p16与c-myc基因表达产物在肝细胞癌及癌旁组织中的表达及临床意义
作者：史宪杰 李开宗 窦科峰 高志清 张传山 胡沛臻 马福成
单位：第四军医大学西京医院肝胆外科病理科(西安710032)
关键词：
中国现代医学杂志990303 目的：探讨p16、c-myc蛋白与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生、发展及恶性程度的关系。方法：应用免疫组织化学法检测了69例HCC和63例癌旁组织p16及c-myc蛋白的表达，并结合临床资料进行分析。结果：p16蛋白主要分布在胞浆，少数细胞核内也可见阳性显色。c-myc蛋白主要分布在胞核。p16蛋白在肝癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为26.5%(18/69)和92%(58/63)，两者比较差异显著(P<0.01)。69例HCC标本，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中p16蛋白的检出率分别为52.6%(10/19)，23.3%(7/30)，5%(1/20)，p16蛋白在高分化HCC中的表达率明显高于低分化HCC组(P<0.05)。c-myc蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为85.5%(59/69)和39.7%(25/63)，两者比较差异显著(P<0.05)。结论：抑癌基因p16和c-myc基因的表达和分布与HCC发生、发展及临床预后有密切的关系。检测抑癌基因p16和c-myc基因对指导临床治疗有重要的参考价值。
, http://www.100md.com
分类号 R735.7
肿瘤的发生是一个多因素、多阶段作用过程，原癌基因及其激活形式的癌基因出现表达异常或其结构发生改变，以及抑癌基因的失活与突变，可导致细胞发生癌变。p16蛋白是近年发现的可与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合调节细胞周期的抑癌基因，当p16基因缺失或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变。c-myc是常见的激活癌基因。我们应用免疫组织化学技术检测了69例原发性肝细胞癌和63例癌旁肝细胞中p16和c-myc蛋白的分布与表达，对p16、c-myc基因与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展及恶性程度的关系并结合临床有关资料进行了探讨，报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本收集
69例HCC标本均为第四军医大学西京医院外科手术及活检标本，组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，分别作HE染色和免疫组织化学染色。根据WHO标准进行病理诊断与分级，其中Ⅰ级19例，Ⅱ级30例，Ⅲ级20例。
, 百拇医药
1.2 抗体与试剂
鼠抗p16及c-myc单克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology,Inc.DAKO En VisionTMSystem两步法免疫组织学染色试剂盒购自DAKO公司。
1.3 方法与步骤
石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，室温下10min，PBS振洗5min×3，浸泡于10mmol/L柠檬酸缓冲液中(pH6.0)，微波修复抗原10min，自然冷却至室温后蒸馏水洗涤，PBS振洗5min×3，10%正常山羊血清封闭非特异背景染色37℃30min，切片加鼠抗p16单克隆抗体(1：150)，鼠抗c-myc单克隆抗体(1：100)，4℃过夜，37℃复温30min，PBS振洗5min×3，切片加mouse En VisionTM37℃30min，PBS振洗5min×3，DAB显色，苏木精衬染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明树脂封片观察。
, 百拇医药
1.4 对照试验
阳性对照：用己知p16及c-myc阳性的切片重复染色；空白对照：用PBS代替第一抗体；替代对照：用正常鼠血清代替第一抗体。
2 结果
p16及c-myc蛋白免疫组织化学性阳性信号为棕黄色颗粒，p16蛋白主要分布在胞浆，少数细胞核内也可见阳性显色，c-myc蛋白主要分布在胞核。69例HCC标本中有63例带有癌旁组织，p16在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为26.5%(18/69)和92%(58/63)，两者比较差异显著(P<0.01)。根据WHO标准进行病理诊断与分级，69例HCC标本，其中Ⅰ级19例，Ⅱ级30例，Ⅲ级20例。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中p16蛋白的检率分别为52.6%(10/19)、23.3%(7/30)、5%(1/20)，p16在高分化HCC中的表达率明显高于低分化HCC组(P<0.05)。c-myc蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为85.5%(59/69)和39.7%(25/63)，两者比较差异显著(P<0.05)，而与HCC细胞分化程度呈负相关性(P<0.05)。实验数据的统计分析采用卡方检验。
, 百拇医药
3 讨论
1993年，Serrano[1]首先发现了一种新型抑癌基因p16可与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合调节细胞周期，干扰细胞周期素D与CDK4结合，阻止细胞从G1期进入S期。抑癌基因p16是正常细胞周期的调控者，当p16基因缺失或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变。研究表明，p16可直接作用于CDK4，从而影响Cyclin和p110RB的反馈回路，通过调节p110RB蛋白的活性，防止细胞增殖。而由CDK4和D型细胞周期蛋白构成的复合物很明显在G1期控制细胞的增殖[2]，p16与CDK4结合，抑制CDK4/CyclinD复合物的催化作用，使RB蛋白不被磷酸化，保持活性状态，阻止细胞分裂。而当p16由于基因突变或丢失而不能正常表达时，一方面不能竞争结合CDK4而阻止细胞分裂；另一方面，又增加了CyclinD同CDK4的结合，进一步刺激细胞分裂，而使细胞失去控制，向癌变发展[3]。本实验从蛋白质水平上发现p16在癌旁组织中(92%)表达阳性率比在癌组织(26.5%)高，在Ⅰ级(52.6%)、Ⅱ级(23.3%)HCC中表达阳性率高于Ⅲ级(5%)HCC，在高分化HCC中的表达率明显高于低分化HCC组(P<0.05)，说明p16蛋白对细胞周期抑制作用的丧失与HCC的发生及恶性程度关系较大，结合临床随访资料分析，p16蛋白的阳性率随着HCC分化程度降低而减少，恶性发展迅速，患者预后差。
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C-myc癌基因编码的蛋白为62KD的磷酸化蛋白，位于细胞核内，在所有具增殖潜力的细胞中均有表达，具有DNA结合能力，促进DNA复制，参与调节细胞增殖和分化[4，5]。Nisen等[6]证实某种肿瘤中c-myc基因激活时，可伴有c-myc蛋白的过量表达。在细胞增殖过程中，细胞增殖周期的G1期是影响细胞增殖速度的主要时相，调节细胞G1期向S期转化的因素包括正调节因子和负调节因子，c-myc蛋白是促使G1期向S期转化的调节因子[7]。本研究结果HCC中c-myc蛋白的表达很高(85.5%)，癌旁组织中的阳性率为39.7%(25/63)，两者比较差异显著(P<0.05)，且HCC中c-myc蛋白阳性率与细胞分化程度呈负相关性，即细胞分化越差，阳性率越高。加之p16蛋白的低水平表达，减少对CDK4的抑制，促进肿瘤的增长，这可能是HCC恶性增殖的部分原因。追踪临床病例随访资料(43例)，结合本组实验结果表明，绝大多数p16蛋白的低水平表达，c-myc蛋白高表达的病例，患者一般情况及肝功较差，HCC瘤体偏大，界限不清，预后不佳。所以，对p16和c-myc蛋白的临床检测对HCC的发展、恶性程度及预后的估计有一定重要的意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Serrano M,Hannon GJ,Beach DA.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4.Nature,1993;366:704
2 Hunter T.Breaking the cycle.Cell,1993;75:839
3 Marx J.New tumor suppressor may rival p53.Science,1994;264:344
4 Shibuya M,Yokota J,Ueyama Y.Amplication and expression of a cellular oncogene(c-myc) in human gastric carcinoma.Mol Cell Biol,1984;4:2486
, 百拇医药
5 Alitalo K,Schwab M,Lin M,et al.Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene(c-myc) in colon carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA,1983;80:1707
6 Nisen PD,Zimmerman KA,Cotter SV,et al.Enhanced expression of the N-myc gene in wilms tumors.Cancer Res,1986;46:6217
7 Askew DS,Ashmun RA,Simmons BC,et al.Constitutive c-myc expression in an IL-3-dependent myeloid cell line suppresses cell cycle arrest and acceleraters apoptosis.Oncogene,1991;6:1915
1998-12-02收稿, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院肝胆外科病理科(西安710032)
关键词：
中国现代医学杂志990303 目的：探讨p16、c-myc蛋白与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生、发展及恶性程度的关系。方法：应用免疫组织化学法检测了69例HCC和63例癌旁组织p16及c-myc蛋白的表达，并结合临床资料进行分析。结果：p16蛋白主要分布在胞浆，少数细胞核内也可见阳性显色。c-myc蛋白主要分布在胞核。p16蛋白在肝癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为26.5%(18/69)和92%(58/63)，两者比较差异显著(P<0.01)。69例HCC标本，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中p16蛋白的检出率分别为52.6%(10/19)，23.3%(7/30)，5%(1/20)，p16蛋白在高分化HCC中的表达率明显高于低分化HCC组(P<0.05)。c-myc蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为85.5%(59/69)和39.7%(25/63)，两者比较差异显著(P<0.05)。结论：抑癌基因p16和c-myc基因的表达和分布与HCC发生、发展及临床预后有密切的关系。检测抑癌基因p16和c-myc基因对指导临床治疗有重要的参考价值。
, http://www.100md.com
分类号 R735.7
肿瘤的发生是一个多因素、多阶段作用过程，原癌基因及其激活形式的癌基因出现表达异常或其结构发生改变，以及抑癌基因的失活与突变，可导致细胞发生癌变。p16蛋白是近年发现的可与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合调节细胞周期的抑癌基因，当p16基因缺失或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变。c-myc是常见的激活癌基因。我们应用免疫组织化学技术检测了69例原发性肝细胞癌和63例癌旁肝细胞中p16和c-myc蛋白的分布与表达，对p16、c-myc基因与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展及恶性程度的关系并结合临床有关资料进行了探讨，报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本收集
69例HCC标本均为第四军医大学西京医院外科手术及活检标本，组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，分别作HE染色和免疫组织化学染色。根据WHO标准进行病理诊断与分级，其中Ⅰ级19例，Ⅱ级30例，Ⅲ级20例。
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1.2 抗体与试剂
鼠抗p16及c-myc单克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology,Inc.DAKO En VisionTMSystem两步法免疫组织学染色试剂盒购自DAKO公司。
1.3 方法与步骤
石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，室温下10min，PBS振洗5min×3，浸泡于10mmol/L柠檬酸缓冲液中(pH6.0)，微波修复抗原10min，自然冷却至室温后蒸馏水洗涤，PBS振洗5min×3，10%正常山羊血清封闭非特异背景染色37℃30min，切片加鼠抗p16单克隆抗体(1：150)，鼠抗c-myc单克隆抗体(1：100)，4℃过夜，37℃复温30min，PBS振洗5min×3，切片加mouse En VisionTM37℃30min，PBS振洗5min×3，DAB显色，苏木精衬染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明树脂封片观察。
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1.4 对照试验
阳性对照：用己知p16及c-myc阳性的切片重复染色；空白对照：用PBS代替第一抗体；替代对照：用正常鼠血清代替第一抗体。
2 结果
p16及c-myc蛋白免疫组织化学性阳性信号为棕黄色颗粒，p16蛋白主要分布在胞浆，少数细胞核内也可见阳性显色，c-myc蛋白主要分布在胞核。69例HCC标本中有63例带有癌旁组织，p16在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为26.5%(18/69)和92%(58/63)，两者比较差异显著(P<0.01)。根据WHO标准进行病理诊断与分级，69例HCC标本，其中Ⅰ级19例，Ⅱ级30例，Ⅲ级20例。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中p16蛋白的检率分别为52.6%(10/19)、23.3%(7/30)、5%(1/20)，p16在高分化HCC中的表达率明显高于低分化HCC组(P<0.05)。c-myc蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为85.5%(59/69)和39.7%(25/63)，两者比较差异显著(P<0.05)，而与HCC细胞分化程度呈负相关性(P<0.05)。实验数据的统计分析采用卡方检验。
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3 讨论
1993年，Serrano[1]首先发现了一种新型抑癌基因p16可与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合调节细胞周期，干扰细胞周期素D与CDK4结合，阻止细胞从G1期进入S期。抑癌基因p16是正常细胞周期的调控者，当p16基因缺失或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变。研究表明，p16可直接作用于CDK4，从而影响Cyclin和p110RB的反馈回路，通过调节p110RB蛋白的活性，防止细胞增殖。而由CDK4和D型细胞周期蛋白构成的复合物很明显在G1期控制细胞的增殖[2]，p16与CDK4结合，抑制CDK4/CyclinD复合物的催化作用，使RB蛋白不被磷酸化，保持活性状态，阻止细胞分裂。而当p16由于基因突变或丢失而不能正常表达时，一方面不能竞争结合CDK4而阻止细胞分裂；另一方面，又增加了CyclinD同CDK4的结合，进一步刺激细胞分裂，而使细胞失去控制，向癌变发展[3]。本实验从蛋白质水平上发现p16在癌旁组织中(92%)表达阳性率比在癌组织(26.5%)高，在Ⅰ级(52.6%)、Ⅱ级(23.3%)HCC中表达阳性率高于Ⅲ级(5%)HCC，在高分化HCC中的表达率明显高于低分化HCC组(P<0.05)，说明p16蛋白对细胞周期抑制作用的丧失与HCC的发生及恶性程度关系较大，结合临床随访资料分析，p16蛋白的阳性率随着HCC分化程度降低而减少，恶性发展迅速，患者预后差。
, http://www.100md.com
C-myc癌基因编码的蛋白为62KD的磷酸化蛋白，位于细胞核内，在所有具增殖潜力的细胞中均有表达，具有DNA结合能力，促进DNA复制，参与调节细胞增殖和分化[4，5]。Nisen等[6]证实某种肿瘤中c-myc基因激活时，可伴有c-myc蛋白的过量表达。在细胞增殖过程中，细胞增殖周期的G1期是影响细胞增殖速度的主要时相，调节细胞G1期向S期转化的因素包括正调节因子和负调节因子，c-myc蛋白是促使G1期向S期转化的调节因子[7]。本研究结果HCC中c-myc蛋白的表达很高(85.5%)，癌旁组织中的阳性率为39.7%(25/63)，两者比较差异显著(P<0.05)，且HCC中c-myc蛋白阳性率与细胞分化程度呈负相关性，即细胞分化越差，阳性率越高。加之p16蛋白的低水平表达，减少对CDK4的抑制，促进肿瘤的增长，这可能是HCC恶性增殖的部分原因。追踪临床病例随访资料(43例)，结合本组实验结果表明，绝大多数p16蛋白的低水平表达，c-myc蛋白高表达的病例，患者一般情况及肝功较差，HCC瘤体偏大，界限不清，预后不佳。所以，对p16和c-myc蛋白的临床检测对HCC的发展、恶性程度及预后的估计有一定重要的意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Serrano M,Hannon GJ,Beach DA.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4.Nature,1993;366:704
2 Hunter T.Breaking the cycle.Cell,1993;75:839
3 Marx J.New tumor suppressor may rival p53.Science,1994;264:344
4 Shibuya M,Yokota J,Ueyama Y.Amplication and expression of a cellular oncogene(c-myc) in human gastric carcinoma.Mol Cell Biol,1984;4:2486
, 百拇医药
5 Alitalo K,Schwab M,Lin M,et al.Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene(c-myc) in colon carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA,1983;80:1707
6 Nisen PD,Zimmerman KA,Cotter SV,et al.Enhanced expression of the N-myc gene in wilms tumors.Cancer Res,1986;46:6217
7 Askew DS,Ashmun RA,Simmons BC,et al.Constitutive c-myc expression in an IL-3-dependent myeloid cell line suppresses cell cycle arrest and acceleraters apoptosis.Oncogene,1991;6:1915
1998-12-02收稿, 百拇医药