CD44与脑胶质母细胞瘤的侵袭
作者：曹卫东 章 翔 刘 飞 刘卫平 王占祥
单位：第四军医大学西京医院神经外科(710032)
关键词：胶质母细胞瘤；脑膜瘤；基因表达；受体，淋巴细胞归巢；肿瘤侵犯
实用医学杂志990302 摘 要 目的：研究CD44分子在脑胶质母细胞瘤、脑膜瘤中的表达及其在瘤细胞转移、侵袭中的作用。方法：采用原位杂交及免疫组化方法分别从mRNA和蛋白水平检测CD44分子正常型(CD44s)和变体(CD44v3、CD44v6)在20例脑胶质母细胞瘤及20例脑膜瘤中的表达。结果：CD44s在脑胶质母细胞瘤及脑膜瘤中的表达分别为100%和15%，两者相比有显著差异(P<0.01)。CD44v在两种肿瘤中均无表达。结论：CD44s可能在脑胶质母细胞瘤的侵袭中起重要作用。CD44v在两种肿瘤均无表达可能与它们很少发生颅外转移有关。
脑肿瘤的侵袭性是影响其复发及预后的重要因素。大量临床资料证明，仅靠经典的临床分期、病理组织分级判断肿瘤预后、侵袭转移性已显不足。如一些病理级别的脑胶质瘤有高侵袭能力及不良的预后，而病理级别的脑胶质瘤中也有侵袭能力弱及预后相对较好者。而从分子生物学角度寻求更合理、更准确预测肿瘤侵袭转移的检测方法和指标正逐步成为新的研究热点，其中CD44粘附分子与肿瘤的侵袭转移的关系受到广泛的重视。本研究分别从mRNA及蛋白水平检测脑多形性胶质母细胞瘤和脑膜瘤中CD44的表达。研究CD44在脑肿瘤侵袭中的作用，为进一步探索脑肿瘤侵袭规律及CD44对预后的影响提供分子生物学基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 标本来源 采用1995～1997年我院病理科福尔马林固定、石蜡包埋并按WHO脑瘤病理诊断标准确诊的标本。脑多形性胶质母细胞瘤和脑膜瘤(纤维母细胞型8例，含1例恶性脑膜瘤，血管母细胞型6例，含2例恶性脑膜瘤，合体细胞型5例，混合型1例)各20例。40例肿瘤中，男24例，女16例，年龄7～66岁，平均42.5岁。所有标本均做5 μm厚连续切片。
1.2 原位杂交 按地高辛3′末端标记试剂盒(德国BM公司)操作说明，标记寡核苷酸探针1：5′-ATCACGGTTAACAATAGTTATGGTAA-3′和寡核苷酸探针2：5′-CTTGGTCTCTGGRAGCAG-3′(西安美联公司合成，分别互补于Stamenkovic等[1]报道的CD44转录子序列之543～568位和774～791位，核苷酸探针1能特异地检测CD44s及CD44v的转录子，探针2能特异地检测CD44s的转录子)。按地高辛标记和检测试剂盒(德国BM公司)操作说明，在石蜡切片上进行寡核苷酸-mRNA杂交。以正常人皮肤切片作为阳性对照，以预杂交液代替杂交液作为阴性对照。
, 百拇医药
1.3 免疫组化染色 CD44s单克隆抗体和CD44v3、CD44v6两种多克隆抗体分别为美国ZYMED及CALBIOCHEM公司产品。SABC试剂盒购自武汉博士德公司。采用SABC法进行免疫组化染色，染色方法按SABC试剂盒说明进行(微波抗原修复，一抗按1∶100稀释，一抗与组织块室温孵育22小时)。以正常人皮肤切片为阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗，DAB显色，苏木素复染。
1.4 结果判断 原位杂交阳性以胞核内及胞浆出现紫蓝染色为准，免疫组化阳性以胞浆及胞膜出现棕黄染色为准。随机在高倍视野中计数1 000个瘤细胞，视野中阳性细胞数≥50%为强阳性，<50%为弱阳性，未见阳性细胞为阴性。
1.5 统计分析 采用χ2检验。
2 结果
20例脑多形性胶质母细胞瘤中CD44s mRNA及蛋白均呈阳性表达，其中15例强阳性，无CD44v mRNA及CD44v3、CD44v6蛋白单独表达。20例脑膜瘤中只在3例恶性脑膜瘤中有弱的CD44s mRNA及蛋白表达，这3例恶性脑膜瘤均有不同程度的向脑实质的侵袭，无CD44v mRNA及CD44v3、CD44v6蛋白单独表达。结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 脑胶质母细胞瘤及脑膜瘤中CD44s及CD44v(v3，v6)的表达(例，%) 病理类型
总例数
阳性例数(%)
探针1
探针2
抗CD44s
抗CD44v3
抗CD44v6
脑胶质母细胞瘤
20
20(100.0)
20(100.0)
, 百拇医药
20(100.0)
0
0
脑膜瘤
20
3(15.0)
3(15.0)
3(15.0)
0
0
CD44s在脑胶质母细胞瘤和脑膜瘤中的表达有显著性差异P<0.01
3 讨论
, http://www.100md.com
CD44粘附分子是一种多功能的跨膜糖蛋白，存在于多种细胞表面，能介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质的相互作用，从而导致细胞形态、游动性改变。近年的研究认为该分子与多种肿瘤的侵袭转移有关。CD44分子的基因组有着20个外显子，位置靠前及后的各5个外显子是恒定表达的，由这10个外显子编码的蛋白称为标准型CD44(CD44s)；而位置居中的10个外显子的拼接方式是可变的，标准型CD44 mRNA中插入该10个外显子中的一个或数个所编码的蛋白称为CD44变体(CD44v)。由于mRNA的不同拼接方式及翻译后不同的糖基化修饰，目前，已知CD44分子至少有20种变体[2，3]。
CD44分子能与多种细胞外基质成分相互作用，其中透明质酸是其主要配体。透明质酸是脑内细胞外基质的主要成分，由于它带电荷的基团能结合大量水分子，从而能占据比其分子量大得多的空间。在神经系统的胚胎发育过程中，透明质酸在促进神经细胞增殖及调节神经细胞迁移方面起着重要作用。[2，4]。
, http://www.100md.com
脑膜瘤和脑多形性胶质母细胞瘤是两种颅内的原发性肿瘤，然而它们的生物学特性却有着很大的不同。传统意义上的脑膜瘤罕见侵入脑实质生长，而脑多形胶质母细胞瘤能在脑内细胞外基质中发生广泛的侵袭。因此，这两种肿瘤是脑内肿瘤侵袭性研究很好的模型。
本研究显示CD44s mRNA在脑多形性胶质母细胞瘤中有高表达，而在脑膜瘤中表达率很低，仅在3例有着脑实质侵袭的恶性脑膜瘤中有弱表达，两者之间有着显著的差异(P<0.01)，免疫组化染色亦证实该结果。Kupper等[5]试验结果与我们的相吻合。这提示CD44s与瘤细胞在脑内的侵袭有着密切关系，缺乏CD44s表达的脑膜瘤不能有效的与脑内细胞外基质中广泛分布的透明质酸结合，因而它们不能侵入脑实质内生长，而有着丰富的CD44s表达的脑多形性胶质母细胞瘤却能通过CD44与透明质酸及其它细胞外基质成分的相互作用而在脑实质中形成广泛的侵袭，脑膜瘤中一旦有CD44s的表达后，也能通过CD44与透明质酸的相互作用而具有向脑实质侵袭生长的能力。Koochekpour等[6]的体外实验表明CD44与透明质酸的相互作用能促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。另有研究表明胶质瘤中透明质酸的表达增高，达到胚胎发育时的水平[4]。均支持CD44与透明质酸相互作用能介导瘤细胞脑内侵袭这一假说。
, http://www.100md.com
本实验还发现CD44v mRNA在所检测的脑膜瘤及脑多形性胶质母细胞瘤中均无表达，经免疫组化检测亦获同样结果。这与脑膜瘤及多形性胶质母细胞瘤罕见向颅外转移是相吻合的。近来的多项研究提示CD44v与多种肿瘤的转移有关[2]。Rudy等[7]将CD44v cDNA转染入非转移性肿瘤细胞，后者出现转移特征。Li等[8]的研究亦表明CD44v在颅内转移肿瘤中有高表达，而在脑多形性胶质母细胞瘤中无表达，揭示CD44v在肿瘤的颅内转移有重要作用。
总之，本研究的结果表明CD44s在肿瘤细胞在脑实质内侵袭生长中起重要作用。CD44v在脑膜瘤和脑多形性胶质母细胞瘤中均无表达与它们罕见颅外转移有关。
*本课题受总后“九五”科研基金资助(基金编号96M141)
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Stamenkovic I,Amiot M,Pesando JM,et al. A lymphocyte molecule implicated lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell,1989,56:1057～1062.
2 Naot D,Sionov RV,Shalom DI. CD44:structure,function,and association with malignant process. Adv Cancer Res,1997,71:241～319.
3 Goodison S,Yoshida K,Sugino T,et al. Rapid analysis of distinctive CD44 RNA splicing preferences that characterize colonic tumors. Cancer Res,1997,57:3140～3144.
, 百拇医药
4 Giese A,Westphal M. Glioma invasion in the central nervous system. Neurosurgery,1996,39:235～252.
5 Kuppner MC,van Meir E,Gauthier T,et al. Differential expression of the CD44 molecule in human brain tumors. Int J Cancer,1992,50:572～577.
6 Koochekpour S,Pilkington GJ,Merzak A. Hyaluronic acid/CD44 interaction induces cell detachment and stimulates migration and invasion of human glioma cells in vitro. Int J Cancer,1995,63(3):450～454.
, http://www.100md.com
7 Rudy W,Hofmann M,Albiez RS,et al. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variant:each one individually suffices to confer metastatic behavior. Cancer Res,1993,53:1262～1268.
8 Li H,Hamou MF,de Tribolet N,et al. Variant CD44 adhesion molecules are experssed in human brain metastases but not in glioblastoma. Cancer Res,1993,53:5345～5349., http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院神经外科(710032)
关键词：胶质母细胞瘤；脑膜瘤；基因表达；受体，淋巴细胞归巢；肿瘤侵犯
实用医学杂志990302 摘 要 目的：研究CD44分子在脑胶质母细胞瘤、脑膜瘤中的表达及其在瘤细胞转移、侵袭中的作用。方法：采用原位杂交及免疫组化方法分别从mRNA和蛋白水平检测CD44分子正常型(CD44s)和变体(CD44v3、CD44v6)在20例脑胶质母细胞瘤及20例脑膜瘤中的表达。结果：CD44s在脑胶质母细胞瘤及脑膜瘤中的表达分别为100%和15%，两者相比有显著差异(P<0.01)。CD44v在两种肿瘤中均无表达。结论：CD44s可能在脑胶质母细胞瘤的侵袭中起重要作用。CD44v在两种肿瘤均无表达可能与它们很少发生颅外转移有关。
脑肿瘤的侵袭性是影响其复发及预后的重要因素。大量临床资料证明，仅靠经典的临床分期、病理组织分级判断肿瘤预后、侵袭转移性已显不足。如一些病理级别的脑胶质瘤有高侵袭能力及不良的预后，而病理级别的脑胶质瘤中也有侵袭能力弱及预后相对较好者。而从分子生物学角度寻求更合理、更准确预测肿瘤侵袭转移的检测方法和指标正逐步成为新的研究热点，其中CD44粘附分子与肿瘤的侵袭转移的关系受到广泛的重视。本研究分别从mRNA及蛋白水平检测脑多形性胶质母细胞瘤和脑膜瘤中CD44的表达。研究CD44在脑肿瘤侵袭中的作用，为进一步探索脑肿瘤侵袭规律及CD44对预后的影响提供分子生物学基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 标本来源 采用1995～1997年我院病理科福尔马林固定、石蜡包埋并按WHO脑瘤病理诊断标准确诊的标本。脑多形性胶质母细胞瘤和脑膜瘤(纤维母细胞型8例，含1例恶性脑膜瘤，血管母细胞型6例，含2例恶性脑膜瘤，合体细胞型5例，混合型1例)各20例。40例肿瘤中，男24例，女16例，年龄7～66岁，平均42.5岁。所有标本均做5 μm厚连续切片。
1.2 原位杂交 按地高辛3′末端标记试剂盒(德国BM公司)操作说明，标记寡核苷酸探针1：5′-ATCACGGTTAACAATAGTTATGGTAA-3′和寡核苷酸探针2：5′-CTTGGTCTCTGGRAGCAG-3′(西安美联公司合成，分别互补于Stamenkovic等[1]报道的CD44转录子序列之543～568位和774～791位，核苷酸探针1能特异地检测CD44s及CD44v的转录子，探针2能特异地检测CD44s的转录子)。按地高辛标记和检测试剂盒(德国BM公司)操作说明，在石蜡切片上进行寡核苷酸-mRNA杂交。以正常人皮肤切片作为阳性对照，以预杂交液代替杂交液作为阴性对照。
, 百拇医药
1.3 免疫组化染色 CD44s单克隆抗体和CD44v3、CD44v6两种多克隆抗体分别为美国ZYMED及CALBIOCHEM公司产品。SABC试剂盒购自武汉博士德公司。采用SABC法进行免疫组化染色，染色方法按SABC试剂盒说明进行(微波抗原修复，一抗按1∶100稀释，一抗与组织块室温孵育22小时)。以正常人皮肤切片为阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗，DAB显色，苏木素复染。
1.4 结果判断 原位杂交阳性以胞核内及胞浆出现紫蓝染色为准，免疫组化阳性以胞浆及胞膜出现棕黄染色为准。随机在高倍视野中计数1 000个瘤细胞，视野中阳性细胞数≥50%为强阳性，<50%为弱阳性，未见阳性细胞为阴性。
1.5 统计分析 采用χ2检验。
2 结果
20例脑多形性胶质母细胞瘤中CD44s mRNA及蛋白均呈阳性表达，其中15例强阳性，无CD44v mRNA及CD44v3、CD44v6蛋白单独表达。20例脑膜瘤中只在3例恶性脑膜瘤中有弱的CD44s mRNA及蛋白表达，这3例恶性脑膜瘤均有不同程度的向脑实质的侵袭，无CD44v mRNA及CD44v3、CD44v6蛋白单独表达。结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 脑胶质母细胞瘤及脑膜瘤中CD44s及CD44v(v3，v6)的表达(例，%) 病理类型
总例数
阳性例数(%)
探针1
探针2
抗CD44s
抗CD44v3
抗CD44v6
脑胶质母细胞瘤
20
20(100.0)
20(100.0)
, 百拇医药
20(100.0)
0
0
脑膜瘤
20
3(15.0)
3(15.0)
3(15.0)
0
0
CD44s在脑胶质母细胞瘤和脑膜瘤中的表达有显著性差异P<0.01
3 讨论
, http://www.100md.com
CD44粘附分子是一种多功能的跨膜糖蛋白，存在于多种细胞表面，能介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质的相互作用，从而导致细胞形态、游动性改变。近年的研究认为该分子与多种肿瘤的侵袭转移有关。CD44分子的基因组有着20个外显子，位置靠前及后的各5个外显子是恒定表达的，由这10个外显子编码的蛋白称为标准型CD44(CD44s)；而位置居中的10个外显子的拼接方式是可变的，标准型CD44 mRNA中插入该10个外显子中的一个或数个所编码的蛋白称为CD44变体(CD44v)。由于mRNA的不同拼接方式及翻译后不同的糖基化修饰，目前，已知CD44分子至少有20种变体[2，3]。
CD44分子能与多种细胞外基质成分相互作用，其中透明质酸是其主要配体。透明质酸是脑内细胞外基质的主要成分，由于它带电荷的基团能结合大量水分子，从而能占据比其分子量大得多的空间。在神经系统的胚胎发育过程中，透明质酸在促进神经细胞增殖及调节神经细胞迁移方面起着重要作用。[2，4]。
, http://www.100md.com
脑膜瘤和脑多形性胶质母细胞瘤是两种颅内的原发性肿瘤，然而它们的生物学特性却有着很大的不同。传统意义上的脑膜瘤罕见侵入脑实质生长，而脑多形胶质母细胞瘤能在脑内细胞外基质中发生广泛的侵袭。因此，这两种肿瘤是脑内肿瘤侵袭性研究很好的模型。
本研究显示CD44s mRNA在脑多形性胶质母细胞瘤中有高表达，而在脑膜瘤中表达率很低，仅在3例有着脑实质侵袭的恶性脑膜瘤中有弱表达，两者之间有着显著的差异(P<0.01)，免疫组化染色亦证实该结果。Kupper等[5]试验结果与我们的相吻合。这提示CD44s与瘤细胞在脑内的侵袭有着密切关系，缺乏CD44s表达的脑膜瘤不能有效的与脑内细胞外基质中广泛分布的透明质酸结合，因而它们不能侵入脑实质内生长，而有着丰富的CD44s表达的脑多形性胶质母细胞瘤却能通过CD44与透明质酸及其它细胞外基质成分的相互作用而在脑实质中形成广泛的侵袭，脑膜瘤中一旦有CD44s的表达后，也能通过CD44与透明质酸的相互作用而具有向脑实质侵袭生长的能力。Koochekpour等[6]的体外实验表明CD44与透明质酸的相互作用能促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。另有研究表明胶质瘤中透明质酸的表达增高，达到胚胎发育时的水平[4]。均支持CD44与透明质酸相互作用能介导瘤细胞脑内侵袭这一假说。
, http://www.100md.com
本实验还发现CD44v mRNA在所检测的脑膜瘤及脑多形性胶质母细胞瘤中均无表达，经免疫组化检测亦获同样结果。这与脑膜瘤及多形性胶质母细胞瘤罕见向颅外转移是相吻合的。近来的多项研究提示CD44v与多种肿瘤的转移有关[2]。Rudy等[7]将CD44v cDNA转染入非转移性肿瘤细胞，后者出现转移特征。Li等[8]的研究亦表明CD44v在颅内转移肿瘤中有高表达，而在脑多形性胶质母细胞瘤中无表达，揭示CD44v在肿瘤的颅内转移有重要作用。
总之，本研究的结果表明CD44s在肿瘤细胞在脑实质内侵袭生长中起重要作用。CD44v在脑膜瘤和脑多形性胶质母细胞瘤中均无表达与它们罕见颅外转移有关。
*本课题受总后“九五”科研基金资助(基金编号96M141)
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Stamenkovic I,Amiot M,Pesando JM,et al. A lymphocyte molecule implicated lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell,1989,56:1057～1062.
2 Naot D,Sionov RV,Shalom DI. CD44:structure,function,and association with malignant process. Adv Cancer Res,1997,71:241～319.
3 Goodison S,Yoshida K,Sugino T,et al. Rapid analysis of distinctive CD44 RNA splicing preferences that characterize colonic tumors. Cancer Res,1997,57:3140～3144.
, 百拇医药
4 Giese A,Westphal M. Glioma invasion in the central nervous system. Neurosurgery,1996,39:235～252.
5 Kuppner MC,van Meir E,Gauthier T,et al. Differential expression of the CD44 molecule in human brain tumors. Int J Cancer,1992,50:572～577.
6 Koochekpour S,Pilkington GJ,Merzak A. Hyaluronic acid/CD44 interaction induces cell detachment and stimulates migration and invasion of human glioma cells in vitro. Int J Cancer,1995,63(3):450～454.
, http://www.100md.com
7 Rudy W,Hofmann M,Albiez RS,et al. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variant:each one individually suffices to confer metastatic behavior. Cancer Res,1993,53:1262～1268.
8 Li H,Hamou MF,de Tribolet N,et al. Variant CD44 adhesion molecules are experssed in human brain metastases but not in glioblastoma. Cancer Res,1993,53:5345～5349., http://www.100md.com