涎腺肿瘤组织中人乳头瘤病毒DNA的检测
作者：梁志刚 付伟 楚雍烈 付强
单位：梁志刚 付伟(深圳市红十字会医院 深圳 510029)；楚雍烈 西安医科大学微生物学教研室；付强 中国人民解放军第323医院口腔科
关键词：涎腺肿瘤；人乳头瘤病毒；聚合酶链反应
西安医科大学学报/990329 摘要 为探讨腺上皮起源的涎腺良、恶性肿瘤与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)感染的关系，应用聚合酶链反应技术(PCR)，采用共有引物检测44例涎腺肿瘤组织中的HPV DNA的存在状况。10例正常涎腺组织作为对照。结果显示：肿瘤组织中HPV DNA阳性检出率达70.45%(31/44)，其中恶性肿瘤 HPV DNA阳性率为77.27%(31/44)；良性肿瘤HPV DNA阳性率为63.63%(14/22)；而正常对照组织中HPV DNA阳性率仅为10%(1/10)。提示：涎腺肿瘤的发生可能与HPV感染有关。
, 百拇医药
DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN
SALIVARY GLAND TUMORS
Liang Zhigang ,Fu Wei ,Chu Yonglie et al
(Red Cross Hospital of Shenzhen)
Abstract To discover the relationship between human papillomavirus (HPV) and salivary gland tumor, the polymerase chain reaction (PCR) was used to detect HPV DNA in 44 cases of formalin-fixed, paraffin-embedded salivary gland tumor tissues and 10 cases of normal salivary gland tissues.The results showed that the total positive rate of HPV DNA was 70.45% (31/44);For benign tumor HPV DNA positive rate was 63.63%(14/22) and for malignant tumor was 77.27%(17/22).In contrast, HPV DNA positive rate was total to be 10%(1/10) in normal gland tissues (70.45% vs 10%，P<0.01).The results suggests that HPV plays a role in carcinogenesis of salivary gland tumor.
, 百拇医药
Key words salivary gland tumor;human papillomavirus;polymerase chain reaction
涎腺肿瘤是颌面部所特有的第二大类肿瘤，对于涎腺肿瘤病毒病因学的研究目前正处于探索阶段，特别是涎腺肿瘤与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)这种与多种肿瘤相关的肿瘤病毒的关系，尚未见有专题报道。许多研究表明，来源于腺上皮的肿瘤发生与HPV相关[1，2]。而涎腺肿瘤95%来自腺上皮。为探讨涎腺肿瘤与人乳头瘤病毒感染的关系，本实验运用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术，对44例甲醛固定、石蜡包埋的涎腺肿瘤组织块和10例正常涎腺组织中的HPV DNA进行检测，以探索HPV在涎腺肿瘤中的致癌作用。
材料与方法
1 标本来源 44份人涎腺肿瘤标本均取自西安医科大学口腔医学院病理科，经10%甲醛固定，乙醇脱水后石蜡包埋，采集年限自1987年至1995年，经病理诊断证实良、恶性肿瘤各22例。年龄19～63岁，平均年龄38.6岁。男女比例1∶1。良性肿瘤中多形性腺瘤发生于腮腺者5例、颌下腺者6例，舌下腺者2例。腺淋巴瘤6例，基底细胞腺瘤1例，乳头状囊腺癌2例，患者平均年龄36.8岁。恶性肿瘤中恶性多形性腺瘤2例，粘液表皮样癌4例，腺泡细胞癌3例，乳头状囊腺癌2例，腺癌4例，基底细胞腺癌2例。未分化癌3例，腺样囊性癌2例。所有患者术前均未经放疗、化疗等抗癌治疗。切片厚度为7 μm，连续切片3张。10例正常人涎腺组织标本取自西安医科大学第一临床医学院，为外伤患者修剪的涎腺组织，镜下未见有癌细胞，-70℃中冻存备用。
, http://www.100md.com
2 研究方法
2.1 主要药品试剂 蛋白酶K、DNA标准分子量参照物、HPV DNA共有引物试剂盒(华美生物工程公司)，十二烷基磺酸钠(SDS，德国Serva公司)。
2.2 正常组织DNA的提供 采用酚-氯仿、异戊醇提取法。
2.3 石蜡包埋涎腺肿瘤组织DNA的提取 取7 μm厚石蜡切片3张，加入二甲苯浸没，室温放置，每4 h换液一次，浸泡时间为12 h，每次换液前5000 r/min离心2 min。按常规进行梯度水化后用SSC漂洗一次40 min,5000 r/min离心2 min，弃上清备用，DNA提取方法同正常组织。 2.4 PCR扩增 反应总体积为30μl，反应参数为：94℃预变性5min，94℃，60s，55℃ 60s,72℃ 90s。循环35次后72℃延伸5min。取8μl扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。为确保PCR反应的准确性。每组试验均设阳性对照(HPV16阳性质粒)和阴性对照(pUC18质粒)。
, 百拇医药
结果
44例涎腺肿瘤组织中，肿瘤组织阳性率为70.45%(31/44)，10例正常涎腺组织HPV检测阳性率为10%(1/10)；χ2检验：P<0.005，两组间有显著性差异。DNA经PCR扩增部分结果如图所示，阳性样品在270bp处出现了与预期大小相似的条带。
附图 PCR扩增结果
M：标准分子量参照(PCR Marker，华美公司)
1：阳性对照 2：阴性对照
3，4：阳性样品(扩增片段为270bp)
44例涎腺肿瘤患者中，良性22例，HPV阳性14例，阳性率为63.63%；恶性22例，HPV阳性17例，阳性率为77.27%，χ2检验，两组间无显著性差异。
, 百拇医药
涎腺良、恶性肿瘤患者HPV阳性病例性别分布比较：31例HPV阳性病例中，男性16例，女性15例，χ2检验：0.75
讨论
以往人们认为HPV是一种嗜鳞状上皮的DNA肿瘤病毒，与鳞癌，特别是宫颈鳞癌密切相关。近年来的研究也侧重于HPV感染对鳞状上皮肿瘤的致病性。随着HPV DNA流行病学调查的深入，许多研究表明HPV感染同样存在于腺上皮肿瘤中，但检出率差异很大[3～5]，这可能与肿瘤的部位，研究的方法，样本的大小及地域的不同等因素有关，为探讨HPV与涎腺肿瘤的关系，本试验运用HPV共有引物PCR法，对44例涎腺肿瘤进行了HPV DNA的检测，总阳性率为70.45%，而正常涎腺组织中HPV DNA的阳性检出率仅为10%，提示HPV在涎腺肿瘤发生中起一定的作用。
44例涎腺肿瘤组织诊断证实良、恶性肿瘤各22例，PCR检测发现良性肿瘤组织中HPV阳性率为63.63%，恶性肿瘤中HPV阳性率为77.27%，虽然HPV阳性检出率并无大的差异，但其肿瘤的良、恶性不同，结合以往的大量研究。我们认为可能与不同组织中感染的HPV种类不同有关。因为根据不同组织病变中检出HPV型别的不同及其致癌潜能的不同，HPV被分为两大类，即高危型HPV和低危型HPV，已有的研究表明高危型HPV主要通过其病毒DNA整合到宿主细胞染色体上，引起相应组织细胞基因调控失调，导致细胞向恶性表型转化并发生癌变，而低危型HPV进入宿主体内后游离于宿主细胞染色体外，可激发细胞的分裂增殖，导致许多良性增生性疾病。但是由于本试验仅采用了共有引物进行检测，所以不能确定涎腺肿瘤组织中HPV的种类，这方面有待更深入的研究。
, http://www.100md.com
1982年Zur Hausen提出HPV致癌模型，认为HPV作为起动因子，疱疹病毒或吸入的烟草是起始因子，二者相互协同，促进上皮癌变[6]。本组31例HPV阳性涎腺肿瘤中，男女比例相似，χ2检验无显著差异，提示烟酒等局部理化刺激与涎腺肿瘤无关，大量宫颈癌文献报告中也未发现HPV感染与烟酒嗜好相关，对于其关系应进一步追踪观察。
PCR具有高度的敏感性和特异性，即使是皮克(pg)的痕迹量DNA，扩增后经电泳及染色后仍可确证。共有引物是DNA同源性的最佳聚合，采用共有引物PCR可检测已定型和未定型的HPV，大大提高检测的敏感性。实验中在阴性对照中未见扩增条带，在阳性对照中扩增出与预计大小一致的扩增条带，也证实了PCR扩增的特异性，依据本实验的阴性对照和阳性对照进行判定，实验结果是可靠的。运用PCR检测甲醛固定、石蜡包埋涎腺肿瘤组织中HPV感染，具有取材方便，结果可靠和诊断明确等特点，有报道即使保存40年之久的已有不同程度降解蜡块中的DNA也能成功的被扩增[7]，这使回顾性研究有了大量的标本，有利于肿瘤的分子流行病学调查及肿瘤的回顾性研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Hording U,Teglbjaerg CS, Visfeldt J et al.Human papillomavirus 16 and 18 in adenocarcinoma of uterine cervix.Gynecol Oncol,1992;46(3)∶313
2 Di Lonardo A,Venuti A,Marcomte ML.Human papillomavirus in breast cancer.Breast Cancer Res Treat, 1992;21(2)∶95
3 Gordon AN,Bornstein J,Kaufman PH et al.HPV associated with adenovarcinoma and aderosquamouos carcinoma of the cavix:Analysis by in situ hybridization.Gynecol Oncol,1989;35(3)∶345
, http://www.100md.com
4 Cooper K,Herrington CS, Lo ES et al.Integration of human papillomavirus type 16 and 18 in cervical adenocarcinoma.J Clin Pathol,1992;45(5)∶382
5 Griffin NR,Dockey D,Lewis FA et al.Demonstration of low frequency of HPV DNA in cervical adenocarcinoma and adenocarcinoma in situ by the polymerase chain reaction and in situ hybridization.Int J Gynecol Pathol,1991;10(1)∶36
6 Zur Hausen H.Human genital cancer :synergism between two virus infections or synergism between a virus infection and initiating events.Lancet ,1982;2(8312)∶1370
7 Shibata DK,Arnheim N,Martin WJ.Detection of HPV in paraffin-embedded tissue using the PCR.J Exp Med, 1988;167(1)∶225
(1999-04-25收稿 1999-06-07修回), http://www.100md.com
单位：梁志刚 付伟(深圳市红十字会医院 深圳 510029)；楚雍烈 西安医科大学微生物学教研室；付强 中国人民解放军第323医院口腔科
关键词：涎腺肿瘤；人乳头瘤病毒；聚合酶链反应
西安医科大学学报/990329 摘要 为探讨腺上皮起源的涎腺良、恶性肿瘤与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)感染的关系，应用聚合酶链反应技术(PCR)，采用共有引物检测44例涎腺肿瘤组织中的HPV DNA的存在状况。10例正常涎腺组织作为对照。结果显示：肿瘤组织中HPV DNA阳性检出率达70.45%(31/44)，其中恶性肿瘤 HPV DNA阳性率为77.27%(31/44)；良性肿瘤HPV DNA阳性率为63.63%(14/22)；而正常对照组织中HPV DNA阳性率仅为10%(1/10)。提示：涎腺肿瘤的发生可能与HPV感染有关。
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DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN
SALIVARY GLAND TUMORS
Liang Zhigang ,Fu Wei ,Chu Yonglie et al
(Red Cross Hospital of Shenzhen)
Abstract To discover the relationship between human papillomavirus (HPV) and salivary gland tumor, the polymerase chain reaction (PCR) was used to detect HPV DNA in 44 cases of formalin-fixed, paraffin-embedded salivary gland tumor tissues and 10 cases of normal salivary gland tissues.The results showed that the total positive rate of HPV DNA was 70.45% (31/44);For benign tumor HPV DNA positive rate was 63.63%(14/22) and for malignant tumor was 77.27%(17/22).In contrast, HPV DNA positive rate was total to be 10%(1/10) in normal gland tissues (70.45% vs 10%，P<0.01).The results suggests that HPV plays a role in carcinogenesis of salivary gland tumor.
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Key words salivary gland tumor;human papillomavirus;polymerase chain reaction
涎腺肿瘤是颌面部所特有的第二大类肿瘤，对于涎腺肿瘤病毒病因学的研究目前正处于探索阶段，特别是涎腺肿瘤与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)这种与多种肿瘤相关的肿瘤病毒的关系，尚未见有专题报道。许多研究表明，来源于腺上皮的肿瘤发生与HPV相关[1，2]。而涎腺肿瘤95%来自腺上皮。为探讨涎腺肿瘤与人乳头瘤病毒感染的关系，本实验运用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术，对44例甲醛固定、石蜡包埋的涎腺肿瘤组织块和10例正常涎腺组织中的HPV DNA进行检测，以探索HPV在涎腺肿瘤中的致癌作用。
材料与方法
1 标本来源 44份人涎腺肿瘤标本均取自西安医科大学口腔医学院病理科，经10%甲醛固定，乙醇脱水后石蜡包埋，采集年限自1987年至1995年，经病理诊断证实良、恶性肿瘤各22例。年龄19～63岁，平均年龄38.6岁。男女比例1∶1。良性肿瘤中多形性腺瘤发生于腮腺者5例、颌下腺者6例，舌下腺者2例。腺淋巴瘤6例，基底细胞腺瘤1例，乳头状囊腺癌2例，患者平均年龄36.8岁。恶性肿瘤中恶性多形性腺瘤2例，粘液表皮样癌4例，腺泡细胞癌3例，乳头状囊腺癌2例，腺癌4例，基底细胞腺癌2例。未分化癌3例，腺样囊性癌2例。所有患者术前均未经放疗、化疗等抗癌治疗。切片厚度为7 μm，连续切片3张。10例正常人涎腺组织标本取自西安医科大学第一临床医学院，为外伤患者修剪的涎腺组织，镜下未见有癌细胞，-70℃中冻存备用。
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2 研究方法
2.1 主要药品试剂 蛋白酶K、DNA标准分子量参照物、HPV DNA共有引物试剂盒(华美生物工程公司)，十二烷基磺酸钠(SDS，德国Serva公司)。
2.2 正常组织DNA的提供 采用酚-氯仿、异戊醇提取法。
2.3 石蜡包埋涎腺肿瘤组织DNA的提取 取7 μm厚石蜡切片3张，加入二甲苯浸没，室温放置，每4 h换液一次，浸泡时间为12 h，每次换液前5000 r/min离心2 min。按常规进行梯度水化后用SSC漂洗一次40 min,5000 r/min离心2 min，弃上清备用，DNA提取方法同正常组织。 2.4 PCR扩增 反应总体积为30μl，反应参数为：94℃预变性5min，94℃，60s，55℃ 60s,72℃ 90s。循环35次后72℃延伸5min。取8μl扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。为确保PCR反应的准确性。每组试验均设阳性对照(HPV16阳性质粒)和阴性对照(pUC18质粒)。
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结果
44例涎腺肿瘤组织中，肿瘤组织阳性率为70.45%(31/44)，10例正常涎腺组织HPV检测阳性率为10%(1/10)；χ2检验：P<0.005，两组间有显著性差异。DNA经PCR扩增部分结果如图所示，阳性样品在270bp处出现了与预期大小相似的条带。
附图 PCR扩增结果
M：标准分子量参照(PCR Marker，华美公司)
1：阳性对照 2：阴性对照
3，4：阳性样品(扩增片段为270bp)
44例涎腺肿瘤患者中，良性22例，HPV阳性14例，阳性率为63.63%；恶性22例，HPV阳性17例，阳性率为77.27%，χ2检验，两组间无显著性差异。
, 百拇医药
涎腺良、恶性肿瘤患者HPV阳性病例性别分布比较：31例HPV阳性病例中，男性16例，女性15例，χ2检验：0.75
讨论
以往人们认为HPV是一种嗜鳞状上皮的DNA肿瘤病毒，与鳞癌，特别是宫颈鳞癌密切相关。近年来的研究也侧重于HPV感染对鳞状上皮肿瘤的致病性。随着HPV DNA流行病学调查的深入，许多研究表明HPV感染同样存在于腺上皮肿瘤中，但检出率差异很大[3～5]，这可能与肿瘤的部位，研究的方法，样本的大小及地域的不同等因素有关，为探讨HPV与涎腺肿瘤的关系，本试验运用HPV共有引物PCR法，对44例涎腺肿瘤进行了HPV DNA的检测，总阳性率为70.45%，而正常涎腺组织中HPV DNA的阳性检出率仅为10%，提示HPV在涎腺肿瘤发生中起一定的作用。
44例涎腺肿瘤组织诊断证实良、恶性肿瘤各22例，PCR检测发现良性肿瘤组织中HPV阳性率为63.63%，恶性肿瘤中HPV阳性率为77.27%，虽然HPV阳性检出率并无大的差异，但其肿瘤的良、恶性不同，结合以往的大量研究。我们认为可能与不同组织中感染的HPV种类不同有关。因为根据不同组织病变中检出HPV型别的不同及其致癌潜能的不同，HPV被分为两大类，即高危型HPV和低危型HPV，已有的研究表明高危型HPV主要通过其病毒DNA整合到宿主细胞染色体上，引起相应组织细胞基因调控失调，导致细胞向恶性表型转化并发生癌变，而低危型HPV进入宿主体内后游离于宿主细胞染色体外，可激发细胞的分裂增殖，导致许多良性增生性疾病。但是由于本试验仅采用了共有引物进行检测，所以不能确定涎腺肿瘤组织中HPV的种类，这方面有待更深入的研究。
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1982年Zur Hausen提出HPV致癌模型，认为HPV作为起动因子，疱疹病毒或吸入的烟草是起始因子，二者相互协同，促进上皮癌变[6]。本组31例HPV阳性涎腺肿瘤中，男女比例相似，χ2检验无显著差异，提示烟酒等局部理化刺激与涎腺肿瘤无关，大量宫颈癌文献报告中也未发现HPV感染与烟酒嗜好相关，对于其关系应进一步追踪观察。
PCR具有高度的敏感性和特异性，即使是皮克(pg)的痕迹量DNA，扩增后经电泳及染色后仍可确证。共有引物是DNA同源性的最佳聚合，采用共有引物PCR可检测已定型和未定型的HPV，大大提高检测的敏感性。实验中在阴性对照中未见扩增条带，在阳性对照中扩增出与预计大小一致的扩增条带，也证实了PCR扩增的特异性，依据本实验的阴性对照和阳性对照进行判定，实验结果是可靠的。运用PCR检测甲醛固定、石蜡包埋涎腺肿瘤组织中HPV感染，具有取材方便，结果可靠和诊断明确等特点，有报道即使保存40年之久的已有不同程度降解蜡块中的DNA也能成功的被扩增[7]，这使回顾性研究有了大量的标本，有利于肿瘤的分子流行病学调查及肿瘤的回顾性研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Hording U,Teglbjaerg CS, Visfeldt J et al.Human papillomavirus 16 and 18 in adenocarcinoma of uterine cervix.Gynecol Oncol,1992;46(3)∶313
2 Di Lonardo A,Venuti A,Marcomte ML.Human papillomavirus in breast cancer.Breast Cancer Res Treat, 1992;21(2)∶95
3 Gordon AN,Bornstein J,Kaufman PH et al.HPV associated with adenovarcinoma and aderosquamouos carcinoma of the cavix:Analysis by in situ hybridization.Gynecol Oncol,1989;35(3)∶345
, http://www.100md.com
4 Cooper K,Herrington CS, Lo ES et al.Integration of human papillomavirus type 16 and 18 in cervical adenocarcinoma.J Clin Pathol,1992;45(5)∶382
5 Griffin NR,Dockey D,Lewis FA et al.Demonstration of low frequency of HPV DNA in cervical adenocarcinoma and adenocarcinoma in situ by the polymerase chain reaction and in situ hybridization.Int J Gynecol Pathol,1991;10(1)∶36
6 Zur Hausen H.Human genital cancer :synergism between two virus infections or synergism between a virus infection and initiating events.Lancet ,1982;2(8312)∶1370
7 Shibata DK,Arnheim N,Martin WJ.Detection of HPV in paraffin-embedded tissue using the PCR.J Exp Med, 1988;167(1)∶225
(1999-04-25收稿 1999-06-07修回), http://www.100md.com