脂多糖对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶基因表达的影响
作者：曾丽苹 韩 梅 温进坤
单位：河北医科大学基础医学研究所生化室(石家庄050017)
关键词：脂多糖类；代谢；一氧化氮；连接酶类；大鼠
河北医科大学学报990303 摘 要 目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)诱导型一氧化氮合酶( iNOS)基因表达及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法 细胞培养、RNA印迹分析和亚硝酸盐含量测定。结果 LPS是iNOS的强效诱导物，可在转录水平上诱导VSMC iNOS mRNA表达,促进NO的合成，其作用强度与LPS剂量呈正相关；刺激12 h后，VSMC iNOS的表达活性最高，24 h开始下降。结论 LPS对iNOS表达的诱导作用与其浓度和作用时间有关。
, 百拇医药
中图号 Q559
EFFECTS OF LIPOPOLYSACCHARIDES ON EXPRESSION OF INDUCIBLE
NITRIC OXIDE SYNTHASE GENE
Zeng Liping Han Mei Wen Jinkun
Department of Biochemistry, Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University (Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To study the effects of lipopolysaccharides (LPS) on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene in the cultured rat vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods With dot blotting, Northern blotting analysis and measurement of nitrite, the expression of iNOS gene and the synthesis of nitrite were observed in control and treated VSMC with LPS of different concentration (10,20,50 μg/ml) and the same concentration (10 μg/ml) for different time (6,12,24 h).Results iNOS mRNA increased after 6 h exposure to LPS. Abundance of iNOS mRNA peaked at 12 h. The changes of nitrite were the same as the expression of iNOS gene. Conclusion LPS induced iNOS mRNA in VSMC and led to the increase of nitrite in culture medium in a dose-dependent manner.
, 百拇医药
MeSH lipopolysaccharides/metab; nitric oxide; synthase; rat
一氧化氮(nitric oxide,NO)是近年发现的重要信息分子，广泛参与心血管、免疫和神经系统功能的调节，在心血管系统，NO具有舒张血管、降低血压、抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖和血小板粘附的作用。因此，与高血压、动脉粥样硬化等许多心血管疾病的发生发展有密切关系[1]。已经证明，哺乳动物血管壁细胞内存在两类性质不同的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)，一类是血管内皮细胞持续表达的cNOS(consistent nitric oxide synthase,cNOS)；另一类存在于VSMC的诱导型iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)，iNOS基因只有在受到某些细胞因子和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激时，才具有转录活性。无论在生理和病理状态下，NO的生物合成对于调节血管功能均具有重要作用。为了探讨血管细胞iNOS的诱导表达机制，本实验观察了LPS对VSMC iNOS基因表达及NO生成的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料：LPS(Sigma 公司)，iNOS cDNA探针(本室保存)；M199、核酸随机引物标记试剂盒购自Promega公司；[α-32P]dCTP(北京亚辉生物医学公司)。
1.2 方法
1.2.1 VSMC培养：取6周龄SD大鼠胸腹主动脉，按贴块法进行原代培养，培养液为含10 %小牛血清的M199；待VSMC长满培养瓶后，用0.25 %胰蛋白酶消化传代。实验用3～5代细胞。
1.2.2 Northern blot 及Dot blot分析：传代细胞生长至80 %汇合时，换用含不同浓度LPS的10 %小牛血清的M199培养液，继续培养细胞。于刺激0、6、12、24 h，收集VSMC，采用AGPC法提取细胞总RNA，在紫外260 nm波长下进行定量及OD260/OD280比值测定。每组RNA各取30 μg经1 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上；用样品变性液对20 μg RNA进行梯度稀释，分别点加2.5、5、10 μg RNA于硝酸纤维素膜上；固定后的尼龙膜和硝酸膜与用随机引物标记的iNOS cDNA探针进行杂交。
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1.2.3
测定：参照文献[2]:测定含量。取上述VSMC培养液800 μl，加入等体积的Greiss试剂浓度(0.1 %、1 %、5 %H3PO4)对氨基苯磺酰胺，N-(1-萘基)-乙二胺，室温放置10 min，用分光光度计于550 nm波长测定样品的吸光度，以亚硝酸钠为标准品制作标准曲线，浓度用μmol/L表示。
2 结 果
2.1 LPS刺激VSMC不同时间对 iNOS mRNA表达的影响:Dot印迹杂交显示，正常培养的对照VSMC iNOS基因表达活性很低。以10 μg/ml浓度的LPS处理VSMC 6 h，iNOS表达明显增加。作用12 h，杂交信号强度达到最大。持续至24 h，表达活性开始降低。杂交信号经密度扫描分析，LPS刺激VSMC 6,12,24 h， iNOS mRNA表达水平分别是对照VSMC的2.98,3.51,2.14倍(图1)。
, 百拇医药
图1 LPS刺激VSMC不同时间对iNOS基因表达的影响
Figure 1 Effect of LPS for different time
on expression of VSMC iNOS gene
2.2 不同浓度LPS对VSMC iNOS基因表达的影响:用不同浓度的LPS(10、20、50μg/ml)刺激VSMC 24 h后，进行Northern印迹分析，测得的杂交信号随LPS的浓度增加而增强，表现出明显的量-效关系。iNOS mRNA杂交带位于28S前沿，与文献报道的iNOS mRNA长度一致[3](图2)。
图2 不同浓度LPS对VSMC iNOS基因表达的影响
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Figure 2 Effect of LPS in different concentration
of expression of VSMC iNOS gene
2.3 LPS对 含量的影响:经LPS处理的VSMC，其培养液中含量明显升高，不同浓度的LPS作用于VSMC 24 h 含量的变化，与对照组相比，浓度分别增加3.5、4、4.5倍(图3)；同一浓度LPS(10 μg/ml)作用于VSMC不同时间，以作用12 h的含量最高(图4)。
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图3 不同浓度LPS 对NO合成的影响
Figure 3 Effect of LPS in different
concentration of in culture medium
图4 LPS刺激不同时间对NO合成的影响
Figure 4 Effect of LPS for different
time of in culture medium
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3 讨 论
近年来的研究表明，由LPS诱导的iNOS基因表达增强、NO生成过多是引起感染性休克的根本原因。然而，对LPS诱导VSMC iNOS基因进行表达的作用规律研究尚少。本文以LPS作为诱导剂，观察了不同浓度的LPS 作用于VSMC同一时间及相同浓度LPS作用不同时间对iNOS基因表达的影响。
实验结果显示，VSMC经LPS处理后iNOS mRNA表达明显增加，随着LPS浓度增高，iNOS基因的表达活性逐步增强；同一浓度的LPS 作用于VSMC不同时间对iNOS mRNA表达的影响不同，作用6 h，iNOS mRNA水平就明显增加，12 h达高峰，此后，呈现微弱的下降趋势。Xie等人报道[4]，LPS作用于小鼠巨噬细胞2～4 h后，iNOS mRNA表达开始增加，6～12 h达到峰值，24 h仍高于对照水平。由此说明，LPS对VSMC和巨噬细胞iNOS基因表达的影响及其NO含量的变化规律是一致的。NO一经合成便迅速与水、氧和超氧自由基反应生成和
，通过测定含量可间接反映NOS的活性及NO的多少。本实验结果表明，LPS作用于VSMC后, 含量的变化与iNOS基因表达活性的变化规律相符合，即随着iNOS mRNA表达增加,含量明显升高，提示被LPS 诱导表达的iNOS可翻译成iNOS蛋白质并催化NO合成。
, 百拇医药
本文为国家自然科学基金资助项目(No.39470270)
参考文献
1.Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology,and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991, 43(1):109
2.Ding AH, Nathan CF, Stuehr DJ. Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. J Immunol, 1988, 141(10): 2407
3.Beasley D, Eldridge M. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-synergistically induce NO synthase in rat vascular smooth muscle cells. Am J Physiol, 1994, 266(4): 1197
4.Xie QW, Whisnant R, Nathan C. Promoter of the mouse gene encoding calcium-independent nitric oxide synthase confers inducibility by interferon and bacterial lipopolysaccharide . J Exp Med, 1993, 177(6): 1779
(1999-03-11 收稿), http://www.100md.com
单位：河北医科大学基础医学研究所生化室(石家庄050017)
关键词：脂多糖类；代谢；一氧化氮；连接酶类；大鼠
河北医科大学学报990303 摘 要 目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)诱导型一氧化氮合酶( iNOS)基因表达及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法 细胞培养、RNA印迹分析和亚硝酸盐含量测定。结果 LPS是iNOS的强效诱导物，可在转录水平上诱导VSMC iNOS mRNA表达,促进NO的合成，其作用强度与LPS剂量呈正相关；刺激12 h后，VSMC iNOS的表达活性最高，24 h开始下降。结论 LPS对iNOS表达的诱导作用与其浓度和作用时间有关。
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中图号 Q559
EFFECTS OF LIPOPOLYSACCHARIDES ON EXPRESSION OF INDUCIBLE
NITRIC OXIDE SYNTHASE GENE
Zeng Liping Han Mei Wen Jinkun
Department of Biochemistry, Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University (Shijiazhuang 050017)
ABSTRACT Objective To study the effects of lipopolysaccharides (LPS) on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene in the cultured rat vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods With dot blotting, Northern blotting analysis and measurement of nitrite, the expression of iNOS gene and the synthesis of nitrite were observed in control and treated VSMC with LPS of different concentration (10,20,50 μg/ml) and the same concentration (10 μg/ml) for different time (6,12,24 h).Results iNOS mRNA increased after 6 h exposure to LPS. Abundance of iNOS mRNA peaked at 12 h. The changes of nitrite were the same as the expression of iNOS gene. Conclusion LPS induced iNOS mRNA in VSMC and led to the increase of nitrite in culture medium in a dose-dependent manner.
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MeSH lipopolysaccharides/metab; nitric oxide; synthase; rat
一氧化氮(nitric oxide,NO)是近年发现的重要信息分子，广泛参与心血管、免疫和神经系统功能的调节，在心血管系统，NO具有舒张血管、降低血压、抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖和血小板粘附的作用。因此，与高血压、动脉粥样硬化等许多心血管疾病的发生发展有密切关系[1]。已经证明，哺乳动物血管壁细胞内存在两类性质不同的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)，一类是血管内皮细胞持续表达的cNOS(consistent nitric oxide synthase,cNOS)；另一类存在于VSMC的诱导型iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)，iNOS基因只有在受到某些细胞因子和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激时，才具有转录活性。无论在生理和病理状态下，NO的生物合成对于调节血管功能均具有重要作用。为了探讨血管细胞iNOS的诱导表达机制，本实验观察了LPS对VSMC iNOS基因表达及NO生成的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料：LPS(Sigma 公司)，iNOS cDNA探针(本室保存)；M199、核酸随机引物标记试剂盒购自Promega公司；[α-32P]dCTP(北京亚辉生物医学公司)。
1.2 方法
1.2.1 VSMC培养：取6周龄SD大鼠胸腹主动脉，按贴块法进行原代培养，培养液为含10 %小牛血清的M199；待VSMC长满培养瓶后，用0.25 %胰蛋白酶消化传代。实验用3～5代细胞。
1.2.2 Northern blot 及Dot blot分析：传代细胞生长至80 %汇合时，换用含不同浓度LPS的10 %小牛血清的M199培养液，继续培养细胞。于刺激0、6、12、24 h，收集VSMC，采用AGPC法提取细胞总RNA，在紫外260 nm波长下进行定量及OD260/OD280比值测定。每组RNA各取30 μg经1 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上；用样品变性液对20 μg RNA进行梯度稀释，分别点加2.5、5、10 μg RNA于硝酸纤维素膜上；固定后的尼龙膜和硝酸膜与用随机引物标记的iNOS cDNA探针进行杂交。
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1.2.3
测定：参照文献[2]:测定含量。取上述VSMC培养液800 μl，加入等体积的Greiss试剂浓度(0.1 %、1 %、5 %H3PO4)对氨基苯磺酰胺，N-(1-萘基)-乙二胺，室温放置10 min，用分光光度计于550 nm波长测定样品的吸光度，以亚硝酸钠为标准品制作标准曲线，浓度用μmol/L表示。2 结 果
2.1 LPS刺激VSMC不同时间对 iNOS mRNA表达的影响:Dot印迹杂交显示，正常培养的对照VSMC iNOS基因表达活性很低。以10 μg/ml浓度的LPS处理VSMC 6 h，iNOS表达明显增加。作用12 h，杂交信号强度达到最大。持续至24 h，表达活性开始降低。杂交信号经密度扫描分析，LPS刺激VSMC 6,12,24 h， iNOS mRNA表达水平分别是对照VSMC的2.98,3.51,2.14倍(图1)。
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图1 LPS刺激VSMC不同时间对iNOS基因表达的影响
Figure 1 Effect of LPS for different time
on expression of VSMC iNOS gene
2.2 不同浓度LPS对VSMC iNOS基因表达的影响:用不同浓度的LPS(10、20、50μg/ml)刺激VSMC 24 h后，进行Northern印迹分析，测得的杂交信号随LPS的浓度增加而增强，表现出明显的量-效关系。iNOS mRNA杂交带位于28S前沿，与文献报道的iNOS mRNA长度一致[3](图2)。
图2 不同浓度LPS对VSMC iNOS基因表达的影响
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Figure 2 Effect of LPS in different concentration
of expression of VSMC iNOS gene
2.3 LPS对
含量的影响:经LPS处理的VSMC，其培养液中含量明显升高，不同浓度的LPS作用于VSMC 24 h 含量的变化，与对照组相比，浓度分别增加3.5、4、4.5倍(图3)；同一浓度LPS(10 μg/ml)作用于VSMC不同时间，以作用12 h的含量最高(图4)。, http://www.100md.com
图3 不同浓度LPS 对NO合成的影响
Figure 3 Effect of LPS in different
concentration of
in culture medium图4 LPS刺激不同时间对NO合成的影响
Figure 4 Effect of LPS for different
time of
in culture medium, http://www.100md.com
3 讨 论
近年来的研究表明，由LPS诱导的iNOS基因表达增强、NO生成过多是引起感染性休克的根本原因。然而，对LPS诱导VSMC iNOS基因进行表达的作用规律研究尚少。本文以LPS作为诱导剂，观察了不同浓度的LPS 作用于VSMC同一时间及相同浓度LPS作用不同时间对iNOS基因表达的影响。
实验结果显示，VSMC经LPS处理后iNOS mRNA表达明显增加，随着LPS浓度增高，iNOS基因的表达活性逐步增强；同一浓度的LPS 作用于VSMC不同时间对iNOS mRNA表达的影响不同，作用6 h，iNOS mRNA水平就明显增加，12 h达高峰，此后，呈现微弱的下降趋势。Xie等人报道[4]，LPS作用于小鼠巨噬细胞2～4 h后，iNOS mRNA表达开始增加，6～12 h达到峰值，24 h仍高于对照水平。由此说明，LPS对VSMC和巨噬细胞iNOS基因表达的影响及其NO含量的变化规律是一致的。NO一经合成便迅速与水、氧和超氧自由基反应生成
和，通过测定含量可间接反映NOS的活性及NO的多少。本实验结果表明，LPS作用于VSMC后, 含量的变化与iNOS基因表达活性的变化规律相符合，即随着iNOS mRNA表达增加,含量明显升高，提示被LPS 诱导表达的iNOS可翻译成iNOS蛋白质并催化NO合成。, 百拇医药
本文为国家自然科学基金资助项目(No.39470270)
参考文献
1.Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology,and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991, 43(1):109
2.Ding AH, Nathan CF, Stuehr DJ. Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. J Immunol, 1988, 141(10): 2407
3.Beasley D, Eldridge M. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-synergistically induce NO synthase in rat vascular smooth muscle cells. Am J Physiol, 1994, 266(4): 1197
4.Xie QW, Whisnant R, Nathan C. Promoter of the mouse gene encoding calcium-independent nitric oxide synthase confers inducibility by interferon and bacterial lipopolysaccharide . J Exp Med, 1993, 177(6): 1779
(1999-03-11 收稿), http://www.100md.com