异丙肾上腺素所致心肌损害的心肌ICAM-1表达增加的实验研究
作者：张严高 秦永文1 吴 弘1 章同华1
单位：解放军杭州疗养院，杭州 310007
关键词：ICAM-1；异丙肾上腺素；心肌损害；免疫组织化学
中国老年学杂志/990326 摘 要 目的 观察异丙肾上腺素引起心肌损伤时其损害心肌ICAM-1表达的变化，从而评价ICAM-1在这种心肌损害中的作用。方法 实验研究通过反复多次大剂量的异丙肾上腺素(异丙肾)所致心肌损害的SD大鼠8只和正常对照组10只；常规HE染色后光镜下观察心肌的ICAM-1表达。结果 在处理组大多数损害心肌的ICAM-1的表达是高度阳性(
)(7/8)，而对照组多为阴性(-)(7/10)；两组间相差非常显著(P<0.01)。同时观察到在处理组损伤区中ICAM-1表达增加的程度与心肌损害的程度相一致。结论 在异丙肾所致心肌损害的损伤区的ICAM-1表达明显增加，且其增加的程度与心肌损伤的程度密切相关。提示ICAM-1在这种心肌损害的病理过程中起重要作用。
, 百拇医药
大剂量异丙肾上腺素引起心肌损害模型是研究心肌缺血缺氧性病理变化的主要方法之一。以往的研究已表明细胞间粘附分子-1(ICAM-1)参与炎症反应、免疫细胞作用、微血管损害、血栓形成及缺血灌注损伤等病理过程〔1〕，但相对缺血缺氧性心肌损害时ICAM-1的研究较少。本文通过免疫组化方法检测心肌ICAM-1的表达，以探讨ICAM-1在这种缺血性损害中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 SD大鼠18只，体重300±30g，第二军医大学实验动物中心提供。盐酸异丙肾上腺素(异丙肾)：上海天丰制药厂生产，批号960504。抗ICAM-1单抗：由吴弘提供。LSAB药盒：丹麦DAKO公司生产。HE染色及免疫组化染色其他材料由第二军医大学病理解剖教研室配制。
1.2 动物分组及心肌损害模型制备 动物分为异丙肾损伤组(处理组)8只，正常对照组10只。参考Rone等〔2〕异丙肾所致心肌损害的方法改进。处理组腹腔注射异丙肾4mg/kg*d-1，1次/d，间隔24h，连续3d。对照组除用等量生理盐水代替异丙肾外，处理均同处理组。
, 百拇医药
1.3 心肌病理切片制备 在首次给予异丙肾72h后在安定及氯胺酮麻醉下立即取出心脏，去心房取心室放入4℃冷盐水冲洗2次，再迅速放入液氮中保存备用。实验完毕集中标本用OCT包埋剂包埋，在-14℃恒温箱内取四腔平面行冰冻切片连续5～8张，片厚8μm。
1.4 苏木素-伊红(HE)染色 取冰冻切片吹干后行常规HE染色，在光镜下观察心肌损害情况。
1.5 异丙肾所致心肌损害光镜下分级标准见文献〔2〕。
1.6 免疫组织化学染色 选用LSAB药盒，按冰冻切片免疫组化ABC法〔3〕，其流程见文献〔3〕。
1.7 免疫组化染色结果评定 采用等级评分法。细胞无特异性染色(呈浅蓝)为“-”，轻度特异性染色(浅棕色)“+”，中度特异性染色(棕色)“
”，明显特异性染色(深棕色或黑色)“”。
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1.8 统计方法 实验结果为等级资料，应用非参数统计方法的Didit分析进行检验。
2 结 果
2.1 异丙肾所致心肌损害后大鼠的一般表现 主要表现为呼吸困难、懒动、伸颈俯卧、烦渴、四肢及唇苍白、间歇性燥动、笼中穿跑等。多在用异丙肾后5min出现，1h内恢复正常。其中首日2只和次日1只在用药约40min死亡。对照组无症状。
2.2 心肌损害
2.2.1 心脏大体观察无明显损害。
2.2.2 光学显微镜下损害表现 处理组典型心肌损害为广泛局灶性坏死，常有较多局灶性坏死融合的大片状坏死，符合以前报道〔2，4〕(图1)。对照组未见损害(图2)。两组比较见表1。
, 百拇医药
图1 处理组心肌损害
图2 对照组心肌无损害
表1 心肌损害的比较 损害程度
处理组
对照组
0
10
0
Ⅰ
0
0
Ⅱ
, 百拇医药
0
1
Ⅲ
0
7
平均
0
2.71)
注：1)P<0.01
2.3 免疫组化染色结果
2.3.1 处理组坏死区ICAM-1表达大多数为明显特异性染色()(7/8)，部分为()(1/8)，典型表现见图3，对照组心肌ICAM-1表达多数为阴性(-)(7/10)，部分为(+)(3/10)，见图4。两组比较见表2，处理组表达明显增加，两组间有非常显著差异(P<0.01)。
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图3 处理组免疫组化，a30倍，b120倍
图4 对照组免疫组化染色，a30倍，b 120倍 表2 心肌ICAM-2表达的比较 表达程度
处理组
对照组
-
7
0
+
3
0
, 百拇医药
0
1
0
7
平均
0.3
2.71)
注：1)P<0.01
2.3.2 处理组不同损伤程度区域心肌的ICAM-1表达为坏死融合区()>局灶坏死区(～)>轻度损害区()>未见损害区(+)，说明心肌ICAM-1表达程度与心肌损害程度可能呈正相关。
, 百拇医药
3 讨 论
目前认为异丙肾引起心肌损害的主要机制是相对缺氧因素和代谢因素(如膜损伤、钙超负荷等)引起〔5〕。其典型的病理表现为局灶性坏死和灶性坏死融合；其损害以心尖部及心内膜下最明显，并绕微血管分布。损害包括心肌纤维断裂、碎裂及溶解，大量炎细胞浸润(中性粒细胞和单核细胞为主)，间质水肿，成纤维细胞增生等〔2，4〕。因此认为炎症参与这种心肌损害的过程。本实验结果显示这种心肌损害时心肌的ICAM-1表达明显增加，表明ICAM-1表达与炎症反应有密切关系。所以我们认为ICAM-1介导的炎症反应也是异丙肾引起心肌损害的机理之一。
近几年来对粘附分子研究逐步深入，已显示其在许多疾病的病理过程中起重要作用。在心血管方面，已证实其在缺血再灌注损伤、急性心梗、动脉粥样硬化形成中起作用。其中参与心肌损害过程的主要相关粘附分子是ICAM-1，它与中性粒细胞(PMN)、血管内皮细胞(EC)及心肌细胞相互作用有密切关系〔5～9〕。本实验中损伤区心肌ICAM-1表达增加，说明ICAM-1参与这种缺血性心肌损害的病理过程，其作用的机理现尚不清楚。
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ICAM-1广泛分布在造血细胞和非造血细胞，其中血管EC、上皮细胞、成纤维细胞正常时表达较强，而心肌细胞是低表达的〔1〕。ICAM-1的配体主要是LFA-1，它在PMN、单核细胞及淋巴细胞上明显表达。在IL-1、IFN等刺激时ICAM-1的表达可增强〔11〕。ICAM-1主要作用为：(1)ICAM-1参与PMN的粘附、渗出及心肌损伤区的聚集，可产生PMN介导的细胞损害作用。正常的血管EC有抗粒细胞性，PMN可沿着血管壁滚动而很少贴壁粘附。当炎症反应等病理过程时，血管内滚动的PMN通过其CD11/CD18与EC上的ICAM-1或E-选择素结合，从而相互粘附。这种PMN与EC发生的粘附是PMN的微血管内靠边和游走渗出至血管外的前提，也是PMN损伤血管的基础〔6，11〕。一旦粘附发生后，可通过多种机制损伤组织，如进一步吸附血小板及PMN而造成毛细血管堵塞呈无血流现象〔11〕；这时微循环中的PMN与心肌细胞间只隔一层EC，PMC可释放自由基、弹性蛋白酶等损伤介质直接扩散到心肌细胞产生损伤；PMN还可跨膜迁移到ICAM-1表达增加的心肌细胞内，直接释放有毒物质造成损伤等。(2)ICAM-1在细胞毒作用中起一定的作用〔7〕。(3)LFA-1/ICAM-1参与淋巴细胞聚集及记忆细胞的分布〔7〕。
, 百拇医药
(4)ICAM-1/LFA-1作为T细胞上其刺激受体，与抗原呈递细胞上的配体活化增殖而参与免疫作用〔7〕。
另外，心肌损害时其他细胞因子如IL-1、TNF等的表达增加促使心肌ICAM-1表达的增加。
本实验中异丙肾引起心肌损害的程度与心肌ICAM-1表达程度呈正性相关，说明ICAM-1在这种心肌损害中起一定的作用。我们还发现轻度损伤区(只有细胞肿胀，无心肌坏死、肌纤维增生、炎细胞浸润)的心肌ICAM-1表达明显高于对照组，说明这种ICAM-1表达的增加不可能单由大量成纤维细胞增生所引起。
总之，在异丙肾所致心肌损害时心肌的ICAM-1表达是增加的；而其表达增加程度与心肌损害程度密切相关，说明ICAM-1在这种心肌损害中起重要作用。由此推测ICAM-1在缺血性心肌疾病的病理过程中可能同样起一定作用，其作用机制有待进一步研究。
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1 上海长海医院
作者简介：张严高，男，35岁，主治医师，从事老年心血管病研究
4 参考文献
1 Long MW.Blood cell cytoadhesion molecules.Exp Hematol，1992；20：288
2 Rone G，Chappel CI，Balazs T et al.An infarct-like myocardial lession and other toxic manifestation produced by isoproterenal in the rat.Arch Pathol，1995；67：443
3 倪灿荣.免疫组织化学实验技术及应用.北京：科学技术出版社，1993：128-129
, 百拇医药
4 谷伯起.心血管病理学.北京：人民卫生出版社，1992：373-377
5 Jang Y，Lincoff AM,Plow EF et al.Cell adhesion molecules in coronary artery disease.J Am Coll Cardial，1994；24：1591
6 彭文鸿.细胞粘附分子在白细胞和内皮细胞粘附中的作用机制.国外医学*生理病理学分册，1995；15：96
7 梁 华，马大龙.细胞间粘附分子-1的研究进展.生物化学及生物物理进展，1994；21：303
8 Anne Hackmen,Abe Y，Insull W et al.Levels of soluble cell adhesion molecules in patients with dyslipidemia.Circulation，1996；93：1 334
, 百拇医药
9 Mazzome A，Servi DS,Ricevuti G et al.Increased expression of neutrophil and monocyte adhesion molecules in unstable coronary artery disease.Circulation，1993；88：358
10 孔宪涛.细胞粘附分子.国外医学*分子生物学分册，1994；16：1
11 Zimmermen GA.Endothelial cell interactions with granulocytes:tethering and signaling molecules.Immunol Today，1992；13：93
〔1998-02-25收稿 1998-05-27修回〕, 百拇医药(张严高 秦永文1 吴 弘1 章同华1)
单位：解放军杭州疗养院，杭州 310007
关键词：ICAM-1；异丙肾上腺素；心肌损害；免疫组织化学
中国老年学杂志/990326 摘 要 目的 观察异丙肾上腺素引起心肌损伤时其损害心肌ICAM-1表达的变化，从而评价ICAM-1在这种心肌损害中的作用。方法 实验研究通过反复多次大剂量的异丙肾上腺素(异丙肾)所致心肌损害的SD大鼠8只和正常对照组10只；常规HE染色后光镜下观察心肌的ICAM-1表达。结果 在处理组大多数损害心肌的ICAM-1的表达是高度阳性(
)(7/8)，而对照组多为阴性(-)(7/10)；两组间相差非常显著(P<0.01)。同时观察到在处理组损伤区中ICAM-1表达增加的程度与心肌损害的程度相一致。结论 在异丙肾所致心肌损害的损伤区的ICAM-1表达明显增加，且其增加的程度与心肌损伤的程度密切相关。提示ICAM-1在这种心肌损害的病理过程中起重要作用。, 百拇医药
大剂量异丙肾上腺素引起心肌损害模型是研究心肌缺血缺氧性病理变化的主要方法之一。以往的研究已表明细胞间粘附分子-1(ICAM-1)参与炎症反应、免疫细胞作用、微血管损害、血栓形成及缺血灌注损伤等病理过程〔1〕，但相对缺血缺氧性心肌损害时ICAM-1的研究较少。本文通过免疫组化方法检测心肌ICAM-1的表达，以探讨ICAM-1在这种缺血性损害中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 SD大鼠18只，体重300±30g，第二军医大学实验动物中心提供。盐酸异丙肾上腺素(异丙肾)：上海天丰制药厂生产，批号960504。抗ICAM-1单抗：由吴弘提供。LSAB药盒：丹麦DAKO公司生产。HE染色及免疫组化染色其他材料由第二军医大学病理解剖教研室配制。
1.2 动物分组及心肌损害模型制备 动物分为异丙肾损伤组(处理组)8只，正常对照组10只。参考Rone等〔2〕异丙肾所致心肌损害的方法改进。处理组腹腔注射异丙肾4mg/kg*d-1，1次/d，间隔24h，连续3d。对照组除用等量生理盐水代替异丙肾外，处理均同处理组。
, 百拇医药
1.3 心肌病理切片制备 在首次给予异丙肾72h后在安定及氯胺酮麻醉下立即取出心脏，去心房取心室放入4℃冷盐水冲洗2次，再迅速放入液氮中保存备用。实验完毕集中标本用OCT包埋剂包埋，在-14℃恒温箱内取四腔平面行冰冻切片连续5～8张，片厚8μm。
1.4 苏木素-伊红(HE)染色 取冰冻切片吹干后行常规HE染色，在光镜下观察心肌损害情况。
1.5 异丙肾所致心肌损害光镜下分级标准见文献〔2〕。
1.6 免疫组织化学染色 选用LSAB药盒，按冰冻切片免疫组化ABC法〔3〕，其流程见文献〔3〕。
1.7 免疫组化染色结果评定 采用等级评分法。细胞无特异性染色(呈浅蓝)为“-”，轻度特异性染色(浅棕色)“+”，中度特异性染色(棕色)“
”，明显特异性染色(深棕色或黑色)“”。, http://www.100md.com
1.8 统计方法 实验结果为等级资料，应用非参数统计方法的Didit分析进行检验。
2 结 果
2.1 异丙肾所致心肌损害后大鼠的一般表现 主要表现为呼吸困难、懒动、伸颈俯卧、烦渴、四肢及唇苍白、间歇性燥动、笼中穿跑等。多在用异丙肾后5min出现，1h内恢复正常。其中首日2只和次日1只在用药约40min死亡。对照组无症状。
2.2 心肌损害
2.2.1 心脏大体观察无明显损害。
2.2.2 光学显微镜下损害表现 处理组典型心肌损害为广泛局灶性坏死，常有较多局灶性坏死融合的大片状坏死，符合以前报道〔2，4〕(图1)。对照组未见损害(图2)。两组比较见表1。
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图1 处理组心肌损害
图2 对照组心肌无损害
表1 心肌损害的比较 损害程度
处理组
对照组
0
10
0
Ⅰ
0
0
Ⅱ
, 百拇医药
0
1
Ⅲ
0
7
平均
0
2.71)
注：1)P<0.01
2.3 免疫组化染色结果
2.3.1 处理组坏死区ICAM-1表达大多数为明显特异性染色(
)(7/8)，部分为()(1/8)，典型表现见图3，对照组心肌ICAM-1表达多数为阴性(-)(7/10)，部分为(+)(3/10)，见图4。两组比较见表2，处理组表达明显增加，两组间有非常显著差异(P<0.01)。, http://www.100md.com
图3 处理组免疫组化，a30倍，b120倍
图4 对照组免疫组化染色，a30倍，b 120倍 表2 心肌ICAM-2表达的比较 表达程度
处理组
对照组
-
7
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3
0
, 百拇医药
0
1
0
7
平均
0.3
2.71)
注：1)P<0.01
2.3.2 处理组不同损伤程度区域心肌的ICAM-1表达为坏死融合区(
)>局灶坏死区(～)>轻度损害区()>未见损害区(+)，说明心肌ICAM-1表达程度与心肌损害程度可能呈正相关。, 百拇医药
3 讨 论
目前认为异丙肾引起心肌损害的主要机制是相对缺氧因素和代谢因素(如膜损伤、钙超负荷等)引起〔5〕。其典型的病理表现为局灶性坏死和灶性坏死融合；其损害以心尖部及心内膜下最明显，并绕微血管分布。损害包括心肌纤维断裂、碎裂及溶解，大量炎细胞浸润(中性粒细胞和单核细胞为主)，间质水肿，成纤维细胞增生等〔2，4〕。因此认为炎症参与这种心肌损害的过程。本实验结果显示这种心肌损害时心肌的ICAM-1表达明显增加，表明ICAM-1表达与炎症反应有密切关系。所以我们认为ICAM-1介导的炎症反应也是异丙肾引起心肌损害的机理之一。
近几年来对粘附分子研究逐步深入，已显示其在许多疾病的病理过程中起重要作用。在心血管方面，已证实其在缺血再灌注损伤、急性心梗、动脉粥样硬化形成中起作用。其中参与心肌损害过程的主要相关粘附分子是ICAM-1，它与中性粒细胞(PMN)、血管内皮细胞(EC)及心肌细胞相互作用有密切关系〔5～9〕。本实验中损伤区心肌ICAM-1表达增加，说明ICAM-1参与这种缺血性心肌损害的病理过程，其作用的机理现尚不清楚。
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ICAM-1广泛分布在造血细胞和非造血细胞，其中血管EC、上皮细胞、成纤维细胞正常时表达较强，而心肌细胞是低表达的〔1〕。ICAM-1的配体主要是LFA-1，它在PMN、单核细胞及淋巴细胞上明显表达。在IL-1、IFN等刺激时ICAM-1的表达可增强〔11〕。ICAM-1主要作用为：(1)ICAM-1参与PMN的粘附、渗出及心肌损伤区的聚集，可产生PMN介导的细胞损害作用。正常的血管EC有抗粒细胞性，PMN可沿着血管壁滚动而很少贴壁粘附。当炎症反应等病理过程时，血管内滚动的PMN通过其CD11/CD18与EC上的ICAM-1或E-选择素结合，从而相互粘附。这种PMN与EC发生的粘附是PMN的微血管内靠边和游走渗出至血管外的前提，也是PMN损伤血管的基础〔6，11〕。一旦粘附发生后，可通过多种机制损伤组织，如进一步吸附血小板及PMN而造成毛细血管堵塞呈无血流现象〔11〕；这时微循环中的PMN与心肌细胞间只隔一层EC，PMC可释放自由基、弹性蛋白酶等损伤介质直接扩散到心肌细胞产生损伤；PMN还可跨膜迁移到ICAM-1表达增加的心肌细胞内，直接释放有毒物质造成损伤等。(2)ICAM-1在细胞毒作用中起一定的作用〔7〕。(3)LFA-1/ICAM-1参与淋巴细胞聚集及记忆细胞的分布〔7〕。
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(4)ICAM-1/LFA-1作为T细胞上其刺激受体，与抗原呈递细胞上的配体活化增殖而参与免疫作用〔7〕。
另外，心肌损害时其他细胞因子如IL-1、TNF等的表达增加促使心肌ICAM-1表达的增加。
本实验中异丙肾引起心肌损害的程度与心肌ICAM-1表达程度呈正性相关，说明ICAM-1在这种心肌损害中起一定的作用。我们还发现轻度损伤区(只有细胞肿胀，无心肌坏死、肌纤维增生、炎细胞浸润)的心肌ICAM-1表达明显高于对照组，说明这种ICAM-1表达的增加不可能单由大量成纤维细胞增生所引起。
总之，在异丙肾所致心肌损害时心肌的ICAM-1表达是增加的；而其表达增加程度与心肌损害程度密切相关，说明ICAM-1在这种心肌损害中起重要作用。由此推测ICAM-1在缺血性心肌疾病的病理过程中可能同样起一定作用，其作用机制有待进一步研究。
, http://www.100md.com
1 上海长海医院
作者简介：张严高，男，35岁，主治医师，从事老年心血管病研究
4 参考文献
1 Long MW.Blood cell cytoadhesion molecules.Exp Hematol，1992；20：288
2 Rone G，Chappel CI，Balazs T et al.An infarct-like myocardial lession and other toxic manifestation produced by isoproterenal in the rat.Arch Pathol，1995；67：443
3 倪灿荣.免疫组织化学实验技术及应用.北京：科学技术出版社，1993：128-129
, 百拇医药
4 谷伯起.心血管病理学.北京：人民卫生出版社，1992：373-377
5 Jang Y，Lincoff AM,Plow EF et al.Cell adhesion molecules in coronary artery disease.J Am Coll Cardial，1994；24：1591
6 彭文鸿.细胞粘附分子在白细胞和内皮细胞粘附中的作用机制.国外医学*生理病理学分册，1995；15：96
7 梁 华，马大龙.细胞间粘附分子-1的研究进展.生物化学及生物物理进展，1994；21：303
8 Anne Hackmen,Abe Y，Insull W et al.Levels of soluble cell adhesion molecules in patients with dyslipidemia.Circulation，1996；93：1 334
, 百拇医药
9 Mazzome A，Servi DS,Ricevuti G et al.Increased expression of neutrophil and monocyte adhesion molecules in unstable coronary artery disease.Circulation，1993；88：358
10 孔宪涛.细胞粘附分子.国外医学*分子生物学分册，1994；16：1
11 Zimmermen GA.Endothelial cell interactions with granulocytes:tethering and signaling molecules.Immunol Today，1992；13：93
〔1998-02-25收稿 1998-05-27修回〕, 百拇医药(张严高 秦永文1 吴 弘1 章同华1)