免疫组织化学研究新进展
作者：于颖彦
单位：上海市第一人民医院病理科(200080)
关键词：免疫组织化学；免疫测定
河北医科大学学报990342 中图号 R371.3
1996年5月27日至31日,中华医学会病理学会、中华病理学杂志编辑部在北京召开了全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会。笔者作为河北医科大学代表出席会议并在大会作了专题学术报告。全国从事免疫组织化学研究的专家同道聚集一堂,各抒己见,研究成果各具特色。参加此次会议大大拓宽了视野,受益匪浅。本文荟萃此次大会报告论文之精华将免疫组织化学研究最新进展介绍如下。
1 免疫组织化学技术迅猛发展史
免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane等人于60年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger等人于70年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法)和PAP法(过氧化酶抗过氧化酶法)。80年代初期美籍华人Hsu又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法),自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,Streptavidin)与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP法,或称LSAB法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法)。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC法高4～8倍,比PAP法高8～16倍。进入90年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。有人做过这样一个统计,70年代利用免疫组织化学技术的科研论文全世界范围内每年不超过10篇,而今每年已超过1 万篇。
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2 免疫组织化学技术在临床病理诊断中的重要作用
100年前发明的用光学显微镜观察HE染色切片法仍然是当前各级医院病理科中的基本方法。该方法的局限性在于仅能从细胞水平反映疾病性质,诊断中观察者的主观推测成份高,常常是同一疾病出现分歧颇大的数个不同诊断,多年来成为临床病理诊断中的突出问题。而免疫组织化学方法是通过抗原抗体反应客观地反映疾病性质,在观察HE切片基础上,再结合免疫组织化学染色结果可对某一疾病做出较为客观公正的评价,从而可避免主观因素的影响。自免疫组织化学技术应用于临床病理诊断以来,在以下几类疾病的鉴别诊断中发挥着重要作用。
2.1 高度未分化肿瘤细胞起源的鉴别:发生在胃肠道的这类肿瘤应首选CEA与Vimentin两种抗体鉴别是上皮源性抑或是间叶源性肿瘤。因为CEA在消化道上皮源性肿瘤的阳性率高,但在鳞癌时阳性率低;而消化道以外部位发生者,上皮性标记物宜选用EMA,该抗体在90 %以上上皮源性肿瘤呈阳性表达。
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2.2 小圆细胞肿瘤的鉴别:小圆细胞肿瘤包括小细胞未分化癌、恶性淋巴瘤、小细胞软组织肉瘤、神经内分泌肿瘤以及小细胞黑色素瘤。这类肿瘤鉴别诊断时应使用EMA或CEA,LCA,Vimentin,NSE,S100和HMB45抗体。
2.3 大细胞型肿瘤鉴别:这类肿瘤可以是大细胞未分化癌、低分化肉瘤、大细胞性黑色素瘤和大细胞性恶性淋巴瘤。在鉴别诊断时应该选用EMA或CEA,Vimentin,S100和LCA抗体。
2.4 梭形或多形性软组织肉瘤的鉴别:此类肿瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形细胞血管肉瘤、梭形细胞黑色素瘤、多形性横纹肌肉瘤、多形性恶性纤维组织细胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。以下抗体可用于鉴别诊断:Actin,EMA,FⅧAg,S100,HMB45,Myoglobin,Desmin,α1-AT以及α1-ACT。
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2.5 恶性淋巴瘤分型:在免疫组织化学研究领域,当前对恶性淋巴瘤的免疫组织化学研究最为活跃与细致。截止目前为止,已有下列亚型可以通过免疫组织化学染色确立。它们是:B细胞淋巴瘤,L26阳性,LN2阳性;T细胞淋巴瘤,MT1阳性,UCHL1阳性;NK细胞淋巴瘤C123C阳性;树突网织细胞淋巴瘤,Ber-MAC-DRC阳性;指状突网织细胞淋巴瘤,S100阳性;真性组织细胞淋巴瘤,Mac387阳性,Lysozyme阳性,α1-ACT阳性;何杰金病R-S细胞,LeuM1阳性,Ber-H2阳性;大细胞间变型淋巴瘤Ber-H2(或称Ki-1)阳性。
2.6 神经内分泌肿瘤的确立:90 %以上的神经内分泌肿瘤NSE阳性。由于NSE与其它肿瘤有交叉反应,故必要时可加染Chromogranin A或Synaptophysin抗体。当需要弄清神经内分泌肿瘤有否内分泌功能时,再加染多肽类激素抗体。
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2.7 肿瘤预后的推测:最早用于推测肿瘤预后的抗体有抗雌激素受体ER及抗孕激素受体PR,二者阳性时预后较好。新近又发现,转移抑制基因产物nm23呈高表达时预后较好。而下列几种抗体呈高表达时均提示预后差:C-erbB-2,C-myc,P53,EGFR,PCNA,Ki-67,BrdU,P120,P105。
2.8 感染性疾病病原体的检测:其中HBsAg及HBcAg抗体常用于肝病研究与诊断。而尖锐湿疣及宫颈癌时常常可以检测到乳头状瘤病毒HPV。鼻咽癌、何杰金病时EB病毒抗体多呈阳性。
3 以免疫组织化学方法为研究手段的科研最新进展
免疫组织化学方法已成为当今形态学研究领域中不可缺少的研究手段。随着分子生物学和分子遗传学的进步,依靠免疫组织化学方法观察基因表达产物及细胞增殖功能是当前研究的热点课题。P53基因产物定位于细胞核内,迄今为止的研究提示,P53的高表达肿瘤预后较差。C-erbB-2基因产物定位于细胞膜,其表达意义与P53类似。nm23为转移抑制基因,其编码产物在肿瘤细胞的胞核及胞浆均可表达,研究显示,nm23呈高表达时预后较好。MDR-1为人类多药耐药基因,其基因产物定位于细胞膜,肿瘤细胞的MDR-1阳性表达率越高,对化疗药越不敏感,预后也就越差。PCNA与Ki-67是肿瘤细胞快速增殖标志,其阳性率高低与肿瘤的恶性程度成正比。此外,还有bcl-2,EGF,TGF,EGFR等凋亡相关基因或癌基因产物均处在研究阶段,结论尚待统一。
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4 免疫组织化学操作技术上的新进展
4.1 石蜡切片组织抗原性的恢复法:免疫组织化学染色成败的关键与组织切片中抗原性的存在与否有密切关系。临床病理检查时最常用的组织固定液甲醛是一种通过组织内蛋白质交联而达到固定作用的交联固定剂。这种固定剂虽然能很好地保持组织结构,但其交联作用可以使抗原分子形态结构发生变化或因大分子间的交联而遮盖了抗原决定簇。为此,人们发明出以下几种恢复(或称修复)石蜡切片抗原性的方法。
4.1.1 酶消化法:其中无花果蛋白酶Ficin为轻度消化酶,胰蛋白酶Trypsin为中等强度消化酶,胃蛋白酶Pepsin为强消化酶。
4.1.2 盐酸水解暴露抗原法:此法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间,以最大程度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
4.1.3 微波炉恢复抗原法:该法操作时应首先将石蜡切片置于缓冲液中,然后凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白,暴露被掩盖的抗原决定簇。目前,医用型与家用型二种微波炉均有人使用。
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4.1.4 高压锅恢复抗原法:有人用高压锅加热切片来暴露抗原。此法比微波炉更经济简单,适用于大批切片的加热处理。
4.1.5 煮沸恢复抗原法:既然热效应可以恢复抗原性,有人便采用将石蜡切片置于缓冲液中加热煮沸的方法,也获得了满意的染色结果,故认为加热煮沸法是恢复抗原性最为经济简便的方法。
4.2 应用显色增强剂加强DAB的显色效果:当某些原因使DAB显色减弱或显色缓慢时,可选用金属盐溶液作为显色增强剂。其原理是当切片加入DAB显色后,氧化型DAB产物与金属离子络合可使显色由棕黄转为棕黑或黑色。这类盐溶液包括氯化钴、硫酸镍胺、氯化金、氯化铁和硫酸铜等。
5 进口免疫组织化学试剂主要购入渠道
国际上免疫组织化学试剂经销公司主要有DAKO,Vector,Santa Cruz,Zymed,Monosan等。这些公司产品由于均已通过实验室阶段进入工业化成批生产,因而性能较为可靠,使用起来放心。目前,上述公司产品均可以通过国内代理商用人民币购到。已知国内的主要代理商有:北京中山生物技术有限公司,上海中达医学应用研究所,珠海基因科技有限公司,福州迈新生物技术开发公司等。
(1996-07-04 收稿), http://www.100md.com
单位：上海市第一人民医院病理科(200080)
关键词：免疫组织化学；免疫测定
河北医科大学学报990342 中图号 R371.3
1996年5月27日至31日,中华医学会病理学会、中华病理学杂志编辑部在北京召开了全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会。笔者作为河北医科大学代表出席会议并在大会作了专题学术报告。全国从事免疫组织化学研究的专家同道聚集一堂,各抒己见,研究成果各具特色。参加此次会议大大拓宽了视野,受益匪浅。本文荟萃此次大会报告论文之精华将免疫组织化学研究最新进展介绍如下。
1 免疫组织化学技术迅猛发展史
免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane等人于60年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger等人于70年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法)和PAP法(过氧化酶抗过氧化酶法)。80年代初期美籍华人Hsu又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法),自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,Streptavidin)与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP法,或称LSAB法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法)。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC法高4～8倍,比PAP法高8～16倍。进入90年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。有人做过这样一个统计,70年代利用免疫组织化学技术的科研论文全世界范围内每年不超过10篇,而今每年已超过1 万篇。
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2 免疫组织化学技术在临床病理诊断中的重要作用
100年前发明的用光学显微镜观察HE染色切片法仍然是当前各级医院病理科中的基本方法。该方法的局限性在于仅能从细胞水平反映疾病性质,诊断中观察者的主观推测成份高,常常是同一疾病出现分歧颇大的数个不同诊断,多年来成为临床病理诊断中的突出问题。而免疫组织化学方法是通过抗原抗体反应客观地反映疾病性质,在观察HE切片基础上,再结合免疫组织化学染色结果可对某一疾病做出较为客观公正的评价,从而可避免主观因素的影响。自免疫组织化学技术应用于临床病理诊断以来,在以下几类疾病的鉴别诊断中发挥着重要作用。
2.1 高度未分化肿瘤细胞起源的鉴别:发生在胃肠道的这类肿瘤应首选CEA与Vimentin两种抗体鉴别是上皮源性抑或是间叶源性肿瘤。因为CEA在消化道上皮源性肿瘤的阳性率高,但在鳞癌时阳性率低;而消化道以外部位发生者,上皮性标记物宜选用EMA,该抗体在90 %以上上皮源性肿瘤呈阳性表达。
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2.2 小圆细胞肿瘤的鉴别:小圆细胞肿瘤包括小细胞未分化癌、恶性淋巴瘤、小细胞软组织肉瘤、神经内分泌肿瘤以及小细胞黑色素瘤。这类肿瘤鉴别诊断时应使用EMA或CEA,LCA,Vimentin,NSE,S100和HMB45抗体。
2.3 大细胞型肿瘤鉴别:这类肿瘤可以是大细胞未分化癌、低分化肉瘤、大细胞性黑色素瘤和大细胞性恶性淋巴瘤。在鉴别诊断时应该选用EMA或CEA,Vimentin,S100和LCA抗体。
2.4 梭形或多形性软组织肉瘤的鉴别:此类肿瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形细胞血管肉瘤、梭形细胞黑色素瘤、多形性横纹肌肉瘤、多形性恶性纤维组织细胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。以下抗体可用于鉴别诊断:Actin,EMA,FⅧAg,S100,HMB45,Myoglobin,Desmin,α1-AT以及α1-ACT。
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2.5 恶性淋巴瘤分型:在免疫组织化学研究领域,当前对恶性淋巴瘤的免疫组织化学研究最为活跃与细致。截止目前为止,已有下列亚型可以通过免疫组织化学染色确立。它们是:B细胞淋巴瘤,L26阳性,LN2阳性;T细胞淋巴瘤,MT1阳性,UCHL1阳性;NK细胞淋巴瘤C123C阳性;树突网织细胞淋巴瘤,Ber-MAC-DRC阳性;指状突网织细胞淋巴瘤,S100阳性;真性组织细胞淋巴瘤,Mac387阳性,Lysozyme阳性,α1-ACT阳性;何杰金病R-S细胞,LeuM1阳性,Ber-H2阳性;大细胞间变型淋巴瘤Ber-H2(或称Ki-1)阳性。
2.6 神经内分泌肿瘤的确立:90 %以上的神经内分泌肿瘤NSE阳性。由于NSE与其它肿瘤有交叉反应,故必要时可加染Chromogranin A或Synaptophysin抗体。当需要弄清神经内分泌肿瘤有否内分泌功能时,再加染多肽类激素抗体。
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2.7 肿瘤预后的推测:最早用于推测肿瘤预后的抗体有抗雌激素受体ER及抗孕激素受体PR,二者阳性时预后较好。新近又发现,转移抑制基因产物nm23呈高表达时预后较好。而下列几种抗体呈高表达时均提示预后差:C-erbB-2,C-myc,P53,EGFR,PCNA,Ki-67,BrdU,P120,P105。
2.8 感染性疾病病原体的检测:其中HBsAg及HBcAg抗体常用于肝病研究与诊断。而尖锐湿疣及宫颈癌时常常可以检测到乳头状瘤病毒HPV。鼻咽癌、何杰金病时EB病毒抗体多呈阳性。
3 以免疫组织化学方法为研究手段的科研最新进展
免疫组织化学方法已成为当今形态学研究领域中不可缺少的研究手段。随着分子生物学和分子遗传学的进步,依靠免疫组织化学方法观察基因表达产物及细胞增殖功能是当前研究的热点课题。P53基因产物定位于细胞核内,迄今为止的研究提示,P53的高表达肿瘤预后较差。C-erbB-2基因产物定位于细胞膜,其表达意义与P53类似。nm23为转移抑制基因,其编码产物在肿瘤细胞的胞核及胞浆均可表达,研究显示,nm23呈高表达时预后较好。MDR-1为人类多药耐药基因,其基因产物定位于细胞膜,肿瘤细胞的MDR-1阳性表达率越高,对化疗药越不敏感,预后也就越差。PCNA与Ki-67是肿瘤细胞快速增殖标志,其阳性率高低与肿瘤的恶性程度成正比。此外,还有bcl-2,EGF,TGF,EGFR等凋亡相关基因或癌基因产物均处在研究阶段,结论尚待统一。
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4 免疫组织化学操作技术上的新进展
4.1 石蜡切片组织抗原性的恢复法:免疫组织化学染色成败的关键与组织切片中抗原性的存在与否有密切关系。临床病理检查时最常用的组织固定液甲醛是一种通过组织内蛋白质交联而达到固定作用的交联固定剂。这种固定剂虽然能很好地保持组织结构,但其交联作用可以使抗原分子形态结构发生变化或因大分子间的交联而遮盖了抗原决定簇。为此,人们发明出以下几种恢复(或称修复)石蜡切片抗原性的方法。
4.1.1 酶消化法:其中无花果蛋白酶Ficin为轻度消化酶,胰蛋白酶Trypsin为中等强度消化酶,胃蛋白酶Pepsin为强消化酶。
4.1.2 盐酸水解暴露抗原法:此法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间,以最大程度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
4.1.3 微波炉恢复抗原法:该法操作时应首先将石蜡切片置于缓冲液中,然后凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白,暴露被掩盖的抗原决定簇。目前,医用型与家用型二种微波炉均有人使用。
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4.1.4 高压锅恢复抗原法:有人用高压锅加热切片来暴露抗原。此法比微波炉更经济简单,适用于大批切片的加热处理。
4.1.5 煮沸恢复抗原法:既然热效应可以恢复抗原性,有人便采用将石蜡切片置于缓冲液中加热煮沸的方法,也获得了满意的染色结果,故认为加热煮沸法是恢复抗原性最为经济简便的方法。
4.2 应用显色增强剂加强DAB的显色效果:当某些原因使DAB显色减弱或显色缓慢时,可选用金属盐溶液作为显色增强剂。其原理是当切片加入DAB显色后,氧化型DAB产物与金属离子络合可使显色由棕黄转为棕黑或黑色。这类盐溶液包括氯化钴、硫酸镍胺、氯化金、氯化铁和硫酸铜等。
5 进口免疫组织化学试剂主要购入渠道
国际上免疫组织化学试剂经销公司主要有DAKO,Vector,Santa Cruz,Zymed,Monosan等。这些公司产品由于均已通过实验室阶段进入工业化成批生产,因而性能较为可靠,使用起来放心。目前,上述公司产品均可以通过国内代理商用人民币购到。已知国内的主要代理商有:北京中山生物技术有限公司,上海中达医学应用研究所,珠海基因科技有限公司,福州迈新生物技术开发公司等。
(1996-07-04 收稿), http://www.100md.com