大鼠移植性肝癌栓塞化疗及栓塞内放疗的实验研究
作者：王锦波 潘承恩 王居
单位：潘承恩 王居(第一临床医学院肝胆外科 西安 710061)；王锦波 第三军医大学西南医院肝胆外科中心(400038)
关键词：大鼠；肝肿瘤；移植性；治疗
西安医科大学学报/990326 摘要 为了探讨栓塞化疗及栓塞内放疗对大鼠移植性肝癌的治疗效果及机理，本文采用Walker-256肝癌瘤株接种于60只SD大鼠肝脏上，1周后分3组进行不同治疗，观察治疗效果并进行比较。结果发现，两种治疗方法的肿瘤体积比、肿瘤坏死率及肿瘤生长率无明显差别(P>0.05)，对肝功酶类的影响有显著差别(P<0.05)；经不同方法治疗后，癌灶中均残留存活的癌细胞。表明两种治疗方法均对移植性肝癌有明显治疗效果，单次治疗不能完全杀灭癌细胞。
EXPERIMENTAL STUDY ON THE EFFECTS OF
, 百拇医药
CHEMOEMBOLIZATION AND INTRA-RADIOTHERAPEUTIC
EMBOLIZATION IN RATS WITH
IMPLANTED HEPATIC TUMOR
Wang Jinbo,Pan Chengen,Wang Jubin
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital)
Abstract In order to study the effects and mechanism of chemoembolization and intra-radiotherapeutic embolization after hepatic tumor implentation in rats,walker-256 hepatic tumor cells were implanted into the liver of 60 SD rats which were divided into 3 groups and different therapy were performed, the effects of two kinds of therapy were observed and compared.We found that the rate of tumor size, tumor necortic rate and tumor growth rate had significant differences between the two kinds of therapy (P>0.05) and there was significant difference in effects on hepatic function (P<0.05).After different treatments, survival cancer cells were found in the tumor foci.It is suggested that both of the methods can exert obvious effects on implanted hepatic tumor, but there are survival cancer cells after single treatment.
, 百拇医药
Key words rat;hepatic tumor;implantation;therapy
原发性肝癌为临床上常见的肿瘤，其中以肝细胞癌(HCC)居多。我国发病率为西方国家的5～10倍[1]，发病人数占全世界病人数40%以上[2]。手术切除是当前首选的治疗方法，但对不能切除的肿瘤，也有众多非手术的治疗方法。本研究探讨栓塞化疗及栓塞内放疗的治疗效果及机理，旨在为临床治疗的选择提供参考。
材料与方法
1 动物 普通SD大鼠60只，体重(250±50) g，供实验用；断奶SD大鼠10只，体重60～100 g，供瘤株传代用。均由本校动物中心提供，雌雄不拘，为封闭群动物。将实验动物随机分为三组，每组20只，A组为栓塞化疗组，B组为栓塞内放疗组，C组为对照组。
2 试剂 40%碘化油(Lipiodol, LP)由上海淮海制药厂出品(批号920405)；化疗剂表阿霉素 (pharmorubicin, EADM) 由意大利爱宝药厂出品(批号 4006DA)；放疗剂131I由本院同位素室标记，标记率>98%。Walker-256肝癌瘤株由上海医工院提供。
, 百拇医药
3 肝癌模型的制作方法 将皮下或肝脏接种W-256瘤株1周的传代大鼠麻醉后，无菌条件下取出瘤组织，取肿瘤边缘生长活跃的鱼肉样组织少许，用双面刀片切成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，放入生理盐水漂洗备用，然后采用改良式隧道种植的方法[3]接种于大鼠肝脏，1周后即可开始治疗实验。
4 实验治疗方法 接种后第8天无菌条件下开腹，分离出肝动脉，远端结扎，用自制的插管(硬膜外导管加热塑型Φ0.4～0.5 mm)插入肝动脉0.5 cm。用镊子暂时夹闭胃右动脉以防异位栓塞，然后缓慢推入治疗药物。A组：Lp0.5 ml+EADM 0.2 mg;B组:Lp 0.5 ml+131I 0.06 mci;C组：N-S 0.5 ml。治疗前先测量接种之肿瘤大小并记录，用公式V=ab2/2(a:最大径，b:最小径)计算肿瘤体积[4]。治疗后第10天、20天分别分批处死，每次10只，抽血查肝功能，测量治疗后肿瘤大小，用以上公式计算肿瘤体积，保留标本并制备病理切片及电镜片。
, 百拇医药
5 观察指标 ①肿瘤体积比;②肿瘤生长率(治疗后体积/治疗前体积)；③镜下肿瘤坏死率(轻度<30%,中度30%～70%,重度>70%)；④肝功酶学检查；⑤病理切片上癌细胞存活情况；⑥电镜下观察超微结构变化。统计数据用SAS软件分析。
结果 治疗前各组肿瘤大小之间无明显差别，治疗10d及20d后，栓塞化疗组及栓塞内放疗组80%肿瘤体积减小，20%肿瘤体积无变化或有所增大，而对照组则肿瘤体积增大。治疗组之间的体积变化无明显差别(P>0.05)，两个治疗组与对照组之间有明显差别(P<0.05)。在治疗10d后，两个治疗组中均有动物死亡，而对照组则无动物死亡；在治疗20d后，3组中均有动物死亡。在治疗后第10天和20天时，治疗组中肿瘤组织均有不同程度的坏死，但肿瘤边缘有存活的瘤细胞，而对照组则很少有坏死(见表1)。
在治疗后，大鼠肝功酶类有明显变化，两个治疗组之间有显著差别，说明两种治疗方法对肝功能的影响不同(见表2)。
, http://www.100md.com
表1 治疗后肿瘤坏死范围 肿瘤坏死范围
10d后
20d后
A组
B组
C组
A组
B组
C组
<30%
4
4
0
, http://www.100md.com
3
4
1
30%～70%
3
2
0
3
2
0
>70%
1
1
0
, 百拇医药
2
2
0
P
>0.05
>0.05
表2 治疗后肝功能变化 (
±s，U/L) 观察指标
10d后
P*
20d后
P*
, 百拇医药
A组
B组
C组
A组
B组
C组
ALT
95.33±49.73
133.63±85.19
45.2±11.21
<0.05
128±54.82
193.33±89.81
, http://www.100md.com
57.89±12.91
<0.05
AST
485±125.95
463.5±121.33
220±65.86
>0.05
483±1028
490.78±110.04
232.33±75.62
>0.05
ALP
, http://www.100md.com
502.67±217.60
566.63±174.87
65.1±36.66
>0.05
469.11±161.35
608.44±146.55
45.11±12.39
<0.05
GGT
35.67±16.7
53.75±16.86
, http://www.100md.com 10.10±4.98
<0.05
35.11±12.62
36.33±14.9
31.22±14.96
>0.05
注：*A、B组比较；A、C组，B、C组比较，P均<0.05
取不同方法治疗后的标本进行电镜检查，发现癌细胞大而不规则，核浆比失调，胞核大而畸形，线粒体丰富，大小不等，嵴消失，内质网扩张，癌组织内可见浸润的吞噬细胞，吞噬细胞内可出现LP颗粒。治疗后癌组织结构模糊，细胞皱缩变形，细胞器紊乱，核固缩或碎裂。两种方法治疗后的癌细胞超微结构变化相似。
, 百拇医药
讨论
肝癌的首选治疗方法为手术切除，这也是唯一可以提供治愈可能性的手段[5]。但由于早期发现困难，能够手术切除者仅为少数。不能切除者有多种治疗方法，其中以栓塞化疗及栓塞内放疗最为常用。
栓塞化疗是将栓塞剂和化疗药物联合应用，以期同时起到双重抗癌作用。化疗药物从肝动脉局部注入，肝组织中药物浓度高于全身药物浓度100～400倍，但这样的药物浓度往往是一过性的，难以达到持久作用。由于恶性肿瘤对化疗药物的反应性取决于治疗局部药物浓度和作用时间，因此栓塞剂和化疗药物的联合应用，减少了肿瘤的血供，也使药物免受肝脏代谢酶的快速作用，增加了药物作用时间，提高了疗效，因此目前认为栓塞化疗是不能切除的肝癌的首选治疗方法[6]。
在本研究中，经栓塞化疗后的大鼠，80%的肿瘤体积缩小，肿瘤生长受到抑制(肿瘤生长率<1)，动物一般情况好转，和同期对照组相比，有明显差异(P<0.01)。栓塞化疗后有一过性竖毛、精神萎糜等表现。一只在栓塞后当天死亡，剖视为异位栓塞，双肺出现斑点，小肠淤血水肿，考虑为推注药物时压力过高，导致血流动力学紊乱而致。另一只在栓塞后第2天死亡，剖视见肝脏大部分出现淤斑，死亡原因考虑为全肝栓塞，广泛坏死。
, 百拇医药
栓塞内放疗是将栓塞剂与内放疗药物联合应用，依靠β射线对癌细胞进行杀伤。核素进入体内后，以β射线的形式将能量传递到周围组织，产生放射生物效应。机体接受了射线后，一是在同一分子水平上吸收射线的能量并出现损伤效应，二是射线辐射产生大量自由基如H+、OH-等造成细胞损伤，以此来达到杀伤癌细胞，破坏癌组织的目的。从肝动脉注入131I-LP之后，主要分布在肝(70%～90%)或肺(10%～20%)，其它组织和器官则极少分布，因此在适当的剂量下是安全的。在本组实验中，经131I-LP治疗后的大鼠，肿瘤体积比、肿瘤生长率及动物一般状况均与对照组有显著差异(P<0.01)，说明131I-LP对大鼠肝癌有较好的治疗作用。在治疗过程中死亡的大鼠，仍为异位栓塞而致，未发现因内放射引起死亡的证据。
栓塞化疗和栓塞内放疗作为两种有效的姑息疗法，均对大鼠移植性肝癌有明显治疗作用。治疗10d后，其肿瘤生长率无明显差异(P>0.05)，但两组与对照组比较，均有显著差异(P<0.01)。其肝功能明显受损，两组之间ALT、GGT之间有明显差别(P<0.05)。治疗20d后，A、B两组肿瘤体积缩小，与对照组比较有显著差异(P<0.05)，提示随着时间延长，疗效逐渐提高。其ALT、ALP的变化仍有显著意义。肝功的差异可能与药物的用量及放射性肝炎有关。
, 百拇医药
Walker-256肝癌模型当肿瘤较大时(Φ>5 mm)，多为富血供型，血管位于肿瘤表面及浅层实质内。因肿瘤生长较快，表现为膨胀性与浸润性生长共存，肿瘤组织与周围肝脏分界较清，易于观测。这种移植性肿瘤的生长方式及肿瘤生物学特征与人肝癌相似，因此，适合进行栓塞治疗的研究。
正常肝脏由肝动脉及门静脉双重供血，而肝癌组织则以肝动脉供血为主(85%)，这是进行栓塞治疗的解剖学基础。由于肿瘤存在侧支循环及门静脉血供，因此，单次的肝动脉栓塞及单纯的肝动脉栓塞治疗，均存在一定局限性。从病理切片上可以发现，单纯和单次肝动脉栓塞化疗或栓塞内放疗之后，肿瘤并没有完全坏死，癌中心及癌周仍有大量存活的癌细胞，提示“反复”和“多途径”栓塞是必要的。
参考文献
1 Tang Zhaoyou.Primary liver cancer.Beijing: China Academic Publisher,1989∶469～480
, 百拇医药
2 王宝恩.原发性肝癌研究的几个问题.中华医学杂志，1990；74(8)∶459
3 王锦波，吕毅，潘承恩等.Walker-256肝癌模型的制作及传代保存.肝胆外科杂志，1995；4(2)∶56
4 Carlson G.Estimation of liver tumor volume using different formular-an experimental study in rats.Clin Oncol,1993;105∶20～25
5 Haskell CM.Cancer treatment.3rd ed.Philadelphia,London and Toronto WB.Saunders Co.1990;276～286
6 Ellis LM.Demers ML,Roh MS.Current strategies for the treatment of hepatocellular carcinoma.Curr Opin Oncol,1992;4(4)∶741
(1999-03-21收稿 1999-06-04修回), http://www.100md.com
单位：潘承恩 王居(第一临床医学院肝胆外科 西安 710061)；王锦波 第三军医大学西南医院肝胆外科中心(400038)
关键词：大鼠；肝肿瘤；移植性；治疗
西安医科大学学报/990326 摘要 为了探讨栓塞化疗及栓塞内放疗对大鼠移植性肝癌的治疗效果及机理，本文采用Walker-256肝癌瘤株接种于60只SD大鼠肝脏上，1周后分3组进行不同治疗，观察治疗效果并进行比较。结果发现，两种治疗方法的肿瘤体积比、肿瘤坏死率及肿瘤生长率无明显差别(P>0.05)，对肝功酶类的影响有显著差别(P<0.05)；经不同方法治疗后，癌灶中均残留存活的癌细胞。表明两种治疗方法均对移植性肝癌有明显治疗效果，单次治疗不能完全杀灭癌细胞。
EXPERIMENTAL STUDY ON THE EFFECTS OF
, 百拇医药
CHEMOEMBOLIZATION AND INTRA-RADIOTHERAPEUTIC
EMBOLIZATION IN RATS WITH
IMPLANTED HEPATIC TUMOR
Wang Jinbo,Pan Chengen,Wang Jubin
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital)
Abstract In order to study the effects and mechanism of chemoembolization and intra-radiotherapeutic embolization after hepatic tumor implentation in rats,walker-256 hepatic tumor cells were implanted into the liver of 60 SD rats which were divided into 3 groups and different therapy were performed, the effects of two kinds of therapy were observed and compared.We found that the rate of tumor size, tumor necortic rate and tumor growth rate had significant differences between the two kinds of therapy (P>0.05) and there was significant difference in effects on hepatic function (P<0.05).After different treatments, survival cancer cells were found in the tumor foci.It is suggested that both of the methods can exert obvious effects on implanted hepatic tumor, but there are survival cancer cells after single treatment.
, 百拇医药
Key words rat;hepatic tumor;implantation;therapy
原发性肝癌为临床上常见的肿瘤，其中以肝细胞癌(HCC)居多。我国发病率为西方国家的5～10倍[1]，发病人数占全世界病人数40%以上[2]。手术切除是当前首选的治疗方法，但对不能切除的肿瘤，也有众多非手术的治疗方法。本研究探讨栓塞化疗及栓塞内放疗的治疗效果及机理，旨在为临床治疗的选择提供参考。
材料与方法
1 动物 普通SD大鼠60只，体重(250±50) g，供实验用；断奶SD大鼠10只，体重60～100 g，供瘤株传代用。均由本校动物中心提供，雌雄不拘，为封闭群动物。将实验动物随机分为三组，每组20只，A组为栓塞化疗组，B组为栓塞内放疗组，C组为对照组。
2 试剂 40%碘化油(Lipiodol, LP)由上海淮海制药厂出品(批号920405)；化疗剂表阿霉素 (pharmorubicin, EADM) 由意大利爱宝药厂出品(批号 4006DA)；放疗剂131I由本院同位素室标记，标记率>98%。Walker-256肝癌瘤株由上海医工院提供。
, 百拇医药
3 肝癌模型的制作方法 将皮下或肝脏接种W-256瘤株1周的传代大鼠麻醉后，无菌条件下取出瘤组织，取肿瘤边缘生长活跃的鱼肉样组织少许，用双面刀片切成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，放入生理盐水漂洗备用，然后采用改良式隧道种植的方法[3]接种于大鼠肝脏，1周后即可开始治疗实验。
4 实验治疗方法 接种后第8天无菌条件下开腹，分离出肝动脉，远端结扎，用自制的插管(硬膜外导管加热塑型Φ0.4～0.5 mm)插入肝动脉0.5 cm。用镊子暂时夹闭胃右动脉以防异位栓塞，然后缓慢推入治疗药物。A组：Lp0.5 ml+EADM 0.2 mg;B组:Lp 0.5 ml+131I 0.06 mci;C组：N-S 0.5 ml。治疗前先测量接种之肿瘤大小并记录，用公式V=ab2/2(a:最大径，b:最小径)计算肿瘤体积[4]。治疗后第10天、20天分别分批处死，每次10只，抽血查肝功能，测量治疗后肿瘤大小，用以上公式计算肿瘤体积，保留标本并制备病理切片及电镜片。
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5 观察指标 ①肿瘤体积比;②肿瘤生长率(治疗后体积/治疗前体积)；③镜下肿瘤坏死率(轻度<30%,中度30%～70%,重度>70%)；④肝功酶学检查；⑤病理切片上癌细胞存活情况；⑥电镜下观察超微结构变化。统计数据用SAS软件分析。
结果 治疗前各组肿瘤大小之间无明显差别，治疗10d及20d后，栓塞化疗组及栓塞内放疗组80%肿瘤体积减小，20%肿瘤体积无变化或有所增大，而对照组则肿瘤体积增大。治疗组之间的体积变化无明显差别(P>0.05)，两个治疗组与对照组之间有明显差别(P<0.05)。在治疗10d后，两个治疗组中均有动物死亡，而对照组则无动物死亡；在治疗20d后，3组中均有动物死亡。在治疗后第10天和20天时，治疗组中肿瘤组织均有不同程度的坏死，但肿瘤边缘有存活的瘤细胞，而对照组则很少有坏死(见表1)。
在治疗后，大鼠肝功酶类有明显变化，两个治疗组之间有显著差别，说明两种治疗方法对肝功能的影响不同(见表2)。
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表1 治疗后肿瘤坏死范围 肿瘤坏死范围
10d后
20d后
A组
B组
C组
A组
B组
C组
<30%
4
4
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3
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1
30%～70%
3
2
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3
2
0
>70%
1
1
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, 百拇医药
2
2
0
P
>0.05
>0.05
表2 治疗后肝功能变化 (
±s，U/L) 观察指标10d后
P*
20d后
P*
, 百拇医药
A组
B组
C组
A组
B组
C组
ALT
95.33±49.73
133.63±85.19
45.2±11.21
<0.05
128±54.82
193.33±89.81
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57.89±12.91
<0.05
AST
485±125.95
463.5±121.33
220±65.86
>0.05
483±1028
490.78±110.04
232.33±75.62
>0.05
ALP
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502.67±217.60
566.63±174.87
65.1±36.66
>0.05
469.11±161.35
608.44±146.55
45.11±12.39
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GGT
35.67±16.7
53.75±16.86
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<0.05
35.11±12.62
36.33±14.9
31.22±14.96
>0.05
注：*A、B组比较；A、C组，B、C组比较，P均<0.05
取不同方法治疗后的标本进行电镜检查，发现癌细胞大而不规则，核浆比失调，胞核大而畸形，线粒体丰富，大小不等，嵴消失，内质网扩张，癌组织内可见浸润的吞噬细胞，吞噬细胞内可出现LP颗粒。治疗后癌组织结构模糊，细胞皱缩变形，细胞器紊乱，核固缩或碎裂。两种方法治疗后的癌细胞超微结构变化相似。
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讨论
肝癌的首选治疗方法为手术切除，这也是唯一可以提供治愈可能性的手段[5]。但由于早期发现困难，能够手术切除者仅为少数。不能切除者有多种治疗方法，其中以栓塞化疗及栓塞内放疗最为常用。
栓塞化疗是将栓塞剂和化疗药物联合应用，以期同时起到双重抗癌作用。化疗药物从肝动脉局部注入，肝组织中药物浓度高于全身药物浓度100～400倍，但这样的药物浓度往往是一过性的，难以达到持久作用。由于恶性肿瘤对化疗药物的反应性取决于治疗局部药物浓度和作用时间，因此栓塞剂和化疗药物的联合应用，减少了肿瘤的血供，也使药物免受肝脏代谢酶的快速作用，增加了药物作用时间，提高了疗效，因此目前认为栓塞化疗是不能切除的肝癌的首选治疗方法[6]。
在本研究中，经栓塞化疗后的大鼠，80%的肿瘤体积缩小，肿瘤生长受到抑制(肿瘤生长率<1)，动物一般情况好转，和同期对照组相比，有明显差异(P<0.01)。栓塞化疗后有一过性竖毛、精神萎糜等表现。一只在栓塞后当天死亡，剖视为异位栓塞，双肺出现斑点，小肠淤血水肿，考虑为推注药物时压力过高，导致血流动力学紊乱而致。另一只在栓塞后第2天死亡，剖视见肝脏大部分出现淤斑，死亡原因考虑为全肝栓塞，广泛坏死。
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栓塞内放疗是将栓塞剂与内放疗药物联合应用，依靠β射线对癌细胞进行杀伤。核素进入体内后，以β射线的形式将能量传递到周围组织，产生放射生物效应。机体接受了射线后，一是在同一分子水平上吸收射线的能量并出现损伤效应，二是射线辐射产生大量自由基如H+、OH-等造成细胞损伤，以此来达到杀伤癌细胞，破坏癌组织的目的。从肝动脉注入131I-LP之后，主要分布在肝(70%～90%)或肺(10%～20%)，其它组织和器官则极少分布，因此在适当的剂量下是安全的。在本组实验中，经131I-LP治疗后的大鼠，肿瘤体积比、肿瘤生长率及动物一般状况均与对照组有显著差异(P<0.01)，说明131I-LP对大鼠肝癌有较好的治疗作用。在治疗过程中死亡的大鼠，仍为异位栓塞而致，未发现因内放射引起死亡的证据。
栓塞化疗和栓塞内放疗作为两种有效的姑息疗法，均对大鼠移植性肝癌有明显治疗作用。治疗10d后，其肿瘤生长率无明显差异(P>0.05)，但两组与对照组比较，均有显著差异(P<0.01)。其肝功能明显受损，两组之间ALT、GGT之间有明显差别(P<0.05)。治疗20d后，A、B两组肿瘤体积缩小，与对照组比较有显著差异(P<0.05)，提示随着时间延长，疗效逐渐提高。其ALT、ALP的变化仍有显著意义。肝功的差异可能与药物的用量及放射性肝炎有关。
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Walker-256肝癌模型当肿瘤较大时(Φ>5 mm)，多为富血供型，血管位于肿瘤表面及浅层实质内。因肿瘤生长较快，表现为膨胀性与浸润性生长共存，肿瘤组织与周围肝脏分界较清，易于观测。这种移植性肿瘤的生长方式及肿瘤生物学特征与人肝癌相似，因此，适合进行栓塞治疗的研究。
正常肝脏由肝动脉及门静脉双重供血，而肝癌组织则以肝动脉供血为主(85%)，这是进行栓塞治疗的解剖学基础。由于肿瘤存在侧支循环及门静脉血供，因此，单次的肝动脉栓塞及单纯的肝动脉栓塞治疗，均存在一定局限性。从病理切片上可以发现，单纯和单次肝动脉栓塞化疗或栓塞内放疗之后，肿瘤并没有完全坏死，癌中心及癌周仍有大量存活的癌细胞，提示“反复”和“多途径”栓塞是必要的。
参考文献
1 Tang Zhaoyou.Primary liver cancer.Beijing: China Academic Publisher,1989∶469～480
, 百拇医药
2 王宝恩.原发性肝癌研究的几个问题.中华医学杂志，1990；74(8)∶459
3 王锦波，吕毅，潘承恩等.Walker-256肝癌模型的制作及传代保存.肝胆外科杂志，1995；4(2)∶56
4 Carlson G.Estimation of liver tumor volume using different formular-an experimental study in rats.Clin Oncol,1993;105∶20～25
5 Haskell CM.Cancer treatment.3rd ed.Philadelphia,London and Toronto WB.Saunders Co.1990;276～286
6 Ellis LM.Demers ML,Roh MS.Current strategies for the treatment of hepatocellular carcinoma.Curr Opin Oncol,1992;4(4)∶741
(1999-03-21收稿 1999-06-04修回), http://www.100md.com