高原RDS表面活性物质相关蛋白A、B、C mRNA表达的变化
作者：崔社怀 郭先健 钱桂生
单位：崔社怀 第三军医大学附属西南医院呼吸内科 重庆，400038；郭先健 钱桂生 第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
关键词：低氧；肺表面活性物质相关蛋白；基因表达；呼吸窘迫综合征
提要 目的
提要 目的：观察高原RDS时SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达与影响因素，了解其变化情况，并探讨其在急性肺损伤中的作用机制及意义。方法：采用高原RDS动物模型，利用分子生物学技术观察肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性蛋白及其基因的表达。结果：SP-A、SP-B和SP-C斑点杂交结果表明，油酸组SP-A，SP-B和SP-C mRNA表达的相对含量均显著低于对照组。油酸可抑制SP-A，SP-B和SP-C mRNA在高原RDS中的表达。结论：高原RDS后SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达明显减低，油酸可抑制SP-A，SP-B和SP-C mRNA在高原RDS中的表达。与油酸的直接毒性作用和油酸引起的肺水肿，肺泡腔渗出大量的水肿液及血浆蛋白有关。
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中图法分类号 R563.02
Expression of pulmonary surfactant associated protein A, B and C mRNA in plateau ARDS*
Cui Shehuai, Guo Xianjian, Qian Guisheng
(Department of Respiratory Disease of Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract Objection: To study the expression and regulation of pulmonary surfactant associated protein A, B and C mRNA on oleic acid-induced model of RDS of rats under acute hypoxia. Meanwhile, the mechanism of the changes was investigated. Methods: Rats were placed in hypobaric chamber for 12 h and then oleic acid was injected into the superior vena cava to induce RDS. The expression of pulmonary surfactant associated protein A, B and C mRNA was observed with the method of dot blot hybridization. Results: Oleic acid could inhibit the expression of surfactant associated proteins since SP-A, SP-B and SP-C mRNA were expressed significantly lower in the group receiving loeic acid injection. Conclusion: Oleic acid can inhibit the expression of SP-A, SP-B and SP-C mRNA in hypoxic rats with pulmonary injury.
, 百拇医药
Key words hypoxia; surfactant associated proteins; gene expression; respiratory distress syndrome
表面活性物质相关蛋白(SP)A、B和C(SP-A、SP-B、SP-C)在急性肺损伤或ARDS中的作用、调控和意义等方面的研究，国内外报道不多。故我们对高原RDS时SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达与影响因素进行探讨。
1 材料与方法
1.1 动物模型
实验动物随机分为对照组和油酸组。每次3～4只Wistar大鼠放入小动物低压舱内，自由饮水，匀速减压模拟海拔6000 m高度(约30 min)至，减压12 h。从低压舱取出小动物，用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)，然后行气管、颈总动脉和颈外静脉插管。手术完毕后先给大鼠吸入9.78%O2混合气体，使其低氧状态与减压仓内相同，30 min后开始实验。抽对照血气后，立即从上腔静脉注入油酸，剂量为10～15 μl/100 g体重，15 min注完。对照组注入同等剂量生理盐水。肺组织总RNA提取，按文献[1]进行。紫外分光光度计定量RNA及判定其纯度。肺组织SP-A、SP-B和SP-C mRNA斑点杂交基本按文献[2]进行。探针标记按Prome-a-Gene Labeling System试剂盒说明书进行，并加到自制的Sephadex G50柱上进行纯化。放射自显影：用滤纸吸去NC膜上大部分水分，封于塑料袋，放入暗盒中，-70℃放射自显影72 h。定量分析：放射自显影结果(胶片)置薄层扫描仪上(日本道津 GS9000)，根据自显影的面积和密度以及标准Marker的含量，计算出各样品所含mRNA的总量。统计分析：采用方差分析对数据进行统计分析。
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1.2 SP-A、SP-B、SP-C cDNA探针的制备
基本按分子克隆有关章节[3]。
1.3 PGEM 4Z质粒的转化
基本参照Dower的方法[4]。
1.4 试剂
质粒PGEM 4Z质粒三种，由美国Fisher教授惠赠。λDNAa/Hind Ⅲ marker华美生物工程公司。异硫氰酸胍，焦碳二(DEPC)，十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)美国Sigma公司产品。电泳级琼脂糖，北京中山公司产品。十二烷基硫酸钠(SDS)美国Sigma公司产品。鲑精DNA华美生物工程公司产品。Ficoll 400美国Sigma公司产品。同位素随机引物标记试剂盒美国Promega公司产品。其它试剂，精解蛋白胨，酵母浸出粉、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等均为国产分析纯。
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1.5 主要仪器
754型紫外分光光度计上海分析仪器厂，低温高速离心机湖南湘仪。基因枪(Pulse Generator)美国Bio-Rad公司制造。
2 结果
经细菌转化、扩增、提取的PGEM 4Z质粒，用Eco RI酶切同时用λDNA/Hind Ⅲ Marker标定。异硫氰酸胍-酚-氯仿/异戊醇一步法提取肺组织总RNA，经754型分光光度计测定Dλ值并判定纯度。其纯度为D260/280>1.8。油酸组SP-A mRNA表达的相对含量显著低于对照组。油酸组SP-B mRNA相对含量与对照组比显著降低(P<0.05)。与SP-A和SP-B mRNA表达的情形相同，SP-C mRNA的表达在对照组显著高于油酸组(P<0.05)。余各组间比较差异均不显著(P>0.05)，见表1。
表1 高原RDS肺组织SP-A、SP-B and SP-C mRNA相对含量的比较(ρB/pg.μl-1，x±s)
, 百拇医药
Tab 1 The results for expression of SP-A、SP-B and SP-C mRNA in the lung of RDS in plateau(ρB/pg.μl-1，x±s)
Group
n
SP-A
SP-B
SP-C
Control
12
181.90±32.06
, 百拇医药 757.98±96.21
2252.01±153.77
Oleic acid
8
100.44±23.12*
367.71±91.61*
852.72±131.34*
*:P<0.05 vs control
3 讨论
目前发现的SP共有4种，根据其结构不同分为SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。根据功能分为亲水性的SP-A和SP-D，疏水性的SP-B和SP-C[5，6]。由于SP-、SP-B和SP-C主要影响肺表面活性物质(Pulmonary surfactant,PS)的生物物理特性，与临床关系密切，所以其研究也较深入。但该类研究主要集中于因PS生成不足所致的新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)[7]。在高原RDS时该三种蛋白的变化国内外尚无文献。本研究的斑点杂交结果均发现油酸组SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达均显著低于对照组，Huang等[8]采用高浓度氧致肺损伤，观察SP-A mRNA表达的变化时发现，SP-A mRNA在该类肺损伤时表达明显降低。而且在NRDS患儿的RALF中，SP-A、SP-B和SP-C的含量极低，甚至不能测出[9]。在ARDS和多发性创伤患者的BALF中SP-A的含量也呈类似变化[10]。ARDS和NRDS时SP-B mRNA的表达同样受到抑制。无论是SP基因的抑制还是BALF中含量降低，均严重影响了PS的功能，导致肺表面张力的增加和微肺不张。
, 百拇医药
严重的低氧血症，肺组织细胞损伤及胞内酶活性降低，功能异常，可能是高原RDS SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低的原因之一。油酸是否对三种表面活性物质相关蛋白即SP-A、SP-B和SP-C mRNA的表达产生影响，尚无直接证据。但大量的资料表明，油酸对肺毛细血管内皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞等有直接毒性作用[11]。我们既往研究资料证明[12]，油酸急性肺损伤模型中可见肺泡Ⅱ型上皮细胞空泡变，内质网扩张，核周间隙加大，板层体排空，线粒体肿胀等改变。这些改变可能是导致SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低的形态学基础。由于产生SP的主要细胞肺泡Ⅱ型上皮细胞的变性，故不可避免地影响了SP的表达，可能是SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低的又一原因。SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低还可能与油酸引起的肺水肿，肺泡腔渗出大量的水肿液及血浆蛋白有关。我们另一组研究结果提示，油酸注入后，部分试验动物可见经口鼻涌出大量粉红色水肿液，病理检查见肺泡腔同样存在大量水肿液[13]。据认为，血浆蛋白是最早发现对PS活性有抑制作用，其抑制原理是与气/液面的PS竞争并干扰S单分子层的形成[14]。血浆蛋白渗出到肺泡腔不仅增加了肺泡表面张力，而且其中的纤维素单体(纤维蛋白降解产物)对PS具有强烈的抑制作用。
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国家自然科学基金资助项目，No.39670336
作者简介：崔社怀，男，43岁，副教授，副主任医师，博士
参考文献
1 Chomczynski P， Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochem,1987，162(1):156
2 蔡文琴，王伯主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.492～503
3 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学出版社，1992.26～29
, http://www.100md.com
4 Dower W J, Miller J F. High efficiency transformation of E coli by high voltage electroporation. Nucle Acid Res,1988，16(6):6127
5 Sarin V K, Gupta S, Leung T K，et al. Biophysical and biochemical activity of a synthetic 8.7 kDa hydrophobic pulmonary surfactant protein SP-B. Proc Natl Acad Sci USA,1990，87(7):2633
6 Yamada T, Kegami N, Tabor B L，et al. Effects of surfactant protein A on surfactant function in preterm ventilated rabbit. Am Rev Respir Dis,1990，142(4):754
, 百拇医药
7 Cleary J P, Berstein G, Mannino F, et al. Improved oxygenation during synchronized intermittent mandatory ventilation in neonates with respiratory distress syndrome:a randomized, crossover study. J Pediate,1995，126(3):407
8 Huang Y C T, Caminiti S P, Fawcett T A， et al. Natural surfactant and hyperoxic lung injury in primates. I Physiology and biochemistry. J Appl Physiol,1994，76(3):991
9 Moya F R, Montes H F, Thomas V L， et al. Surfactant protein A and saturated Phosphatidylcholine in respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med,1994，150(5):1672
, 百拇医药
10 Pison U, Obertacke U, Seeger W， et al. Surfactant protein A(SP-A) is decreased in acute parenchymal lung injury associated with polytrauma. Eur J Clin Invest,1992，22(4):712
11 Olanoff L S, Reines D, Spicer K M， et al. Effects of oleic acid on pulmonary capillary leak and thromboxanes. J Surgic Res,1984，36(6):597
12 崔社怀，毛宝龄，郭先健，等.油酸致犬肺损伤的血栓素和前列环素的研究.中华结核和呼吸杂志，1989，12(1)：24
13 崔社怀，郭先健.急性低氧复合油酸大鼠肺损伤模型的复制及PTX的治疗作用。中国病理生理杂志，1999，15(2)：150
14 Holm B A, Matalon S. Role of pulmonary surfactant in the development and treatment of aduot respiratory distress synrome. Anesth Analg,1989，69(6):805
(收稿：1998-05-09；修回：1999-01-15), 百拇医药
单位：崔社怀 第三军医大学附属西南医院呼吸内科 重庆，400038；郭先健 钱桂生 第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
关键词：低氧；肺表面活性物质相关蛋白；基因表达；呼吸窘迫综合征
提要 目的
提要 目的：观察高原RDS时SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达与影响因素，了解其变化情况，并探讨其在急性肺损伤中的作用机制及意义。方法：采用高原RDS动物模型，利用分子生物学技术观察肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性蛋白及其基因的表达。结果：SP-A、SP-B和SP-C斑点杂交结果表明，油酸组SP-A，SP-B和SP-C mRNA表达的相对含量均显著低于对照组。油酸可抑制SP-A，SP-B和SP-C mRNA在高原RDS中的表达。结论：高原RDS后SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达明显减低，油酸可抑制SP-A，SP-B和SP-C mRNA在高原RDS中的表达。与油酸的直接毒性作用和油酸引起的肺水肿，肺泡腔渗出大量的水肿液及血浆蛋白有关。
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中图法分类号 R563.02
Expression of pulmonary surfactant associated protein A, B and C mRNA in plateau ARDS*
Cui Shehuai, Guo Xianjian, Qian Guisheng
(Department of Respiratory Disease of Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract Objection: To study the expression and regulation of pulmonary surfactant associated protein A, B and C mRNA on oleic acid-induced model of RDS of rats under acute hypoxia. Meanwhile, the mechanism of the changes was investigated. Methods: Rats were placed in hypobaric chamber for 12 h and then oleic acid was injected into the superior vena cava to induce RDS. The expression of pulmonary surfactant associated protein A, B and C mRNA was observed with the method of dot blot hybridization. Results: Oleic acid could inhibit the expression of surfactant associated proteins since SP-A, SP-B and SP-C mRNA were expressed significantly lower in the group receiving loeic acid injection. Conclusion: Oleic acid can inhibit the expression of SP-A, SP-B and SP-C mRNA in hypoxic rats with pulmonary injury.
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Key words hypoxia; surfactant associated proteins; gene expression; respiratory distress syndrome
表面活性物质相关蛋白(SP)A、B和C(SP-A、SP-B、SP-C)在急性肺损伤或ARDS中的作用、调控和意义等方面的研究，国内外报道不多。故我们对高原RDS时SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达与影响因素进行探讨。
1 材料与方法
1.1 动物模型
实验动物随机分为对照组和油酸组。每次3～4只Wistar大鼠放入小动物低压舱内，自由饮水，匀速减压模拟海拔6000 m高度(约30 min)至，减压12 h。从低压舱取出小动物，用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)，然后行气管、颈总动脉和颈外静脉插管。手术完毕后先给大鼠吸入9.78%O2混合气体，使其低氧状态与减压仓内相同，30 min后开始实验。抽对照血气后，立即从上腔静脉注入油酸，剂量为10～15 μl/100 g体重，15 min注完。对照组注入同等剂量生理盐水。肺组织总RNA提取，按文献[1]进行。紫外分光光度计定量RNA及判定其纯度。肺组织SP-A、SP-B和SP-C mRNA斑点杂交基本按文献[2]进行。探针标记按Prome-a-Gene Labeling System试剂盒说明书进行，并加到自制的Sephadex G50柱上进行纯化。放射自显影：用滤纸吸去NC膜上大部分水分，封于塑料袋，放入暗盒中，-70℃放射自显影72 h。定量分析：放射自显影结果(胶片)置薄层扫描仪上(日本道津 GS9000)，根据自显影的面积和密度以及标准Marker的含量，计算出各样品所含mRNA的总量。统计分析：采用方差分析对数据进行统计分析。
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1.2 SP-A、SP-B、SP-C cDNA探针的制备
基本按分子克隆有关章节[3]。
1.3 PGEM 4Z质粒的转化
基本参照Dower的方法[4]。
1.4 试剂
质粒PGEM 4Z质粒三种，由美国Fisher教授惠赠。λDNAa/Hind Ⅲ marker华美生物工程公司。异硫氰酸胍，焦碳二(DEPC)，十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)美国Sigma公司产品。电泳级琼脂糖，北京中山公司产品。十二烷基硫酸钠(SDS)美国Sigma公司产品。鲑精DNA华美生物工程公司产品。Ficoll 400美国Sigma公司产品。同位素随机引物标记试剂盒美国Promega公司产品。其它试剂，精解蛋白胨，酵母浸出粉、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等均为国产分析纯。
, http://www.100md.com
1.5 主要仪器
754型紫外分光光度计上海分析仪器厂，低温高速离心机湖南湘仪。基因枪(Pulse Generator)美国Bio-Rad公司制造。
2 结果
经细菌转化、扩增、提取的PGEM 4Z质粒，用Eco RI酶切同时用λDNA/Hind Ⅲ Marker标定。异硫氰酸胍-酚-氯仿/异戊醇一步法提取肺组织总RNA，经754型分光光度计测定Dλ值并判定纯度。其纯度为D260/280>1.8。油酸组SP-A mRNA表达的相对含量显著低于对照组。油酸组SP-B mRNA相对含量与对照组比显著降低(P<0.05)。与SP-A和SP-B mRNA表达的情形相同，SP-C mRNA的表达在对照组显著高于油酸组(P<0.05)。余各组间比较差异均不显著(P>0.05)，见表1。
表1 高原RDS肺组织SP-A、SP-B and SP-C mRNA相对含量的比较(ρB/pg.μl-1，x±s)
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Tab 1 The results for expression of SP-A、SP-B and SP-C mRNA in the lung of RDS in plateau(ρB/pg.μl-1，x±s)
Group
n
SP-A
SP-B
SP-C
Control
12
181.90±32.06
, 百拇医药 757.98±96.21
2252.01±153.77
Oleic acid
8
100.44±23.12*
367.71±91.61*
852.72±131.34*
*:P<0.05 vs control
3 讨论
目前发现的SP共有4种，根据其结构不同分为SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。根据功能分为亲水性的SP-A和SP-D，疏水性的SP-B和SP-C[5，6]。由于SP-、SP-B和SP-C主要影响肺表面活性物质(Pulmonary surfactant,PS)的生物物理特性，与临床关系密切，所以其研究也较深入。但该类研究主要集中于因PS生成不足所致的新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)[7]。在高原RDS时该三种蛋白的变化国内外尚无文献。本研究的斑点杂交结果均发现油酸组SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达均显著低于对照组，Huang等[8]采用高浓度氧致肺损伤，观察SP-A mRNA表达的变化时发现，SP-A mRNA在该类肺损伤时表达明显降低。而且在NRDS患儿的RALF中，SP-A、SP-B和SP-C的含量极低，甚至不能测出[9]。在ARDS和多发性创伤患者的BALF中SP-A的含量也呈类似变化[10]。ARDS和NRDS时SP-B mRNA的表达同样受到抑制。无论是SP基因的抑制还是BALF中含量降低，均严重影响了PS的功能，导致肺表面张力的增加和微肺不张。
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严重的低氧血症，肺组织细胞损伤及胞内酶活性降低，功能异常，可能是高原RDS SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低的原因之一。油酸是否对三种表面活性物质相关蛋白即SP-A、SP-B和SP-C mRNA的表达产生影响，尚无直接证据。但大量的资料表明，油酸对肺毛细血管内皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞等有直接毒性作用[11]。我们既往研究资料证明[12]，油酸急性肺损伤模型中可见肺泡Ⅱ型上皮细胞空泡变，内质网扩张，核周间隙加大，板层体排空，线粒体肿胀等改变。这些改变可能是导致SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低的形态学基础。由于产生SP的主要细胞肺泡Ⅱ型上皮细胞的变性，故不可避免地影响了SP的表达，可能是SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低的又一原因。SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达降低还可能与油酸引起的肺水肿，肺泡腔渗出大量的水肿液及血浆蛋白有关。我们另一组研究结果提示，油酸注入后，部分试验动物可见经口鼻涌出大量粉红色水肿液，病理检查见肺泡腔同样存在大量水肿液[13]。据认为，血浆蛋白是最早发现对PS活性有抑制作用，其抑制原理是与气/液面的PS竞争并干扰S单分子层的形成[14]。血浆蛋白渗出到肺泡腔不仅增加了肺泡表面张力，而且其中的纤维素单体(纤维蛋白降解产物)对PS具有强烈的抑制作用。
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国家自然科学基金资助项目，No.39670336
作者简介：崔社怀，男，43岁，副教授，副主任医师，博士
参考文献
1 Chomczynski P， Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochem,1987，162(1):156
2 蔡文琴，王伯主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.492～503
3 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学出版社，1992.26～29
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4 Dower W J, Miller J F. High efficiency transformation of E coli by high voltage electroporation. Nucle Acid Res,1988，16(6):6127
5 Sarin V K, Gupta S, Leung T K，et al. Biophysical and biochemical activity of a synthetic 8.7 kDa hydrophobic pulmonary surfactant protein SP-B. Proc Natl Acad Sci USA,1990，87(7):2633
6 Yamada T, Kegami N, Tabor B L，et al. Effects of surfactant protein A on surfactant function in preterm ventilated rabbit. Am Rev Respir Dis,1990，142(4):754
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7 Cleary J P, Berstein G, Mannino F, et al. Improved oxygenation during synchronized intermittent mandatory ventilation in neonates with respiratory distress syndrome:a randomized, crossover study. J Pediate,1995，126(3):407
8 Huang Y C T, Caminiti S P, Fawcett T A， et al. Natural surfactant and hyperoxic lung injury in primates. I Physiology and biochemistry. J Appl Physiol,1994，76(3):991
9 Moya F R, Montes H F, Thomas V L， et al. Surfactant protein A and saturated Phosphatidylcholine in respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med,1994，150(5):1672
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10 Pison U, Obertacke U, Seeger W， et al. Surfactant protein A(SP-A) is decreased in acute parenchymal lung injury associated with polytrauma. Eur J Clin Invest,1992，22(4):712
11 Olanoff L S, Reines D, Spicer K M， et al. Effects of oleic acid on pulmonary capillary leak and thromboxanes. J Surgic Res,1984，36(6):597
12 崔社怀，毛宝龄，郭先健，等.油酸致犬肺损伤的血栓素和前列环素的研究.中华结核和呼吸杂志，1989，12(1)：24
13 崔社怀，郭先健.急性低氧复合油酸大鼠肺损伤模型的复制及PTX的治疗作用。中国病理生理杂志，1999，15(2)：150
14 Holm B A, Matalon S. Role of pulmonary surfactant in the development and treatment of aduot respiratory distress synrome. Anesth Analg,1989，69(6):805
(收稿：1998-05-09；修回：1999-01-15), 百拇医药