全自动加样仪和酶标仪氰化高铁血红蛋白比色法测定的探讨
作者：叶贤林 马兰 王薇 邹红岩
单位：叶贤林 马兰(深圳血液中心，深圳 518001)；王薇(乌鲁木齐血站)；邹红岩(齐齐哈尔血站)
关键词：
现代诊断与治疗990320 测定血红蛋白含量是临床上诊断贫血的主要依据，其方法有比重法，可作为快速测定，但准确性差[1]。测铁和测氧法由于操作复杂，不适常规使用[2]。临床上常用比色法，其中以氰化高铁血红蛋白比色法结果准确、重复性好，因而成为国际上测定血红蛋白的标准方法[3]。本文在试管法的基础上，应用全自动加样仪和酶标仪，将其移植在微孔板上，实现样本条码扫描，加样自动化和标准化，数据输出网络化管理。经在献血员体检中应用，获得良好效果。
1 材料与方法
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1.1 试验仪器 瑞士TECAN RSP系列Megflex-ID智能加样仪(特殊合金TEFLON涂层固定加样针，精度：20μl，<±1%)；江苏新康仪器厂产XK-Ⅱ血红蛋白仪；TECAN SLT酶标仪(经质控板校正)；DIAS?96孔平底微孔板(读数用)；华美公司产96孔平底预稀释板；微量进样器(已校)。
1.2 应用软件 TECAN LOGIC智能加样软件；TECAN EASYBASE读数分析软件；TECAN SOFT?2000读数分析软件；STATA统计分析软件。
1.3 氰化高铁血红蛋白标准液 定值为134g/L和132g/L，上海市医学化验所出品，批号为960705和970508。显色剂：参照《全国临床检验操作规程》推荐的氰化高铁血红蛋白的配方[4]。
1.4 样本 肝素抗凝全血样。条码：由我站网络管理系统给出的6位Codabar码。
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1.5 微孔板比色法基本操作
1.5.1 标准工作曲线制备 用全自动加样仪分别将Hb标准液(定值为134g/L)0、12、18、20、24μl及用于隔离的空气和显色剂200、188、182、180、176μl一同吸入加入预稀释板，此系列相当Hb浓度为0、80.4、120.6、134和160.8g/L。稀释均匀后，再将每份稀释液取20μl加入96孔平底微板中，同时加入130μl显色剂。混匀后放置10分钟，用Soft?2000软件控制酶标仪上比色，波长为540nm，软件绘出标准工作曲线，储存备用。
1.5.2 样本测定 在制作标准曲线同时，用全自动加样仪在“MIX”模式下将经扫描条码后的待检血样混匀后，取20μl血样、用于隔离的空气和显色剂180μl一同吸入加入预稀释板中，稀释均匀后，再将每份稀释液取20μl加入96孔平底微板中，加入130μl显色剂。混匀后比色，结果由软件根据标准工作曲线自动计算，同时可根据在软件中设置的路径将数据和相应的献血员条码传输到网络中。
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2 实验结果
2.1 氰化高铁血红蛋白溶液的最佳线性比色范围 按标准试管法分别取Hb标准液(定值为134g/L)0、5、10、20、40、50、80、100、120和160μl，同时加显色剂到5ml，在分光光度计和微孔板上(取150μl于微孔中)测定540nm处吸光度，以样品试剂比为横坐标绘制曲线图，发现样品试剂比在1∶40范围内，曲线保持良好的线性关系(r2=0.9994)。
2.2 两级样本试剂稀释倍数的选择
2.2.1 预稀释板和比色板加注量的设定 考虑吸针探测最小容量、混合、常规容量等因素，设定预稀释板加注量为200μl，比色板加注量为150μl。
2.2.2 预稀释加样量和比色板加样量的选择 在加样仪上吸取5、10、15、20、25、30和40μl血红蛋白标准液(定值为134g/L)，分别添加显色剂至200μl，每级平行做9孔，振荡混匀后，用微量进样针吸取40、30、25、20、15、10和5μl，添加显色剂至150μl，震荡混匀放置10分钟后在酶标仪上540nm比色，计算变异系数。用微量进样针代替加样仪，然后用后者代替前者重复上述实验，结果见附图。由附图可见，预稀释板加样量在15～25μl时及比色板加样量在15～30μl时百分变异均小。
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取预稀释加样量为15、20和25μl三个水平，比色加样量为15、20、25和30μl四个水平进行12种组合实验，每种实验均要求绘制标准曲线，计算其相关系数r2(见表1)。由表1可知，预稀释加样量为20μl，比色加样量为20μl时，曲线线性最好。
表1 预稀释加样量和比色板加样量组合实验效果比较 实验次数
预稀释吸样量(μl)
比色吸样量(μl)
标准曲线r2值
1
15
15
0.9976
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2
15
20
0.9981
3
15
25
0.9978
4
15
30
0.9974
5
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15
0.9984
6
20
20
0.9996
7
20
25
0.9991
8
20
30
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0.9988
9
25
15
0.9978
10
25
20
0.9989
11
25
25
0.9988
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12
25
30
0.9984
2.3 氰化高铁血红蛋白溶液显色稳定性实验 选取Hb高值、中值和低值三种血样，用样本测定方法处理，在酶标仪上每2分钟监测其吸光度，结果显示，放置6分钟后OD值即成稳定态，该溶液可稳定2小时。
2.4 标准工作曲线稳定性实验 按实验每天制备一条标准曲线，连续7天，经多条直线回归系数比较(F=0.35,P>0.05)和多个截距的比较(F=0.26,P>0.05)表明，各条直线间无显著性差异。标准工作曲线至少可稳定一周。
2.5 方法的精密度与准确度实验 取定值为132g/L的血红蛋白液，每天取样本进行测定，总共测定20次，同时在血红蛋白测定仪以及用微量加样器手工加样代替自动加样仪进行测定，统计结果见表2。三种方法均符合测定血红蛋白要求，其中以本法最佳。表2 三种Hb测定方法定值测定的比较 测定法
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次数
均值
最大值
最小值
极值
S
CV%
ACC%
自动加样
20
132.20
136
128
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8
3.0
2.2
+0.15
测定仪
20
132.34
136
127
9
3.2
2.4
+0.25
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手工加样
20
132.60
138
126
12
5.2
3.9
+0.45
2.6 方法学的回收实验 在Hb浓度为90.5g/L的全血加入Hb为45.8、90.4、134g/L的质控物。测得值为135.6、180.5、223.9g/L，其回收率平均为99.2%。
2.7 方法学的对比实验 用本法和血红蛋白测定仪同时测定献血员标本121例，其中不合格19份，全部检出，符合率100%。121例数据配对t检验，t=0.78,P>0.05，结果无显著性差异。两法相关系数达0.995，回归直线方程：Y(本法)=0.999X(测定仪)+1.02。
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3 讨论与结语
本法在测定前按厂家推荐的质控板方法对酶标仪严格进行校正，吸针用后均用1M?NaOH溶液浸泡过夜，以防脂肪类颗粒残留影响吸样精度。对平底微孔板要求空白扫描孔间OD值极差在0.005之内，以减少测定误差。由于加样针在各个容量段吸样精度不同，故在实验中应用变异最小原则选择两级稀释比，有效地提高了测定精度和准确度。同时本法应用工作曲线进行测定，可以消除系统误差的影响，亦可对分析系统进行校正[5]。本文采用两级稀释模式实现微量比色，总稀释比为1∶75。在预稀释模式中采用血样和显色剂同时加样方式，有利于混匀和酸化的进行。二级酸化显色不影响测定结果。
氰化高铁血红蛋白比色法是国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐、WHO确认的血红蛋白测定参考方法，该方法在我国得到广泛应用。使用分光光度计和血红蛋白计测定仪，需接触有毒试剂、数据不易采集和不能同时进行大批量测定，而血细胞分析仪价格又太昂贵等缺点，在日常工作中带来很多不便，也不利于检测数据网络化、条码化管理。本文参照原测定方法基础上，对其进行改进和移植，使用全自动加样仪在微孔板上实现批量化和条码化加样和比色，使数据管理网络化。大大提高了分析速度和管理水平。并取得了满意结果。
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本法亦可改用微量加样器代替全自动加样仪手工加样进行实验，借助普通酶标仪即可进行结果测定。
参考文献
1 安欣良.血站(库)实用管理手册.第1版.苏州：苏州大学出版社，1984：174
2 李影林.中华医学检验全书.第1版.北京：人民卫生出版社，1996：97～98
3 Eilers RJ.Notification of final adoption of an international method and standard solution for hemoglobinometry,specification for preparations of standard solution.Am J Clin Pathol,1967;47:212
4 叶应妩，等.全国临床检验操作规程.南京：东南大学出版社，1991：2～3
5 章荣明.氰化高铁血红蛋白测定在推广应用中得若干问题及其质量控制.中华医学检验杂志，1980；3：164, 百拇医药
单位：叶贤林 马兰(深圳血液中心，深圳 518001)；王薇(乌鲁木齐血站)；邹红岩(齐齐哈尔血站)
关键词：
现代诊断与治疗990320 测定血红蛋白含量是临床上诊断贫血的主要依据，其方法有比重法，可作为快速测定，但准确性差[1]。测铁和测氧法由于操作复杂，不适常规使用[2]。临床上常用比色法，其中以氰化高铁血红蛋白比色法结果准确、重复性好，因而成为国际上测定血红蛋白的标准方法[3]。本文在试管法的基础上，应用全自动加样仪和酶标仪，将其移植在微孔板上，实现样本条码扫描，加样自动化和标准化，数据输出网络化管理。经在献血员体检中应用，获得良好效果。
1 材料与方法
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1.1 试验仪器 瑞士TECAN RSP系列Megflex-ID智能加样仪(特殊合金TEFLON涂层固定加样针，精度：20μl，<±1%)；江苏新康仪器厂产XK-Ⅱ血红蛋白仪；TECAN SLT酶标仪(经质控板校正)；DIAS?96孔平底微孔板(读数用)；华美公司产96孔平底预稀释板；微量进样器(已校)。
1.2 应用软件 TECAN LOGIC智能加样软件；TECAN EASYBASE读数分析软件；TECAN SOFT?2000读数分析软件；STATA统计分析软件。
1.3 氰化高铁血红蛋白标准液 定值为134g/L和132g/L，上海市医学化验所出品，批号为960705和970508。显色剂：参照《全国临床检验操作规程》推荐的氰化高铁血红蛋白的配方[4]。
1.4 样本 肝素抗凝全血样。条码：由我站网络管理系统给出的6位Codabar码。
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1.5 微孔板比色法基本操作
1.5.1 标准工作曲线制备 用全自动加样仪分别将Hb标准液(定值为134g/L)0、12、18、20、24μl及用于隔离的空气和显色剂200、188、182、180、176μl一同吸入加入预稀释板，此系列相当Hb浓度为0、80.4、120.6、134和160.8g/L。稀释均匀后，再将每份稀释液取20μl加入96孔平底微板中，同时加入130μl显色剂。混匀后放置10分钟，用Soft?2000软件控制酶标仪上比色，波长为540nm，软件绘出标准工作曲线，储存备用。
1.5.2 样本测定 在制作标准曲线同时，用全自动加样仪在“MIX”模式下将经扫描条码后的待检血样混匀后，取20μl血样、用于隔离的空气和显色剂180μl一同吸入加入预稀释板中，稀释均匀后，再将每份稀释液取20μl加入96孔平底微板中，加入130μl显色剂。混匀后比色，结果由软件根据标准工作曲线自动计算，同时可根据在软件中设置的路径将数据和相应的献血员条码传输到网络中。
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2 实验结果
2.1 氰化高铁血红蛋白溶液的最佳线性比色范围 按标准试管法分别取Hb标准液(定值为134g/L)0、5、10、20、40、50、80、100、120和160μl，同时加显色剂到5ml，在分光光度计和微孔板上(取150μl于微孔中)测定540nm处吸光度，以样品试剂比为横坐标绘制曲线图，发现样品试剂比在1∶40范围内，曲线保持良好的线性关系(r2=0.9994)。
2.2 两级样本试剂稀释倍数的选择
2.2.1 预稀释板和比色板加注量的设定 考虑吸针探测最小容量、混合、常规容量等因素，设定预稀释板加注量为200μl，比色板加注量为150μl。
2.2.2 预稀释加样量和比色板加样量的选择 在加样仪上吸取5、10、15、20、25、30和40μl血红蛋白标准液(定值为134g/L)，分别添加显色剂至200μl，每级平行做9孔，振荡混匀后，用微量进样针吸取40、30、25、20、15、10和5μl，添加显色剂至150μl，震荡混匀放置10分钟后在酶标仪上540nm比色，计算变异系数。用微量进样针代替加样仪，然后用后者代替前者重复上述实验，结果见附图。由附图可见，预稀释板加样量在15～25μl时及比色板加样量在15～30μl时百分变异均小。
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取预稀释加样量为15、20和25μl三个水平，比色加样量为15、20、25和30μl四个水平进行12种组合实验，每种实验均要求绘制标准曲线，计算其相关系数r2(见表1)。由表1可知，预稀释加样量为20μl，比色加样量为20μl时，曲线线性最好。
表1 预稀释加样量和比色板加样量组合实验效果比较 实验次数
预稀释吸样量(μl)
比色吸样量(μl)
标准曲线r2值
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0.9976
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2
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25
0.9978
4
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30
0.9974
5
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9
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2.3 氰化高铁血红蛋白溶液显色稳定性实验 选取Hb高值、中值和低值三种血样，用样本测定方法处理，在酶标仪上每2分钟监测其吸光度，结果显示，放置6分钟后OD值即成稳定态，该溶液可稳定2小时。
2.4 标准工作曲线稳定性实验 按实验每天制备一条标准曲线，连续7天，经多条直线回归系数比较(F=0.35,P>0.05)和多个截距的比较(F=0.26,P>0.05)表明，各条直线间无显著性差异。标准工作曲线至少可稳定一周。
2.5 方法的精密度与准确度实验 取定值为132g/L的血红蛋白液，每天取样本进行测定，总共测定20次，同时在血红蛋白测定仪以及用微量加样器手工加样代替自动加样仪进行测定，统计结果见表2。三种方法均符合测定血红蛋白要求，其中以本法最佳。表2 三种Hb测定方法定值测定的比较 测定法
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次数
均值
最大值
最小值
极值
S
CV%
ACC%
自动加样
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132.20
136
128
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8
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测定仪
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手工加样
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2.6 方法学的回收实验 在Hb浓度为90.5g/L的全血加入Hb为45.8、90.4、134g/L的质控物。测得值为135.6、180.5、223.9g/L，其回收率平均为99.2%。
2.7 方法学的对比实验 用本法和血红蛋白测定仪同时测定献血员标本121例，其中不合格19份，全部检出，符合率100%。121例数据配对t检验，t=0.78,P>0.05，结果无显著性差异。两法相关系数达0.995，回归直线方程：Y(本法)=0.999X(测定仪)+1.02。
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3 讨论与结语
本法在测定前按厂家推荐的质控板方法对酶标仪严格进行校正，吸针用后均用1M?NaOH溶液浸泡过夜，以防脂肪类颗粒残留影响吸样精度。对平底微孔板要求空白扫描孔间OD值极差在0.005之内，以减少测定误差。由于加样针在各个容量段吸样精度不同，故在实验中应用变异最小原则选择两级稀释比，有效地提高了测定精度和准确度。同时本法应用工作曲线进行测定，可以消除系统误差的影响，亦可对分析系统进行校正[5]。本文采用两级稀释模式实现微量比色，总稀释比为1∶75。在预稀释模式中采用血样和显色剂同时加样方式，有利于混匀和酸化的进行。二级酸化显色不影响测定结果。
氰化高铁血红蛋白比色法是国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐、WHO确认的血红蛋白测定参考方法，该方法在我国得到广泛应用。使用分光光度计和血红蛋白计测定仪，需接触有毒试剂、数据不易采集和不能同时进行大批量测定，而血细胞分析仪价格又太昂贵等缺点，在日常工作中带来很多不便，也不利于检测数据网络化、条码化管理。本文参照原测定方法基础上，对其进行改进和移植，使用全自动加样仪在微孔板上实现批量化和条码化加样和比色，使数据管理网络化。大大提高了分析速度和管理水平。并取得了满意结果。
, 百拇医药
本法亦可改用微量加样器代替全自动加样仪手工加样进行实验，借助普通酶标仪即可进行结果测定。
参考文献
1 安欣良.血站(库)实用管理手册.第1版.苏州：苏州大学出版社，1984：174
2 李影林.中华医学检验全书.第1版.北京：人民卫生出版社，1996：97～98
3 Eilers RJ.Notification of final adoption of an international method and standard solution for hemoglobinometry,specification for preparations of standard solution.Am J Clin Pathol,1967;47:212
4 叶应妩，等.全国临床检验操作规程.南京：东南大学出版社，1991：2～3
5 章荣明.氰化高铁血红蛋白测定在推广应用中得若干问题及其质量控制.中华医学检验杂志，1980；3：164, 百拇医药