给予NO的供体或NO的抑制剂。NO的生成及其作用的发挥与体内其他许多因素有关，如某些细胞因子、AGEs和SOD等。, http://www.100md.com
作者简介：孔德娟，女，34岁，讲师，博士
3 参考文献
1 Bucalar M，Tracey KJ，Cerami A.Advanced Glycosylation products quench nitric oxide and mediate defective endothelium-dependent vasodilation in experimental diabetes.J Clin Invest，1991；87：432
2 王瑾雯，陈 瑗，周 玫.一氧化氮、超氧阴离子和过氧亚硝酸的作用和相互关系的研究进展.生命的化学，1998；18(3)：3
3 Tomasek JJ，Meyers SW，Basinger JB et al.Diabetic and age-related enhancement of collagen-linked fluorecence in cortical bones of rats.Life Sci，1994；55(11)：85
, 百拇医药
4 Pall RG，Bailey AJ.Glycation of collagen,the basic of its central role in the late complications of Ageing and diabetes.Int J Biochem Cell Biol，1996；28(12)：1 297
5 Wu JT.Advanced Glycosylation end products:A new disease mar-
ker for diabetes and ageing.J Clin Lab Anal，1993；7(5)：252
6 Munch G，Thome J,Foley P et al.Advanced glycation end products in ageing and Alzheimer's disease.Brain Res Rev，1997；23(1～2)：134
7 Hogan M，Cerami A,Bucalal R.Advanced glycosylation end products block the antiliferative effect of nitric oxide.J Clin Invest，1992；90：110
〔1998-06-05收稿 1998-09-24修回〕, http://www.100md.com