骨髓细胞DNA含量的分析在小儿急性白血病发生及其治疗方面的作用
作者：陈日玲 陈铭珍 蔡康荣 李锋
单位：广东医学院 陈日玲、陈铭珍、李锋：附属医院儿科，湛江524001；蔡康荣：电镜室，湛江524023
关键词：流式细胞分析；异倍体；细胞周期；急性白血病
广东医学院学报990332 流式细胞仪(FCM)可以快速、准确地测定骨髓细胞DNA含量，对骨髓细胞DNA含量变化的分析，在研究小儿急性白血病发生及其治疗方面具有重要的临床意义。本文应用FCM检测54例常见血液病患儿骨髓单个核细胞(MNC)的DNA含量，以分析其倍体水平及细胞增殖周期，进一步探讨DNA含量变化对小儿急性白血病的早期诊断、疗效评价、预后判断等方面的作用。
1 对象与方法
1.1 对象 (1)急性白血病组(AL)，初诊为急性白血病患儿42例，其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)22例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)20例。(2)非白血病组：初诊为非白血病的常见血液病患儿12例〔1例营养性 缺铁性贫血，2例慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)，4例急性特发性血 小板减少性紫癜(AITP)，2例急性溶血性贫血，1例粒细胞减少症，2例再生障碍性贫血(AA)〕。以上病例均经临床及实验室检查确诊，年龄2～14岁，平均年龄6.5岁。(3)正常对照组15例，为骨髓象正常的儿童，年龄2～14岁，平均年龄5.7岁。
, 百拇医药
1.2 方法 (1)样品制备：取肝素抗凝骨髓0.1mL，按常规方法分离 MNC，每测定管加骨髓细胞106个，然后依次加入DNA测定液(Coulter DNA Kit)，室温保存30min，然后加入PI染液(终浓度为00μL/mL)，室温30min后上机测定。(2)DNA测定方法： 流式细胞仪FAC scan(Coulter公司)，15mW氩离子激光光源，发射波长488nm，每个样品测定10000个细胞，采用Coulter 公司提供的DNA分析程度，获取各样本细胞周期时相百分比。(3)倍体分析：根据DNA指数(DI)判断，本仪器DI值正常范围是0.90～1.10，小于0.9为亚二倍体，大于1.10为超二倍体。
1.3 统计学处理 用t检验和χ2检验。
2 结果
2.1 DNA异倍体检出率 白血病组异倍体检出率为57.1%(24/42)， 其中ALL患儿为68.2%(15/22)，ANLL患儿为25%(5/20)， 两者比较差异有显著性(P<0.05)。非白血病组的异倍体检出率为33.3 %(4/12)，与白血病组比较差异有显著性(P<0.05)。正常对照组无 一人检出异倍体。
, 百拇医药
2.2 细胞周期分布 结果见表1：ALL及ANLL组患儿的G0/G1(%)均明显高于对照组(P<0.01)，S%和S+G2/M(%)则明显低于对照组( P<0.05)。AL组与ANLL组比较，各周期细胞分布无显著差异性。非白血病组的DNA分析图形除了有4例异倍体外，其余均与正常对照相似，细胞周期分布各值与正常对照组比较差异无显著性。
表1 各组的骨髓细胞周期分布 (
± s，%)
分 组
例数
G0/G1
S
, 百拇医药
G2M
G2M+S
ALL组
22
90.65±5.1*
9.09±4. 94*
2.26±1.18*
9.67±3.24*
ANLL组
20
89.63±6.27*
, 百拇医药
8.2 1±4.23 *
2.21±0.96*
10.33±4.13*
非白血病组
12
79.80±5.42
19.15±5.13
4.04±1.16
23.71±8.11
正常对照
15
, 百拇医药
76.90±10.51
21.33 ±10.23
4.10±1.04
25.40±11.19
*与正常组比较，P<0.05
2.3 倍体与细胞周期S期百分比之间的关系 ALL组中，亚二倍体7例，S %均值为(6.08±2.21)；超二倍体8例，S%均值为(9.38±3.25)；二倍体7例，S%均值为(8.64±2.17)。亚二倍体的S%分别 与超二倍体、二倍体比较存在显著差异性(P<0.05)。
3 讨论
传统的细胞形态学检查至今仍是诊断肿瘤的一种重要手段。近年来，FCM的问世，实现了肿瘤细胞学诊断的自动化，并广泛应用于肿瘤细胞学的临床诊断研究。人体正常的细胞具有较恒定的DNA二倍体含量，当人体发生癌变以及具有恶性潜能的癌前病变，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变[1]。本实验应用FCM精确测定血液病患儿骨髓细胞DNA含量，对MNC的DNA含量异常(异倍体)进行分析。结果表明，白血病异倍体检出率为57.1%(24/42)，非白血病的血液病患儿异倍体检出率为33.3%(4/12)，两组差异有显著性。经追踪，4例异倍体初诊为非白血病患儿中，有1例CITP转变为骨髓增生异常综合征(MDS)，1例AA病儿发展为ANLL。因此，初诊为血液病的患儿，临床上进行骨髓细胞形态学检查的同时，应用FCM检测其骨髓MNC的DNA含量，对DNA含量异常的非白血病患儿，应高度注意其癌变的可能。
, 百拇医药
本资料显示，白血病的异倍体检出率显著高于非白血病组，因此，DNA倍体改变在AL中是极其常见的。而且，ALL和DNA异倍体检出率明显高于ANLL组，从遗传学角度分析AL的发病机制，表明ANLL患儿的染色体异常较多地表现为 结构异常，而不是数目的异常，这可能是临床上ANLL较ALL缓解率低的原因 之一。此外，我们还观察到接受治疗的8例ALL患儿，有6例达到完全缓解(C R)，其中4例为超二倍体，另2例分别为二倍体和亚二倍体，提示超二倍体患儿 的CR率高，预后较好，与多数文献报告一致[2～4]。
细胞周期中S期比例代表该细胞群体中增殖细胞的数量，从一侧面反映细胞的增殖状态。本实验经统计，AL组患儿骨髓细胞的G0/G1(%)明显高于正常对照组，而S%及S+G2/M(%)明显低于对照组，说明了白血病骨髓细胞从G0/G1期至S期之间存在运行阻滞，表明白血病骨髓细胞的增殖能力低于正常。而且，根据追踪结果，发现同一患者在不同病期的白血病细胞增殖状况不同，3例ALL患儿达到CR后，其S%(分别为30.2%，28.5%，26.3%)和S+G 2/M(%)(分别为35.3%，30.2%，33.5%)均明显高于初诊时的S%(分别为10.5%，12.4%，13.1%)和S+G2/M(%)(分 别为9.5%，13.8%，20.6%)。说明AL患儿CR后各期比例恢复正常，骨髓造血功能恢复。
, 百拇医药
为了进一步了解倍体与疾病预后、治疗的关系，我们分析统计了ALL亚二倍体、超二倍体及二倍体的S期细胞分布比例，结果发现亚二倍体的S%均值较超二倍体、二倍体的S%均值明显减少，说明亚二倍体ALL患儿的骨髓细胞增殖能力低，故预后相对较差。然而，超二倍体骨髓细胞的增殖分化需要复制合成更多的遗传物质，S期相对延长，进入S期的细胞增多，因而临床上对于超二倍体的ALL患儿，联合使用作用于S期白血病细胞的药物，能达到更佳的治疗效果。本实验追踪病例有限，我们将继续应用FCM定期测定AL患儿骨髓细胞周期分布，了解细胞增殖状况并施以相应的药物治疗，提高治疗AL患儿的疗效。
4 参考文献
1 Barlogie B，Drewinko B，Schumann J ，et al.Cellular DNA content as a marke r of neoplasia in man.Am J med，1980， 69：195
, 百拇医药
2 Stary J，Hrodek O，Hausner P，et al.T he importance of blast cell DNA cont ent for prognosis of childhood acute lymphoblastic leukemia.Neoplasma，19 90，37：293
3 Look AT，Roberson PK，Williams DL，et al.Prognostic importance of blast c ell DNA content in childhood acute l ymphoblastic leukemia.Blood，1985，65： 1079
4 宋华，郭淑芬，徐淑芝，等.用流式细胞仪测定小儿急性白血病细胞DNA及 其临床意义的研究.中华血液学杂志，1994，15(3)：137
收稿日期：1998-12-07, 百拇医药
单位：广东医学院 陈日玲、陈铭珍、李锋：附属医院儿科，湛江524001；蔡康荣：电镜室，湛江524023
关键词：流式细胞分析；异倍体；细胞周期；急性白血病
广东医学院学报990332 流式细胞仪(FCM)可以快速、准确地测定骨髓细胞DNA含量，对骨髓细胞DNA含量变化的分析，在研究小儿急性白血病发生及其治疗方面具有重要的临床意义。本文应用FCM检测54例常见血液病患儿骨髓单个核细胞(MNC)的DNA含量，以分析其倍体水平及细胞增殖周期，进一步探讨DNA含量变化对小儿急性白血病的早期诊断、疗效评价、预后判断等方面的作用。
1 对象与方法
1.1 对象 (1)急性白血病组(AL)，初诊为急性白血病患儿42例，其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)22例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)20例。(2)非白血病组：初诊为非白血病的常见血液病患儿12例〔1例营养性 缺铁性贫血，2例慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)，4例急性特发性血 小板减少性紫癜(AITP)，2例急性溶血性贫血，1例粒细胞减少症，2例再生障碍性贫血(AA)〕。以上病例均经临床及实验室检查确诊，年龄2～14岁，平均年龄6.5岁。(3)正常对照组15例，为骨髓象正常的儿童，年龄2～14岁，平均年龄5.7岁。
, 百拇医药
1.2 方法 (1)样品制备：取肝素抗凝骨髓0.1mL，按常规方法分离 MNC，每测定管加骨髓细胞106个，然后依次加入DNA测定液(Coulter DNA Kit)，室温保存30min，然后加入PI染液(终浓度为00μL/mL)，室温30min后上机测定。(2)DNA测定方法： 流式细胞仪FAC scan(Coulter公司)，15mW氩离子激光光源，发射波长488nm，每个样品测定10000个细胞，采用Coulter 公司提供的DNA分析程度，获取各样本细胞周期时相百分比。(3)倍体分析：根据DNA指数(DI)判断，本仪器DI值正常范围是0.90～1.10，小于0.9为亚二倍体，大于1.10为超二倍体。
1.3 统计学处理 用t检验和χ2检验。
2 结果
2.1 DNA异倍体检出率 白血病组异倍体检出率为57.1%(24/42)， 其中ALL患儿为68.2%(15/22)，ANLL患儿为25%(5/20)， 两者比较差异有显著性(P<0.05)。非白血病组的异倍体检出率为33.3 %(4/12)，与白血病组比较差异有显著性(P<0.05)。正常对照组无 一人检出异倍体。
, 百拇医药
2.2 细胞周期分布 结果见表1：ALL及ANLL组患儿的G0/G1(%)均明显高于对照组(P<0.01)，S%和S+G2/M(%)则明显低于对照组( P<0.05)。AL组与ANLL组比较，各周期细胞分布无显著差异性。非白血病组的DNA分析图形除了有4例异倍体外，其余均与正常对照相似，细胞周期分布各值与正常对照组比较差异无显著性。
表1 各组的骨髓细胞周期分布 (
± s，%)分 组
例数
G0/G1
S
, 百拇医药
G2M
G2M+S
ALL组
22
90.65±5.1*
9.09±4. 94*
2.26±1.18*
9.67±3.24*
ANLL组
20
89.63±6.27*
, 百拇医药
8.2 1±4.23 *
2.21±0.96*
10.33±4.13*
非白血病组
12
79.80±5.42
19.15±5.13
4.04±1.16
23.71±8.11
正常对照
15
, 百拇医药
76.90±10.51
21.33 ±10.23
4.10±1.04
25.40±11.19
*与正常组比较，P<0.05
2.3 倍体与细胞周期S期百分比之间的关系 ALL组中，亚二倍体7例，S %均值为(6.08±2.21)；超二倍体8例，S%均值为(9.38±3.25)；二倍体7例，S%均值为(8.64±2.17)。亚二倍体的S%分别 与超二倍体、二倍体比较存在显著差异性(P<0.05)。
3 讨论
传统的细胞形态学检查至今仍是诊断肿瘤的一种重要手段。近年来，FCM的问世，实现了肿瘤细胞学诊断的自动化，并广泛应用于肿瘤细胞学的临床诊断研究。人体正常的细胞具有较恒定的DNA二倍体含量，当人体发生癌变以及具有恶性潜能的癌前病变，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变[1]。本实验应用FCM精确测定血液病患儿骨髓细胞DNA含量，对MNC的DNA含量异常(异倍体)进行分析。结果表明，白血病异倍体检出率为57.1%(24/42)，非白血病的血液病患儿异倍体检出率为33.3%(4/12)，两组差异有显著性。经追踪，4例异倍体初诊为非白血病患儿中，有1例CITP转变为骨髓增生异常综合征(MDS)，1例AA病儿发展为ANLL。因此，初诊为血液病的患儿，临床上进行骨髓细胞形态学检查的同时，应用FCM检测其骨髓MNC的DNA含量，对DNA含量异常的非白血病患儿，应高度注意其癌变的可能。
, 百拇医药
本资料显示，白血病的异倍体检出率显著高于非白血病组，因此，DNA倍体改变在AL中是极其常见的。而且，ALL和DNA异倍体检出率明显高于ANLL组，从遗传学角度分析AL的发病机制，表明ANLL患儿的染色体异常较多地表现为 结构异常，而不是数目的异常，这可能是临床上ANLL较ALL缓解率低的原因 之一。此外，我们还观察到接受治疗的8例ALL患儿，有6例达到完全缓解(C R)，其中4例为超二倍体，另2例分别为二倍体和亚二倍体，提示超二倍体患儿 的CR率高，预后较好，与多数文献报告一致[2～4]。
细胞周期中S期比例代表该细胞群体中增殖细胞的数量，从一侧面反映细胞的增殖状态。本实验经统计，AL组患儿骨髓细胞的G0/G1(%)明显高于正常对照组，而S%及S+G2/M(%)明显低于对照组，说明了白血病骨髓细胞从G0/G1期至S期之间存在运行阻滞，表明白血病骨髓细胞的增殖能力低于正常。而且，根据追踪结果，发现同一患者在不同病期的白血病细胞增殖状况不同，3例ALL患儿达到CR后，其S%(分别为30.2%，28.5%，26.3%)和S+G 2/M(%)(分别为35.3%，30.2%，33.5%)均明显高于初诊时的S%(分别为10.5%，12.4%，13.1%)和S+G2/M(%)(分 别为9.5%，13.8%，20.6%)。说明AL患儿CR后各期比例恢复正常，骨髓造血功能恢复。
, 百拇医药
为了进一步了解倍体与疾病预后、治疗的关系，我们分析统计了ALL亚二倍体、超二倍体及二倍体的S期细胞分布比例，结果发现亚二倍体的S%均值较超二倍体、二倍体的S%均值明显减少，说明亚二倍体ALL患儿的骨髓细胞增殖能力低，故预后相对较差。然而，超二倍体骨髓细胞的增殖分化需要复制合成更多的遗传物质，S期相对延长，进入S期的细胞增多，因而临床上对于超二倍体的ALL患儿，联合使用作用于S期白血病细胞的药物，能达到更佳的治疗效果。本实验追踪病例有限，我们将继续应用FCM定期测定AL患儿骨髓细胞周期分布，了解细胞增殖状况并施以相应的药物治疗，提高治疗AL患儿的疗效。
4 参考文献
1 Barlogie B，Drewinko B，Schumann J ，et al.Cellular DNA content as a marke r of neoplasia in man.Am J med，1980， 69：195
, 百拇医药
2 Stary J，Hrodek O，Hausner P，et al.T he importance of blast cell DNA cont ent for prognosis of childhood acute lymphoblastic leukemia.Neoplasma，19 90，37：293
3 Look AT，Roberson PK，Williams DL，et al.Prognostic importance of blast c ell DNA content in childhood acute l ymphoblastic leukemia.Blood，1985，65： 1079
4 宋华，郭淑芬，徐淑芝，等.用流式细胞仪测定小儿急性白血病细胞DNA及 其临床意义的研究.中华血液学杂志，1994，15(3)：137
收稿日期：1998-12-07, 百拇医药