HLA-DQ位点多态性研究及在法医学中应用
作者：李琳 赖淑苹
单位：李琳 赖淑苹(铁道部郑州公安管理干部学院侦察系刑事技术教研室 郑州 450053)
关键词：
主要组织相容性复合体 主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)在人类即为人类白细胞抗原系统(Human leukocyte antigen ,HLA)。HLA是目前已知的最复杂的人类多态性显性遗传系统。目前，发现其表现型数目多达几亿种，是法医学个体识别、亲权鉴定最理想的遗传标记检测系统。此外，HLA作为人类主要组织相容性复合物系统，在器官移植配型、疾病相关研究及肿瘤免疫机制诸多领域有极高的应用价值。自从1958年Dausset发现第一个人类白细胞抗原至今40年间，关于HLA的研究、发展从未停止。70～80年代是HLA血清学的“鼎盛时期”，进入90年代，随着分子生物学技术的突飞猛进，特别是PCR扩增DNA片段技术的发明，以PCR为基出的HLA-DNA分型方法的诞生，使HLA在基因结构、表达调控、功能和医学上的意义研究方面日益深入。
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1 HLA-DQ位点的多态性
HLA复合体位于人类第6号染色体短臂上，长约3500 kb,占人类基因组的1/3000。根据1995年世界卫生组织命名委员会公布的最新命名报告，HLA有100多个基因座位，共554种等位基因[1]。HLA按其编码产物的结构、表达方式、组织分布与功能可将HLA基因分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，Ⅱ类基因主要包括：HLA-DR、DP和DQ三个亚区。HLADQ区有2个DQA基因(DQA1、DQA2)和三个DQB基因(DQB1、DQB2和DQB3)，其中DQA1和DQB1为结构基因，DQA2、DQB2和DQB3的功能还不十分清楚。DQ的表型或血清型由DQB1决定，传统的血清学方法可检到DQ1-DQ9分子。HLADQ的等位基因多态性由DQA1、B1位点基因的第二外显子DNA多态性决定。采用分子生物学方法在基因水平上对DQ位点进行研究。用与该区域两侧的保守区序列互补的引物通过PCR可以大量扩增这些多态区域，DQA1扩增片段为242 bp或239 bp,DQB1为214 bp。然后采取不同方法将DQA1、DQB1等位基因检测出来。现已发现的HLA-DQA1等位基因18个，DQB1 31个。
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1996年召开的第12届国际组织相容性讨论会标志着HLA多态性研究进入一个新阶段，HLA基因转录调节区成为新的多态性研究热点[2]。HLA基因不同于真核细胞的其他基因，其调节转录的相应核苷酸区段结构多变，而且这种变异可通过自然选择以等位基因形式被保留下来形成多态性。一旦这些结构改变出现在顺式调控元件如X、Y、W框中，将影响后者和反式调节蛋白的专一性结合而不能启动HLA结构基因的转录表达[3]。黄立东等测定了中国汉族人HLA纯合细胞SMY-43A的DQA1.0601基因启动子区(QAP)核苷酸序列，发现顺式作用元件W框中-215和-216位核苷酸组成与已报道的白种人DQA1.0601的QAP序列不同[4]。Kimura等人发现在QAP中Y框的变异引起的DQA1基因表达水平的显著降低[5]，Haas等人则检出了上述X框中的变异与早发性少关节-青少年慢性关节炎易感性之间存在着很强的关联[6]。DQB1区上游的X、W框内存在着多态性[7]。启动子区的不同结构变异往往和特定等位基因呈现连锁不平衡。其结果，可形成所谓等位基因的特异性转录调节，造成HLA分子的表达强度因等位基因不同而出现差异，最终可能导致特定等位基因携带者对某些疾病易感。
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2 研究方法
自80年代后期起，HLA-DNA分型技术逐渐取代了传统的血清学方法。其中最早使用的RFLP技术，已被以PCR为基础的各种DNA分型技术所替代。后者具有以下优点：①试剂是人工合成的，来源没有限制，易标准化；②直接对基因本身进行检测，结果可靠；③灵敏度高，只需几个ng的NDA即可扩增分型，PCR只扩增DNA分子中某一特殊短片段，具有相对强的抗环境因素影响能力，解决了法医物证验材微量、陈旧、腐败的检验问题。④自动化程度高、简便、快速。
PCR-SSOP是一个以PCR为基础的HLA-Ⅱ类分子DNA分型技术，分辨力高，当应用于大样本时，具有快速、经济的优点，适合于大规模群体调查。该方法近十年来不断完善，发展了生物素、地高辛等非同位素标记系统及酶显色和化学发光显示技术，根据反向斑点杂交原理开发出的INNO-LIPA试剂盒，适合于个别样本的检测，很方便地应用于法医学鉴定。有关PCR-SSOP的引物序列、PCR反应条件、探针序列及杂交条件等详细内容，第11届国际组织相容性讨论会有详细而严格的规定。该法已广泛 应用于HLA-Ⅱ类基因分型[8]。
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与RFLP方法相比较，PCR-RFLP特异性高，不需使用探针，是一种简便快速的方法。但它依然存在一些缺点，如PCR-RFLP的酶有时不能充分消化扩增产物，对一些几乎等长的基因片段，因电泳位置相近而难以精确辩认，对于杂合子个体有些组合区别不清。已用于DQA1、DQB1基因分析[9]。PCR-SSCP虽不能确定每个样品的基因型别，但在法医学个体识别中能鉴定两分检材是否来自同一个体。已用于DQA1、DQB1基因分型[10]；PCR-SSCP具有高度特性，简便、快速、结果一目了然等优点，适合于小样本检测，近几年应用越来越多，已用于DQA1、DQB1基因分型[11]；而测定扩增产物全长核苷酸顺序的SBT方法获得的信息量最大，能最全面地揭示HLA基因的多态性，测定过程和等位基因指定可全部自动化[12]。
3 法医学上的应用
由于HLA的高度遗传多态性，它在法医学个体识别和亲权鉴定中显示日益重要的应用价值。在亲权鉴定中被公认为最有识别力的血型系统。自从PCR技术问世以来，已有许多基因位点的分型系统开始应用于法医学个体识别和亲权鉴定，其中应用最为广泛、技术最为成熟的是HLA-DQA1基因分型系统。目前，Cetus公司推出的HLA-DQA1基因PCR-SSCP分型试剂盒，包括9种探针，一对引物，可鉴定DQA1位点中的6个常见等位基因。即DQA10101，0102，0103，0201，0301和0401，这6种等位基因可组成21种基因型。现已积累了有关高加索人、黑人和亚州人种的等位基因及基因型的发生频率，其频率范围从0.005以下到0.15，个体识别为0.93，其基因型分布符合遗传平衡定律，家系调查表明其基因按孟德尔遗传规律遗传。为了评估HLA-DQA1检测的可重复性，选择1000份样品，均作复份，其中取100份，一式三份重复，结果只有1份因为斑点显色较弱误判，其余全部符合。对于模拟现场物证，如陈旧血痕、精斑、毛发等检测未发现因时间因素影响了检测。实际案例检材HLA-DQA1分型成功率为单根毛发34%～38%，精斑71%～93%,血痕30%～62%。DQA1型别分析在刑事案件侦破中已发挥出重大作用。美国联邦调查局认可该技术并实际应用，世界各国也纷纷采用并已标准化[13，14]。
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Allen等为测定HLA-Ⅱ类基因DNA分型在法医分析中的价值，使用PCR-SSCP方法检测了两个瑞典人群(南部及中部)DQA1、DQB1、DPB1及DRB1基因。其中DQB1检出14种等位基因，51种基因型。在两个人群之间观察到DQB1位点上有意义的等位基因频率差异，在其中一个瑞典人群和一个挪威人群之间也观察到这种差异，杂合度0.74～0.91，个体识别力0.90～0.98。他们的研究还表明该位点等位基因按孟德尔遗传规律遗传。Allem并把此项研究应用于司法实践中，一例亲权鉴定案，一例强奸案(物证及对照物证均为毛发)检测结果为这两个案例提供了重要信息[15]。
4 国内研究状况及今后方向
我国幅员辽阔，民族众多，HLA-DNA分型技术起步晚，HLA群体遗传资料不完善，研究成果也未充分扩展到法医学应用中。建立我国不同地区、不同民族HLA-DQ位点等位基因频率分布资料，为司法实践服务，是我们今后努力的方向。
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参考文献
1 Bodmer JG,Marsh SCE,Albert DE et al.Nomenclature for factors of the HLA system.Hum Ummunol ,1995;432∶149
2 Charron D(Ed).Abstracts of 12th international histocompatibility conference with the participation of european Foundation for immunogenetics.Human Immunology,1996;47∶1～166
3 Benoist C, Mathis D.Regulation of major histocompatibility compley class Ⅱ genes:X Y and other letters of Alphabet.Annu Rev Immunol,1990;8∶681
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4 黄立东，陆佩华，林琳等.中国汉族人HLA-DQA10601基因转录启动子区显示新的核酸序列.上海免疫学杂志，1997；17(1)∶10
5 Kimura A,Sasauki T.Polymorphism in the 5' flanking region of the HLA-DQA1 gene and its relation to the DR-DQ haplotype.HLA 1991 Oxford, Oxford University Press, 1992;2∶382
6 Haas JP,Kimura A,Truckenbrodt N et al.Early-onset Pauciarticular juivenile chronic arthritis is associated with a mutation in the Y-box the HLA-DQA1 promoter. Tissue Anrtgens, 1995;45∶317
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7 Anderson LC,Beaty JS,Nettles JW et al.Allelic polymorphismic transcriptional regulation regions of HLA-DQB genes.J Exp Med,1991;173∶491
8 Gao X, Sun Y,An J et al.DNA typing for HLA-DR,-DQ and -DR alleles in a chinese population using the PCR and oligonucleotide probes.Tissue Antigens,1991;38∶24
9 Ota M,Saki T,Nomura N et al.Modified PCR-RELP method for HLA-DQB1 and DQA1 genotyping .Tissue Antigens,1991;38∶60
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10 Katsunori A,Tomio Fumiya O et al.Polymerase chain reactin (RCR)/single -strand conformation polymorphism (SSCP) analsis of the human HLA-DQB regions.Jpn J Legal Med,1994;48(1)∶38
11 Olerup O,Aldemer A,Fogdell A.HLA-DQB1 and DQA1 typing by PCR amlification with sequence-specific primers(PCR-SSP) in 2 .Tissue Antigens, 1993;41∶119
12 Santamaria P,Boyce Jacino M,Lindstrom A et al.HLA calss Ⅱ "typing" direct sequencing of DRB,DQB and DQA genes.Hum Immunol,1992;33∶69
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13 Blake E,Mihalorich J,Higuchi R et al.Polymerase chain reacion (PCR) amplification and human leukocyte antigen(HLA)-DQA oligonucleotide typing on biological evidence sample:caseword experience:J Forensic Sci, 1992;37(3)∶700
14 杨庆恩.DNA在法庭科学中的应用.北京：中国人民公安大学出版社，1994∶161～163
15 Allen M,Saldeen T,Pettersson U et al.Genetic typing of HLA class Ⅱ genes in Swedish populations:application to forensic analysis:J Forensic Sci,1993;38(3)∶554
(1999-01-28收稿 1999-03-24修回), http://www.100md.com
单位：李琳 赖淑苹(铁道部郑州公安管理干部学院侦察系刑事技术教研室 郑州 450053)
关键词：
主要组织相容性复合体 主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)在人类即为人类白细胞抗原系统(Human leukocyte antigen ,HLA)。HLA是目前已知的最复杂的人类多态性显性遗传系统。目前，发现其表现型数目多达几亿种，是法医学个体识别、亲权鉴定最理想的遗传标记检测系统。此外，HLA作为人类主要组织相容性复合物系统，在器官移植配型、疾病相关研究及肿瘤免疫机制诸多领域有极高的应用价值。自从1958年Dausset发现第一个人类白细胞抗原至今40年间，关于HLA的研究、发展从未停止。70～80年代是HLA血清学的“鼎盛时期”，进入90年代，随着分子生物学技术的突飞猛进，特别是PCR扩增DNA片段技术的发明，以PCR为基出的HLA-DNA分型方法的诞生，使HLA在基因结构、表达调控、功能和医学上的意义研究方面日益深入。
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1 HLA-DQ位点的多态性
HLA复合体位于人类第6号染色体短臂上，长约3500 kb,占人类基因组的1/3000。根据1995年世界卫生组织命名委员会公布的最新命名报告，HLA有100多个基因座位，共554种等位基因[1]。HLA按其编码产物的结构、表达方式、组织分布与功能可将HLA基因分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，Ⅱ类基因主要包括：HLA-DR、DP和DQ三个亚区。HLADQ区有2个DQA基因(DQA1、DQA2)和三个DQB基因(DQB1、DQB2和DQB3)，其中DQA1和DQB1为结构基因，DQA2、DQB2和DQB3的功能还不十分清楚。DQ的表型或血清型由DQB1决定，传统的血清学方法可检到DQ1-DQ9分子。HLADQ的等位基因多态性由DQA1、B1位点基因的第二外显子DNA多态性决定。采用分子生物学方法在基因水平上对DQ位点进行研究。用与该区域两侧的保守区序列互补的引物通过PCR可以大量扩增这些多态区域，DQA1扩增片段为242 bp或239 bp,DQB1为214 bp。然后采取不同方法将DQA1、DQB1等位基因检测出来。现已发现的HLA-DQA1等位基因18个，DQB1 31个。
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1996年召开的第12届国际组织相容性讨论会标志着HLA多态性研究进入一个新阶段，HLA基因转录调节区成为新的多态性研究热点[2]。HLA基因不同于真核细胞的其他基因，其调节转录的相应核苷酸区段结构多变，而且这种变异可通过自然选择以等位基因形式被保留下来形成多态性。一旦这些结构改变出现在顺式调控元件如X、Y、W框中，将影响后者和反式调节蛋白的专一性结合而不能启动HLA结构基因的转录表达[3]。黄立东等测定了中国汉族人HLA纯合细胞SMY-43A的DQA1.0601基因启动子区(QAP)核苷酸序列，发现顺式作用元件W框中-215和-216位核苷酸组成与已报道的白种人DQA1.0601的QAP序列不同[4]。Kimura等人发现在QAP中Y框的变异引起的DQA1基因表达水平的显著降低[5]，Haas等人则检出了上述X框中的变异与早发性少关节-青少年慢性关节炎易感性之间存在着很强的关联[6]。DQB1区上游的X、W框内存在着多态性[7]。启动子区的不同结构变异往往和特定等位基因呈现连锁不平衡。其结果，可形成所谓等位基因的特异性转录调节，造成HLA分子的表达强度因等位基因不同而出现差异，最终可能导致特定等位基因携带者对某些疾病易感。
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2 研究方法
自80年代后期起，HLA-DNA分型技术逐渐取代了传统的血清学方法。其中最早使用的RFLP技术，已被以PCR为基础的各种DNA分型技术所替代。后者具有以下优点：①试剂是人工合成的，来源没有限制，易标准化；②直接对基因本身进行检测，结果可靠；③灵敏度高，只需几个ng的NDA即可扩增分型，PCR只扩增DNA分子中某一特殊短片段，具有相对强的抗环境因素影响能力，解决了法医物证验材微量、陈旧、腐败的检验问题。④自动化程度高、简便、快速。
PCR-SSOP是一个以PCR为基础的HLA-Ⅱ类分子DNA分型技术，分辨力高，当应用于大样本时，具有快速、经济的优点，适合于大规模群体调查。该方法近十年来不断完善，发展了生物素、地高辛等非同位素标记系统及酶显色和化学发光显示技术，根据反向斑点杂交原理开发出的INNO-LIPA试剂盒，适合于个别样本的检测，很方便地应用于法医学鉴定。有关PCR-SSOP的引物序列、PCR反应条件、探针序列及杂交条件等详细内容，第11届国际组织相容性讨论会有详细而严格的规定。该法已广泛 应用于HLA-Ⅱ类基因分型[8]。
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与RFLP方法相比较，PCR-RFLP特异性高，不需使用探针，是一种简便快速的方法。但它依然存在一些缺点，如PCR-RFLP的酶有时不能充分消化扩增产物，对一些几乎等长的基因片段，因电泳位置相近而难以精确辩认，对于杂合子个体有些组合区别不清。已用于DQA1、DQB1基因分析[9]。PCR-SSCP虽不能确定每个样品的基因型别，但在法医学个体识别中能鉴定两分检材是否来自同一个体。已用于DQA1、DQB1基因分型[10]；PCR-SSCP具有高度特性，简便、快速、结果一目了然等优点，适合于小样本检测，近几年应用越来越多，已用于DQA1、DQB1基因分型[11]；而测定扩增产物全长核苷酸顺序的SBT方法获得的信息量最大，能最全面地揭示HLA基因的多态性，测定过程和等位基因指定可全部自动化[12]。
3 法医学上的应用
由于HLA的高度遗传多态性，它在法医学个体识别和亲权鉴定中显示日益重要的应用价值。在亲权鉴定中被公认为最有识别力的血型系统。自从PCR技术问世以来，已有许多基因位点的分型系统开始应用于法医学个体识别和亲权鉴定，其中应用最为广泛、技术最为成熟的是HLA-DQA1基因分型系统。目前，Cetus公司推出的HLA-DQA1基因PCR-SSCP分型试剂盒，包括9种探针，一对引物，可鉴定DQA1位点中的6个常见等位基因。即DQA10101，0102，0103，0201，0301和0401，这6种等位基因可组成21种基因型。现已积累了有关高加索人、黑人和亚州人种的等位基因及基因型的发生频率，其频率范围从0.005以下到0.15，个体识别为0.93，其基因型分布符合遗传平衡定律，家系调查表明其基因按孟德尔遗传规律遗传。为了评估HLA-DQA1检测的可重复性，选择1000份样品，均作复份，其中取100份，一式三份重复，结果只有1份因为斑点显色较弱误判，其余全部符合。对于模拟现场物证，如陈旧血痕、精斑、毛发等检测未发现因时间因素影响了检测。实际案例检材HLA-DQA1分型成功率为单根毛发34%～38%，精斑71%～93%,血痕30%～62%。DQA1型别分析在刑事案件侦破中已发挥出重大作用。美国联邦调查局认可该技术并实际应用，世界各国也纷纷采用并已标准化[13，14]。
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Allen等为测定HLA-Ⅱ类基因DNA分型在法医分析中的价值，使用PCR-SSCP方法检测了两个瑞典人群(南部及中部)DQA1、DQB1、DPB1及DRB1基因。其中DQB1检出14种等位基因，51种基因型。在两个人群之间观察到DQB1位点上有意义的等位基因频率差异，在其中一个瑞典人群和一个挪威人群之间也观察到这种差异，杂合度0.74～0.91，个体识别力0.90～0.98。他们的研究还表明该位点等位基因按孟德尔遗传规律遗传。Allem并把此项研究应用于司法实践中，一例亲权鉴定案，一例强奸案(物证及对照物证均为毛发)检测结果为这两个案例提供了重要信息[15]。
4 国内研究状况及今后方向
我国幅员辽阔，民族众多，HLA-DNA分型技术起步晚，HLA群体遗传资料不完善，研究成果也未充分扩展到法医学应用中。建立我国不同地区、不同民族HLA-DQ位点等位基因频率分布资料，为司法实践服务，是我们今后努力的方向。
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参考文献
1 Bodmer JG,Marsh SCE,Albert DE et al.Nomenclature for factors of the HLA system.Hum Ummunol ,1995;432∶149
2 Charron D(Ed).Abstracts of 12th international histocompatibility conference with the participation of european Foundation for immunogenetics.Human Immunology,1996;47∶1～166
3 Benoist C, Mathis D.Regulation of major histocompatibility compley class Ⅱ genes:X Y and other letters of Alphabet.Annu Rev Immunol,1990;8∶681
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4 黄立东，陆佩华，林琳等.中国汉族人HLA-DQA10601基因转录启动子区显示新的核酸序列.上海免疫学杂志，1997；17(1)∶10
5 Kimura A,Sasauki T.Polymorphism in the 5' flanking region of the HLA-DQA1 gene and its relation to the DR-DQ haplotype.HLA 1991 Oxford, Oxford University Press, 1992;2∶382
6 Haas JP,Kimura A,Truckenbrodt N et al.Early-onset Pauciarticular juivenile chronic arthritis is associated with a mutation in the Y-box the HLA-DQA1 promoter. Tissue Anrtgens, 1995;45∶317
, 百拇医药
7 Anderson LC,Beaty JS,Nettles JW et al.Allelic polymorphismic transcriptional regulation regions of HLA-DQB genes.J Exp Med,1991;173∶491
8 Gao X, Sun Y,An J et al.DNA typing for HLA-DR,-DQ and -DR alleles in a chinese population using the PCR and oligonucleotide probes.Tissue Antigens,1991;38∶24
9 Ota M,Saki T,Nomura N et al.Modified PCR-RELP method for HLA-DQB1 and DQA1 genotyping .Tissue Antigens,1991;38∶60
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10 Katsunori A,Tomio Fumiya O et al.Polymerase chain reactin (RCR)/single -strand conformation polymorphism (SSCP) analsis of the human HLA-DQB regions.Jpn J Legal Med,1994;48(1)∶38
11 Olerup O,Aldemer A,Fogdell A.HLA-DQB1 and DQA1 typing by PCR amlification with sequence-specific primers(PCR-SSP) in 2 .Tissue Antigens, 1993;41∶119
12 Santamaria P,Boyce Jacino M,Lindstrom A et al.HLA calss Ⅱ "typing" direct sequencing of DRB,DQB and DQA genes.Hum Immunol,1992;33∶69
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13 Blake E,Mihalorich J,Higuchi R et al.Polymerase chain reacion (PCR) amplification and human leukocyte antigen(HLA)-DQA oligonucleotide typing on biological evidence sample:caseword experience:J Forensic Sci, 1992;37(3)∶700
14 杨庆恩.DNA在法庭科学中的应用.北京：中国人民公安大学出版社，1994∶161～163
15 Allen M,Saldeen T,Pettersson U et al.Genetic typing of HLA class Ⅱ genes in Swedish populations:application to forensic analysis:J Forensic Sci,1993;38(3)∶554
(1999-01-28收稿 1999-03-24修回), http://www.100md.com