应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉素耐药基因型
作者：吴雪琼 张俊仙 庄玉辉 张晓刚 李国利 何秀云
单位：解放军三O九医院结核病研究室(北京 100091)
关键词：聚合酶链反应；单链构象多态性；限制性片段长度多态性；药物耐受性；分支杆菌；结核
中国现代医学杂志990301 目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况，建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过PCR-SSCP、PCR-RFLP和巢氏PCR-RFLP分析40株结核分支杆菌临床分离株和15例临床标本的rpsL基因突变的部位和性质。结果：10株药物敏感株的rpsL双链泳动正常、并可被MboⅡ消化；30株耐SM分离株中，25株双链泳动异常，24株不被消化；15例临床标本中，常规PCR扩增7例rpsL阳性，巢氏PCR 15例均阳性，4例rpsL双链泳动异常、并不被MboⅡ消化。结论：通过常规PCR-SSCP和PCR-RFLP可快速检测结核分支杆菌耐SM分离株43位密码子点突变，而通过巢氏PCR-RFLP可直接检测大多数临床标本中结核分支杆菌SM耐药基因型。
, 百拇医药
分类号 R378.91
我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，而常规的药敏试验方法需数周时间，BACTEC法也需7～10d，这不利于尽早开展有效的抗结核化疗，阻止耐药菌播散。因此，随着抗结核药物耐药分子机制的深入研究，建立了多种分子生物学技术检测结核分支杆菌的耐药基因型，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)-单链构象多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism,SSCP)分析[1，2]、PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析[3]、PCR-直接测序(Direct Sequencing,DS)法[4]等等，我们应用这三种方法直接检测结核分支杆菌临床分离株的耐药基因型均取得良好效果；但这些方法直接用于检测临床标本的敏感性还有待提高，它们只能检测涂片阳性的标本。鉴于链霉素(SM)耐药主要是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)突变所致，突变位点主要位于第43位密码子，结核分支杆菌SM敏感株在该位点是赖氨酸密码子(AAG)，有限制性内切酶MboⅡ的识别序列[GAAGGA(8/7)]，本课题应用巢氏PCR-RFLP分析结核分支杆菌临床分离株和直接分析临床标本中结核分支杆菌的rpsL基因，以探讨其作为新的分子药敏试验方法的应用价值。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌种、菌株和标本来源
16种分支杆菌和5种非分支杆菌标准株来源于中国药品生物制品鉴定所；40株结核分支杆菌临床分离株来源于河北省胸科医院，15例结核性痰和支气管灌洗液标本来自我院结核科根据X线检查、临床表现、结核病史、涂片、培养或抗结核疗效而确诊为肺结核的患者，目前患者均已好转出院。
1.2 细菌和临床标本DNA的制备
采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA，置-20℃保存备用。
1.3 涂片和培养
将临床标本按全国结核病细菌学检验标准化规程进行萋—尼氏抗酸染色镜检和分支杆菌培养，培养阳性的菌株进一步进行菌种鉴定和药敏试验。SM耐药标准：10μg/ml。
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1.4 常规PCR和巢氏PCR扩增
PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25μl反应体系中，4×dNTP的终浓度各为0.2mmol/L，引物(INS1、2，S1、2和S3、4)的终浓度各为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶1U。常规PCR时，纯化的DNA模板10～100ng或临床标本2～3μl；巢氏PCR扩增时，取常规PCR扩增产物1μl作为DNA模板。置DNA热循环仪扩增后，在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。引物INS1和INS2扩增结核分支杆菌插入序列IS986产生245bp片段[5]；根据结核分支杆菌rpsL基因序列(Genbank accession numble L08011)设计的一对外引物S1，2可扩增该基因序列产生267bp片段，一对内引物S3，4可扩增该基因序列产生215bp片段。
1.5 SSCP分析
PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染色后观察结果并照相。
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1.6 RFLP分析
限制性内切酶MboⅡ购自华美生物工程公司，酶切反应按厂家说明进行。引物S3，4的扩增片段经该酶消化后，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染色后观察结果。结核分支杆菌rpsL基因若无43位氨基酸密码子突变的菌株可被消化产生两个较小的片段(分别为160bp和55bp)；若有该位点突变的菌株不被消化，电泳仍可见215bp片段。
2 结果
2.1 结核分支杆菌临床分离株的药敏试验
在40株临床分离株中，药物敏感株10株；耐SM分离株30株。
2.2 结核性临床标本的涂片、培养和药敏试验
15例结核性临床标本中，2例涂片和培养阳性、药敏试验为耐SM，RFP和INH，3例涂片阳性而培养阴性，10例涂片和培养均阴性。
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2.3 结核分支杆菌rpsL基因PCR引物的特异性
取受试菌种DNA 20ng分别与引物S1和S2进行PCR扩增，结果见附表。除结核分支杆菌和淡黄分支杆菌可见267bp扩增带外，其余14种受试分支杆菌和5种非分支杆菌均未见该片段。
附表 结核分支杆菌rpsL基因PCR扩增的特异性 菌种名称
rpsL基因
1 结核分支杆菌
+
2 牛分支杆菌
-
3 鸟分支杆菌
-
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4 胞内分支杆菌
-
5 瘰疬分支杆菌
-
6 堪萨斯分支杆菌
-
7 次要分支杆菌
-
8 胃分支杆菌
-
9 偶然分支杆菌
-
10 母牛分支杆菌
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-
11 浅黄分支杆菌
+
12 戈登分支杆菌
-
13 龟分支杆菌龟亚种
-
14 耻垢分支杆菌
-
15 迪氏分支杆菌
-
16 猿猴分支杆菌
-
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17 绿脓杆菌
-
18 绿球菌
-
19 甲型链球菌
-
20 诺卡氏菌
-
21 金黄色葡萄球菌
-
注：+：PCR扩增阳性；-：PCR扩增阴性。
2.4 常规PCR，SSCP和RFLP分析
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以结核分支杆菌标准株DNA为对照，用引物INS1和INS2扩增上述40株结核分支杆菌分离株和15例临床标本DNA均产生245bp片段，进一步证明这些分离株均为结核分支杆菌，这些标本中均存在结核分支杆菌。
用外部引物S1和S2扩增上述分离株均产生267bp片段，说明rpsL基因片段扩增成功；但扩增临床标本仅7例为阳性，余均为阴性。
将rpsL 267bp扩增片段进行SSCP和RFLP分析显示，10株药物敏感株的rpsL双链泳动正常、并可被MboⅡ消化；30株耐SM分离株中，25株(83.3%)rpsL双链泳动异常，24株(80.0%)不被MboⅡ消化；7例临床标本中，4例rpsL双链泳动异常、并不被MboⅡ消化。
2.5 巢氏PCR，SSCP和RFLP分析
以结核分支杆菌标准株rpsL基因为对照，用内部引物S3和S4对外部引物S1和S2扩增产物进一步进行巢氏PCR扩增，40株分离株和15例临床标本均扩增产生215bp的rpsL片段。
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rpsL 215bp片段反复进行SSCP分析，发现无论是敏感株还是耐药株巢氏PCR扩增产物均很容易出现双链泳动异常，条带多，重复性差。但进行RFLP分析结果较理想，40株分离株的巢氏PCR-RFLP结果与常规PCR-RFLP完全一致；15例临床标本中，仅4例不被MboⅡ消化(同常规PCR-RFLP)，余均可被消化。
3 讨论
结核分支杆菌耐SM的分子机制已较清楚，应用多种基因突变检测技术可直接检测结核分支杆菌临床分离株的耐药基因型。
临床标本中含菌量较少，由于引物INS扩增的是结核分支杆菌的插入序列，具有较多的拷贝数，通常可灵敏地扩增出结核分支杆菌的基因；而rpsL基因只有一个拷贝，常规PCR扩增的阳性率较低，只有通过巢氏PCR再次扩增才能提高临床标本rpsL的阳性率。由于普通的Taq DNA聚合酶在扩增过程中的错误掺入，经过两次扩增后，产生的序列的错误率较高，而SSCP可灵敏地分析出序列中一个碱基的突变，因此，通过巢氏PCR-SSCP较难于正常地分析基因突变，若采用高质量的(如测序级的)Taq DNA聚合酶也许可提高准确率。RFLP是分析特定部位基因突变的检测技术，本文的结果表明巢氏PCR的错误扩增不影响RFLP的分析结果。因此，巢氏PCR-RFLP可灵敏、特异地直接分析临床标本中SM的耐药基因型。
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参考文献
1 Honore N,Cole ST.Streptomycin resistance in mycobacteria.Antimicrob.Agents Chemother,1994；38:238
2 吴雪琼，庄玉辉，张晓刚，等.应用PCR-SSCP检测结核分支杆菌链霉素耐药基因的研究.中国现代医学杂志，1997；7：12
3 Nair J,Rouse DA,Bai GH,et al.The rpsL gene and streptomycin resistance in single and multiple drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.Mol.Microbiol,1993；10：521
4 Morris S,Bai GH,Suffys R,et al.Molecular mechanismas of multiple drug resistance in clinical isolates of mycobaterium tuberculosis.JID,1995；171：954
5 吴雪琼，庄玉辉，张晓刚，等.PCR和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究.中华结核和呼吸杂志，1996：37
1998-10-07收稿, 百拇医药
单位：解放军三O九医院结核病研究室(北京 100091)
关键词：聚合酶链反应；单链构象多态性；限制性片段长度多态性；药物耐受性；分支杆菌；结核
中国现代医学杂志990301 目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况，建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过PCR-SSCP、PCR-RFLP和巢氏PCR-RFLP分析40株结核分支杆菌临床分离株和15例临床标本的rpsL基因突变的部位和性质。结果：10株药物敏感株的rpsL双链泳动正常、并可被MboⅡ消化；30株耐SM分离株中，25株双链泳动异常，24株不被消化；15例临床标本中，常规PCR扩增7例rpsL阳性，巢氏PCR 15例均阳性，4例rpsL双链泳动异常、并不被MboⅡ消化。结论：通过常规PCR-SSCP和PCR-RFLP可快速检测结核分支杆菌耐SM分离株43位密码子点突变，而通过巢氏PCR-RFLP可直接检测大多数临床标本中结核分支杆菌SM耐药基因型。
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分类号 R378.91
我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，而常规的药敏试验方法需数周时间，BACTEC法也需7～10d，这不利于尽早开展有效的抗结核化疗，阻止耐药菌播散。因此，随着抗结核药物耐药分子机制的深入研究，建立了多种分子生物学技术检测结核分支杆菌的耐药基因型，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)-单链构象多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism,SSCP)分析[1，2]、PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析[3]、PCR-直接测序(Direct Sequencing,DS)法[4]等等，我们应用这三种方法直接检测结核分支杆菌临床分离株的耐药基因型均取得良好效果；但这些方法直接用于检测临床标本的敏感性还有待提高，它们只能检测涂片阳性的标本。鉴于链霉素(SM)耐药主要是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)突变所致，突变位点主要位于第43位密码子，结核分支杆菌SM敏感株在该位点是赖氨酸密码子(AAG)，有限制性内切酶MboⅡ的识别序列[GAAGGA(8/7)]，本课题应用巢氏PCR-RFLP分析结核分支杆菌临床分离株和直接分析临床标本中结核分支杆菌的rpsL基因，以探讨其作为新的分子药敏试验方法的应用价值。
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1 材料与方法
1.1 菌种、菌株和标本来源
16种分支杆菌和5种非分支杆菌标准株来源于中国药品生物制品鉴定所；40株结核分支杆菌临床分离株来源于河北省胸科医院，15例结核性痰和支气管灌洗液标本来自我院结核科根据X线检查、临床表现、结核病史、涂片、培养或抗结核疗效而确诊为肺结核的患者，目前患者均已好转出院。
1.2 细菌和临床标本DNA的制备
采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA，置-20℃保存备用。
1.3 涂片和培养
将临床标本按全国结核病细菌学检验标准化规程进行萋—尼氏抗酸染色镜检和分支杆菌培养，培养阳性的菌株进一步进行菌种鉴定和药敏试验。SM耐药标准：10μg/ml。
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1.4 常规PCR和巢氏PCR扩增
PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25μl反应体系中，4×dNTP的终浓度各为0.2mmol/L，引物(INS1、2，S1、2和S3、4)的终浓度各为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶1U。常规PCR时，纯化的DNA模板10～100ng或临床标本2～3μl；巢氏PCR扩增时，取常规PCR扩增产物1μl作为DNA模板。置DNA热循环仪扩增后，在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。引物INS1和INS2扩增结核分支杆菌插入序列IS986产生245bp片段[5]；根据结核分支杆菌rpsL基因序列(Genbank accession numble L08011)设计的一对外引物S1，2可扩增该基因序列产生267bp片段，一对内引物S3，4可扩增该基因序列产生215bp片段。
1.5 SSCP分析
PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染色后观察结果并照相。
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1.6 RFLP分析
限制性内切酶MboⅡ购自华美生物工程公司，酶切反应按厂家说明进行。引物S3，4的扩增片段经该酶消化后，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染色后观察结果。结核分支杆菌rpsL基因若无43位氨基酸密码子突变的菌株可被消化产生两个较小的片段(分别为160bp和55bp)；若有该位点突变的菌株不被消化，电泳仍可见215bp片段。
2 结果
2.1 结核分支杆菌临床分离株的药敏试验
在40株临床分离株中，药物敏感株10株；耐SM分离株30株。
2.2 结核性临床标本的涂片、培养和药敏试验
15例结核性临床标本中，2例涂片和培养阳性、药敏试验为耐SM，RFP和INH，3例涂片阳性而培养阴性，10例涂片和培养均阴性。
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2.3 结核分支杆菌rpsL基因PCR引物的特异性
取受试菌种DNA 20ng分别与引物S1和S2进行PCR扩增，结果见附表。除结核分支杆菌和淡黄分支杆菌可见267bp扩增带外，其余14种受试分支杆菌和5种非分支杆菌均未见该片段。
附表 结核分支杆菌rpsL基因PCR扩增的特异性 菌种名称
rpsL基因
1 结核分支杆菌
+
2 牛分支杆菌
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3 鸟分支杆菌
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4 胞内分支杆菌
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5 瘰疬分支杆菌
-
6 堪萨斯分支杆菌
-
7 次要分支杆菌
-
8 胃分支杆菌
-
9 偶然分支杆菌
-
10 母牛分支杆菌
, 百拇医药
-
11 浅黄分支杆菌
+
12 戈登分支杆菌
-
13 龟分支杆菌龟亚种
-
14 耻垢分支杆菌
-
15 迪氏分支杆菌
-
16 猿猴分支杆菌
-
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17 绿脓杆菌
-
18 绿球菌
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19 甲型链球菌
-
20 诺卡氏菌
-
21 金黄色葡萄球菌
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注：+：PCR扩增阳性；-：PCR扩增阴性。
2.4 常规PCR，SSCP和RFLP分析
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以结核分支杆菌标准株DNA为对照，用引物INS1和INS2扩增上述40株结核分支杆菌分离株和15例临床标本DNA均产生245bp片段，进一步证明这些分离株均为结核分支杆菌，这些标本中均存在结核分支杆菌。
用外部引物S1和S2扩增上述分离株均产生267bp片段，说明rpsL基因片段扩增成功；但扩增临床标本仅7例为阳性，余均为阴性。
将rpsL 267bp扩增片段进行SSCP和RFLP分析显示，10株药物敏感株的rpsL双链泳动正常、并可被MboⅡ消化；30株耐SM分离株中，25株(83.3%)rpsL双链泳动异常，24株(80.0%)不被MboⅡ消化；7例临床标本中，4例rpsL双链泳动异常、并不被MboⅡ消化。
2.5 巢氏PCR，SSCP和RFLP分析
以结核分支杆菌标准株rpsL基因为对照，用内部引物S3和S4对外部引物S1和S2扩增产物进一步进行巢氏PCR扩增，40株分离株和15例临床标本均扩增产生215bp的rpsL片段。
, http://www.100md.com
rpsL 215bp片段反复进行SSCP分析，发现无论是敏感株还是耐药株巢氏PCR扩增产物均很容易出现双链泳动异常，条带多，重复性差。但进行RFLP分析结果较理想，40株分离株的巢氏PCR-RFLP结果与常规PCR-RFLP完全一致；15例临床标本中，仅4例不被MboⅡ消化(同常规PCR-RFLP)，余均可被消化。
3 讨论
结核分支杆菌耐SM的分子机制已较清楚，应用多种基因突变检测技术可直接检测结核分支杆菌临床分离株的耐药基因型。
临床标本中含菌量较少，由于引物INS扩增的是结核分支杆菌的插入序列，具有较多的拷贝数，通常可灵敏地扩增出结核分支杆菌的基因；而rpsL基因只有一个拷贝，常规PCR扩增的阳性率较低，只有通过巢氏PCR再次扩增才能提高临床标本rpsL的阳性率。由于普通的Taq DNA聚合酶在扩增过程中的错误掺入，经过两次扩增后，产生的序列的错误率较高，而SSCP可灵敏地分析出序列中一个碱基的突变，因此，通过巢氏PCR-SSCP较难于正常地分析基因突变，若采用高质量的(如测序级的)Taq DNA聚合酶也许可提高准确率。RFLP是分析特定部位基因突变的检测技术，本文的结果表明巢氏PCR的错误扩增不影响RFLP的分析结果。因此，巢氏PCR-RFLP可灵敏、特异地直接分析临床标本中SM的耐药基因型。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Honore N,Cole ST.Streptomycin resistance in mycobacteria.Antimicrob.Agents Chemother,1994；38:238
2 吴雪琼，庄玉辉，张晓刚，等.应用PCR-SSCP检测结核分支杆菌链霉素耐药基因的研究.中国现代医学杂志，1997；7：12
3 Nair J,Rouse DA,Bai GH,et al.The rpsL gene and streptomycin resistance in single and multiple drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.Mol.Microbiol,1993；10：521
4 Morris S,Bai GH,Suffys R,et al.Molecular mechanismas of multiple drug resistance in clinical isolates of mycobaterium tuberculosis.JID,1995；171：954
5 吴雪琼，庄玉辉，张晓刚，等.PCR和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究.中华结核和呼吸杂志，1996：37
1998-10-07收稿, 百拇医药