热休克蛋白70抑制大鼠感染性脑水肿炎症因子的研究
作者：尹飞 杨于嘉 毛定安 虞佩兰 陶永光 黄榕
单位：湖南医科大学湘雅医院儿科(长沙410008)
关键词：脑水肿；热休克蛋白；细胞因子；一氧化氮；大鼠
中国现代医学杂志990304 为了探讨热休克蛋白70(HSP70)对大鼠感染性脑水肿的保护作用，该文采用百日咳菌液所致的大鼠感染性脑水肿模型及将大鼠进行热休克处理，观察脑组织中白细胞介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及一氧化氮(NO)水平的变化，并应用Western印迹分析检测大鼠脑组织的HSP70表达。结果发现感染性脑水肿脑组织IL-1β、TNF-α及NO浓度均增高，热休克处理可降低以上三者的浓度，Western印迹分析显示热休克使大鼠脑组织中HSP70含量明显增多。结果提示热应激反应对大鼠感染性脑水肿的保护作用与脑组织中HSP70增多有关。
, 百拇医药 分类号 R-332
感染性脑水肿是儿科临床常见的综合征，发病快，病死率高。近年来研究发现热应激反应具有保护脑组织，抵抗进一步致死性损伤的作用，这一作用主要通过热休克蛋白70(HSP70)来实现[1]。但HSP70对感染性脑水肿的保护机制目前尚未完全阐明。本文在制作百日咳菌液致大鼠感染性脑水肿模型的基础上，采用热休克预处理诱导大鼠产生热应激反应，通过检测大鼠感染性脑水肿脑组织的HSP70表达及肿瘤坏死因子α(TNFα)白细胞介素1β(IL-1β)、一氧化氮(NO)的含量变化，以观察大鼠热应激反应后产生之HSP70对感染性脑水肿部分炎性因子的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
健康Sprague-Dawley大鼠，雌雄兼用，体重210±30g，共33只(其中9只用于Western印迹分析)。正常对照组：大鼠不作热休克预处理，置室温，24h后向左颈内动脉注入等量生理盐水；感染性脑水肿组：不作预处理，置室温，24h后向左颈内动脉注射百日咳菌液制作感染性脑水肿模型；热休克预处理组：大鼠用2%戊巴比妥钠麻醉后，置45℃水浴箱中，使其肛温升至42℃后转至42℃水浴箱中维持15min，然后置室温恢复24h后制作感染性脑水肿模型。
, 百拇医药
1.2 感染性脑水肿模型制备[2]
实验动物采用25%乌拉坦麻醉，3ml/kg腹腔注射。取仰卧位，颈正中切口，分离左侧颈总动脉，颈外动脉和颈内动脉及其分支，分别结扎翼腭动脉及枕动脉，在夹闭左颈外动脉后，感染性脑水肿组及热休克预处理组从左颈总动脉穿刺向左颈内动脉注入百日咳菌液0.2ml/kg，于10～15s注射完，正常对照组则用同法注射等量灭菌生理盐水，动物观察4h断头处死。
1.3 脑组织含水量测定
大鼠处死后立即开颅，快速取左大脑半球后部全层脑组织，电子分析天平称脑湿重，105℃干燥箱干至恒重，按公式：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)÷湿重×100%。
1.4 IL-1β、TNFα含量测定
采用双抗体夹心ELISA法测定IL-1β、TNFα含量，严格按照试剂盒说明进行操作，根据标准品的光密度值(A值)绘出标准曲线并计算出样品浓度，将稀释好的标准品及样品滴入相应的酶标板内，37℃孵育90min；洗板后每孔加入1：200的标记二抗0.1ml，37℃孵育60min，洗板后每孔加入1∶600酶联物0.1ml，37℃，30min；洗板后加底物0.1ml，避光15min后加入终止液0.05ml，以450nm滤光片酶标仪测A值，然后根据标准曲线计算出样品的IL-1β及TNFα含量。
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1.5 NO含量的测定
用200ml脑匀浆上清液与同体积的Griess液混合(1%对氨基苯磺酰胺+0.1%盐酸萘乙二胺+2.5%磷酸)，室温下孵育15min，然后通过721型分光光度计确是其545nm的吸光度值。以亚硝酸钠作为标准，间接测知每克脑组织中的NO含量。
1.6 Western印迹分析
按文献方法[3]稍作修改，制备脑组织蛋白质样品，定量后各组取100μg经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行转膜，使分离后的蛋白质样品转至硝酸纤维膜上，膜经1%BSA+Tween20封闭后，加抗HSP70的鼠IgG单抗(一抗)37℃，过夜，PBST洗膜后加AKP标记的羊抗鼠IgG抗体(二抗)，室温2h，洗膜，加入生色底物缓冲液进行显色反应，至蛋白条带显色清晰时，终止反应，拍摄照片，记录实验结果。重复3次，将照片结果用CS-930扫描仪进行密度分析。
, 百拇医药
1.7 统计学处理
本文数据以均值±标准差(
±s)表示，多样本均数比较用方差分析。
2 结果
2.1 脑组织含水量、IL-1β、TNF-α及NO含量测定结果
感染性脑水肿组与正常对照组比较，脑组织含水量，脑匀浆IL-1β、TNF-α及NO含量均明显增高(P<0.01)，热休克处理组与感染性脑水肿组相比可降低脑组织含水量、IL-1β、TNFα及NO含量(P<0.01或P<0.05) (见表1)。
表1 脑组织含水量IL-1β、TNF-α及NO含量测值(±s) 组别
, 百拇医药
N
脑含水量(%)
TNF-α(ng/g)
IL-1β(ng/g)
NO(nmol/g)
正常组
8
78.4±0.4
313.9±30.7
221.7±33.7
59.9±18.7
感脑组
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8
82.2±0.32)
762.8±84.92)
384.1±37.72)
106.0±13.81)
热休克组
8
79.6±0.33)
492.8±82.34)
306.7±58.63)
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71.1±16.63)
1) 与对照组比较 P<0.05
2) 与对照组比较 P<0.01
3) 与感染性脑水肿组组比较 P<0.05
4) 与感染性脑水肿组组比较 P<0.01
2.2 印迹分析
Western印迹分析发现，与正常对照组、感染性脑水肿组比较，热休克处理组脑组织中HSP70含量明显增多。经CS-930扫描仪定量分析，密度面积扫描显示正常对照组为(0.32±0.04)，感染性脑水肿组为(0.41±0.05)，热休克处理组为(1.50±0.33)，热休克处理组与感染性脑水肿组比较差异有高度显著性(P<0.01)。3 讨论
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急性感染性脑水肿既有血源性又有细胞毒性，属混合性脑水肿。本研究结果表明，感染性脑水肿组的IL-1β、TNFα及NO浓度均明显增加，提示上述炎症因子参与了百日咳菌液所致感染性脑水肿的病理过程。内毒素脂多糖(LPS)是IL-1β和TNFα生成的强烈激动剂，可刺激小胶质细胞产生IL-1β、TNFα，随着IL-1β的产生，其可刺激星形细胞的增生及TNFα的释放，还可以作为一种介质使脑组织水肿，最终影响脑功能[4]。TNFα的产生可加强内皮细胞的可渗透性，从而改变血脑屏障的通透性，促进炎症细胞进入神经组织内，TNFα还可使髓鞘损伤，少突胶质细胞溶解，导致细胞死亡[5]。同时IL-1β及TNFα两者共同作用，可通过NO的大量产生及NMDA受体的激活而引起神经细胞的损伤[6]。大量的NO的产生和释放可直接产生神经毒性，并且NO与过氧化物作用再生成更强毒性的羟基化物，加速了神经变性过程，从而也加速脑水肿的形成。
本实验证实热应激反应能降低脑组织含水量、IL-1β、TNFα及NO含量，提示对感染性脑水肿有保护作用。那么这一保护作用是通过何种途径来实现呢?本研究应用Western印迹分析表明热休克处理组大鼠脑组织中HSP70明显多于感染性脑水肿组及对照组，进一步证实HSP70能减轻脑水肿。HSP70是HSP中最丰富的一种，由热应激反应诱导表达，其合成增多对缺血神经元有保护作用[1]。HSP的保护机制可能通过避免由于氧自由基反应、蛋白酶和磷酯酶的活化及细胞内pH值的改变所导致的蛋白质变性和异常聚集，减轻兴奋性神经毒性和缺血性神经元死亡[7]。HSP70进入核内与核糖体前体及其他核内蛋白结合，防止其变性引起细胞生命信息的紊乱[8]，从面对脑细胞产生保护作用。
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我们认为IL-1β、TNFα及NO参与了脑水肿的形成过程，热应激反应能诱导脑组织中HSP70明显增多，从而抑制上述炎症因子的活性，对感染性脑水肿有保护作用。热应激反应后脑组织中是否还产生其他物质，有待更深入地研究。
资金项目:国家自然科学基金资助 NO 39470233
参考文献
1 Liu Y,Kato H,Nakata N,et al.Temporal profile of heat shock protein 70 synthese in ischemic tolerance induced by preconditioning ischemia in rat hippocampus.Neuioscience,1993,56(4):921～927
2 陈 翔，杨于嘉，陶永光，等.百日咳杆菌诱导大鼠急性感染性脑水肿模型.湖南医科大学学报，1996；21(3)：214～216
, 百拇医药
3 萨姆布鲁克 J，费里奇才 EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1995：369～371，880～897
4 Yamage Y,Matsuura N,Shozuhara H,et al.Interleukin-1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats.Stroke ,1995；26(4):676～680
5 Selmaj KW,Raine CS.Tumor necrosis factor mediates myelin and oligodedrocyte damage in vitro.Ann Neurol,1988;23(4):339
6 Chao CC,Hu S,Erhlich L,et al.Interleukin-1 and tumor necrosis factor-α synergistiaclly mediate neurotoxicity:involvement of nitric oxide and N-methyl-D-asparate receptors.Brain Behav Immun,1995;9:355～365
7 Koroshetz WJ,Bonventre JV.Heat shock response in the central nervous system.Experientia,1994；50:1085～1091
8 张 荣，周范民.热休克蛋白与缺血性脑损伤.国外医学神经病学神经外科分册，1996；23(2)：57～60
1998-11-19收稿, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学湘雅医院儿科(长沙410008)
关键词：脑水肿；热休克蛋白；细胞因子；一氧化氮；大鼠
中国现代医学杂志990304 为了探讨热休克蛋白70(HSP70)对大鼠感染性脑水肿的保护作用，该文采用百日咳菌液所致的大鼠感染性脑水肿模型及将大鼠进行热休克处理，观察脑组织中白细胞介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及一氧化氮(NO)水平的变化，并应用Western印迹分析检测大鼠脑组织的HSP70表达。结果发现感染性脑水肿脑组织IL-1β、TNF-α及NO浓度均增高，热休克处理可降低以上三者的浓度，Western印迹分析显示热休克使大鼠脑组织中HSP70含量明显增多。结果提示热应激反应对大鼠感染性脑水肿的保护作用与脑组织中HSP70增多有关。
, 百拇医药 分类号 R-332
感染性脑水肿是儿科临床常见的综合征，发病快，病死率高。近年来研究发现热应激反应具有保护脑组织，抵抗进一步致死性损伤的作用，这一作用主要通过热休克蛋白70(HSP70)来实现[1]。但HSP70对感染性脑水肿的保护机制目前尚未完全阐明。本文在制作百日咳菌液致大鼠感染性脑水肿模型的基础上，采用热休克预处理诱导大鼠产生热应激反应，通过检测大鼠感染性脑水肿脑组织的HSP70表达及肿瘤坏死因子α(TNFα)白细胞介素1β(IL-1β)、一氧化氮(NO)的含量变化，以观察大鼠热应激反应后产生之HSP70对感染性脑水肿部分炎性因子的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
健康Sprague-Dawley大鼠，雌雄兼用，体重210±30g，共33只(其中9只用于Western印迹分析)。正常对照组：大鼠不作热休克预处理，置室温，24h后向左颈内动脉注入等量生理盐水；感染性脑水肿组：不作预处理，置室温，24h后向左颈内动脉注射百日咳菌液制作感染性脑水肿模型；热休克预处理组：大鼠用2%戊巴比妥钠麻醉后，置45℃水浴箱中，使其肛温升至42℃后转至42℃水浴箱中维持15min，然后置室温恢复24h后制作感染性脑水肿模型。
, 百拇医药
1.2 感染性脑水肿模型制备[2]
实验动物采用25%乌拉坦麻醉，3ml/kg腹腔注射。取仰卧位，颈正中切口，分离左侧颈总动脉，颈外动脉和颈内动脉及其分支，分别结扎翼腭动脉及枕动脉，在夹闭左颈外动脉后，感染性脑水肿组及热休克预处理组从左颈总动脉穿刺向左颈内动脉注入百日咳菌液0.2ml/kg，于10～15s注射完，正常对照组则用同法注射等量灭菌生理盐水，动物观察4h断头处死。
1.3 脑组织含水量测定
大鼠处死后立即开颅，快速取左大脑半球后部全层脑组织，电子分析天平称脑湿重，105℃干燥箱干至恒重，按公式：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)÷湿重×100%。
1.4 IL-1β、TNFα含量测定
采用双抗体夹心ELISA法测定IL-1β、TNFα含量，严格按照试剂盒说明进行操作，根据标准品的光密度值(A值)绘出标准曲线并计算出样品浓度，将稀释好的标准品及样品滴入相应的酶标板内，37℃孵育90min；洗板后每孔加入1：200的标记二抗0.1ml，37℃孵育60min，洗板后每孔加入1∶600酶联物0.1ml，37℃，30min；洗板后加底物0.1ml，避光15min后加入终止液0.05ml，以450nm滤光片酶标仪测A值，然后根据标准曲线计算出样品的IL-1β及TNFα含量。
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1.5 NO含量的测定
用200ml脑匀浆上清液与同体积的Griess液混合(1%对氨基苯磺酰胺+0.1%盐酸萘乙二胺+2.5%磷酸)，室温下孵育15min，然后通过721型分光光度计确是其545nm的吸光度值。以亚硝酸钠作为标准，间接测知每克脑组织中的NO含量。
1.6 Western印迹分析
按文献方法[3]稍作修改，制备脑组织蛋白质样品，定量后各组取100μg经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行转膜，使分离后的蛋白质样品转至硝酸纤维膜上，膜经1%BSA+Tween20封闭后，加抗HSP70的鼠IgG单抗(一抗)37℃，过夜，PBST洗膜后加AKP标记的羊抗鼠IgG抗体(二抗)，室温2h，洗膜，加入生色底物缓冲液进行显色反应，至蛋白条带显色清晰时，终止反应，拍摄照片，记录实验结果。重复3次，将照片结果用CS-930扫描仪进行密度分析。
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1.7 统计学处理
本文数据以均值±标准差(
±s)表示，多样本均数比较用方差分析。2 结果
2.1 脑组织含水量、IL-1β、TNF-α及NO含量测定结果
感染性脑水肿组与正常对照组比较，脑组织含水量，脑匀浆IL-1β、TNF-α及NO含量均明显增高(P<0.01)，热休克处理组与感染性脑水肿组相比可降低脑组织含水量、IL-1β、TNFα及NO含量(P<0.01或P<0.05) (见表1)。
表1 脑组织含水量IL-1β、TNF-α及NO含量测值(
±s) 组别, 百拇医药
N
脑含水量(%)
TNF-α(ng/g)
IL-1β(ng/g)
NO(nmol/g)
正常组
8
78.4±0.4
313.9±30.7
221.7±33.7
59.9±18.7
感脑组
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8
82.2±0.32)
762.8±84.92)
384.1±37.72)
106.0±13.81)
热休克组
8
79.6±0.33)
492.8±82.34)
306.7±58.63)
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71.1±16.63)
1) 与对照组比较 P<0.05
2) 与对照组比较 P<0.01
3) 与感染性脑水肿组组比较 P<0.05
4) 与感染性脑水肿组组比较 P<0.01
2.2 印迹分析
Western印迹分析发现，与正常对照组、感染性脑水肿组比较，热休克处理组脑组织中HSP70含量明显增多。经CS-930扫描仪定量分析，密度面积扫描显示正常对照组为(0.32±0.04)，感染性脑水肿组为(0.41±0.05)，热休克处理组为(1.50±0.33)，热休克处理组与感染性脑水肿组比较差异有高度显著性(P<0.01)。3 讨论
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急性感染性脑水肿既有血源性又有细胞毒性，属混合性脑水肿。本研究结果表明，感染性脑水肿组的IL-1β、TNFα及NO浓度均明显增加，提示上述炎症因子参与了百日咳菌液所致感染性脑水肿的病理过程。内毒素脂多糖(LPS)是IL-1β和TNFα生成的强烈激动剂，可刺激小胶质细胞产生IL-1β、TNFα，随着IL-1β的产生，其可刺激星形细胞的增生及TNFα的释放，还可以作为一种介质使脑组织水肿，最终影响脑功能[4]。TNFα的产生可加强内皮细胞的可渗透性，从而改变血脑屏障的通透性，促进炎症细胞进入神经组织内，TNFα还可使髓鞘损伤，少突胶质细胞溶解，导致细胞死亡[5]。同时IL-1β及TNFα两者共同作用，可通过NO的大量产生及NMDA受体的激活而引起神经细胞的损伤[6]。大量的NO的产生和释放可直接产生神经毒性，并且NO与过氧化物作用再生成更强毒性的羟基化物，加速了神经变性过程，从而也加速脑水肿的形成。
本实验证实热应激反应能降低脑组织含水量、IL-1β、TNFα及NO含量，提示对感染性脑水肿有保护作用。那么这一保护作用是通过何种途径来实现呢?本研究应用Western印迹分析表明热休克处理组大鼠脑组织中HSP70明显多于感染性脑水肿组及对照组，进一步证实HSP70能减轻脑水肿。HSP70是HSP中最丰富的一种，由热应激反应诱导表达，其合成增多对缺血神经元有保护作用[1]。HSP的保护机制可能通过避免由于氧自由基反应、蛋白酶和磷酯酶的活化及细胞内pH值的改变所导致的蛋白质变性和异常聚集，减轻兴奋性神经毒性和缺血性神经元死亡[7]。HSP70进入核内与核糖体前体及其他核内蛋白结合，防止其变性引起细胞生命信息的紊乱[8]，从面对脑细胞产生保护作用。
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我们认为IL-1β、TNFα及NO参与了脑水肿的形成过程，热应激反应能诱导脑组织中HSP70明显增多，从而抑制上述炎症因子的活性，对感染性脑水肿有保护作用。热应激反应后脑组织中是否还产生其他物质，有待更深入地研究。
资金项目:国家自然科学基金资助 NO 39470233
参考文献
1 Liu Y,Kato H,Nakata N,et al.Temporal profile of heat shock protein 70 synthese in ischemic tolerance induced by preconditioning ischemia in rat hippocampus.Neuioscience,1993,56(4):921～927
2 陈 翔，杨于嘉，陶永光，等.百日咳杆菌诱导大鼠急性感染性脑水肿模型.湖南医科大学学报，1996；21(3)：214～216
, 百拇医药
3 萨姆布鲁克 J，费里奇才 EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1995：369～371，880～897
4 Yamage Y,Matsuura N,Shozuhara H,et al.Interleukin-1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats.Stroke ,1995；26(4):676～680
5 Selmaj KW,Raine CS.Tumor necrosis factor mediates myelin and oligodedrocyte damage in vitro.Ann Neurol,1988;23(4):339
6 Chao CC,Hu S,Erhlich L,et al.Interleukin-1 and tumor necrosis factor-α synergistiaclly mediate neurotoxicity:involvement of nitric oxide and N-methyl-D-asparate receptors.Brain Behav Immun,1995;9:355～365
7 Koroshetz WJ,Bonventre JV.Heat shock response in the central nervous system.Experientia,1994；50:1085～1091
8 张 荣，周范民.热休克蛋白与缺血性脑损伤.国外医学神经病学神经外科分册，1996；23(2)：57～60
1998-11-19收稿, http://www.100md.com