谷氨酰胺对肝硬化大鼠肠粘膜的保护作用
作者：赵平 董蕾 罗金燕
单位：赵平 董蕾 罗金燕(第二临床医学院内科学教研室 西安 710004)
关键词：谷氨酰胺；肝硬化；肠粘膜
西安医科大学学报/990311 摘要 采用四氯化碳致大鼠肝硬化模型，观察口服谷氨酰胺对肝硬化大鼠肝功、死亡率及空肠粘膜谷胱甘肽含量的影响，并对空、回肠粘膜进行了组织形态学观察。结果表明，谷氨酰胺对肝硬化大鼠肝功、死亡率无明显影响。与模型对照组相比，谷氨酰胺治疗组空肠粘膜谷胱甘肽含量及空、回肠粘膜厚度、绒毛高度显著增加(P<0.05),且上述指标与正常组比较差异无显著性。表明补充外源性谷氨酰胺可明显减轻肝硬化时肠粘膜损伤，增加空肠粘膜谷胱甘肽含量。提示谷氨酰胺可用于预防肝硬化时与肠粘膜损伤有关的各种并发症的发生。
PREVENTION EFFECT OF GLUTAMINE ON GUT MUCOSA OF
, 百拇医药
CARBON TETRACHLORIDE-INDUCED CIRRHOSIS RATS
Zhao Ping, Dong Lei ,Luo Jinyan
(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital)
Abstract To determine whether glutamine supplement could repair the disrupted gut mucosal barrier of cirrhosis, rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis were used.Then rats were killed and studied for serum TP,ALT,albudmin concentration, mortality rate, and glutathione content of gut mucosa.Morphology of jejunum and ileum mucosa was analyzed simultaneously.Results of present study showed,to compair with the cirrhosis control group,glutamine-enriched diets to rats resulted villus height of intestinc and mucosal thickness of intestine(P<0.05).Cirrhosis rats with glutamine supplement were similar to the normal rats at intestinal morphology and glutathione content in jejunum mucosa.Glutamine supplement did not influence serum TP,ALT, albumin concentration and mortality rate.It is suggested that glutamine supplentation can reverse small bowel disruption and restore glutathione content in jejunum mucosa in rats with cirrhosis.It indicated that glutamine supplentation can be used to prevent some complications of cirrhosis that related to disruption of gut mucosal barrier.
, 百拇医药
Key words glutamine;cirrhosis;gut mucosa
肝硬化时，肠粘膜屏障受损，通透性增加，肠道细菌及其内毒素大量入血，成为引发肠源性感染、肝性脑病及肝损害加重的重要原因。谷氨酰胺(Glutamine, GLN)作为肠粘膜细胞的重要能源物质，用于烧伤、外科术后、化疗及全胃肠外营养时，可增强肠粘膜屏障功能，使肠粘膜谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量及胆汁中SIgA含量上升.但GLN对肝硬化时肠粘膜损伤有无保护作用以及其可否用于肝硬化治疗，尚未见文献报道。为此我们采用CCl4致大鼠肝硬化模型，探讨GLN对大鼠肠粘膜的影响。
材料与方法
1 实验动物 雄性SD大鼠36只，体重180～200g(由西安医科大学实验动物中心提供)，随机分为3组：A正常对照组(正常组)10只；B肝硬化模型对照组(模型对照组)13只；C肝硬化GLN治疗组(GLN治疗组)13只。
, 百拇医药
2 试剂、药品和仪器 L-GLN,层析纯(上海康达氨基酸厂)，CCl4，分析纯(西安化学试剂厂)；GSH检测试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)；7170A自动生化分析仪(日本日立公司)；Quantimet 570图像分析仪(Leica公司)。
3 动物模型建立及处理 模型对照组及GLN治疗组大鼠，于实验日起皮下注射40% CCl4花生油溶液，剂量为5ml/kg体重。以后每隔3～4日皮下注射3ml/kg体重。用79.5%纯玉米粉加20%猪油和0.5%胆固醇制成的混合饲料喂养，自由饮水，共6周。随后停用CCl4，模型对照组改喂标准大鼠饲料，GLN治疗组给予含2%L-GLN的强化标准大鼠饲料喂养，共2周。正常组始终给予标准大鼠饲料，自由饮水。于实验第58日处死所有动物，取血、空肠及回肠。
4 观察指标及方法
4.1 血清谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白、白蛋白测定 采用7170A自动生化分析仪测定。
, http://www.100md.com
4.2 空肠粘膜 GSH含量测定 从距离十二指肠空肠曲以远约20cm处向近端切取4cm空肠段，再等分成两段。取其中一段在系膜侧沿长轴剪开。0℃生理盐水冲洗干净后，用手术刀片刮取肠粘膜，加入适量生理盐水制成组织匀浆；另一段用10%福尔马林固定，备组织形态学观察。上述匀浆在4℃时以3000r/min的转速离心30min，取上清液，按试剂盒说明检测匀浆中GSH含量，同时用考马斯亮蓝法测定其中蛋白含量。 4.3 空、回肠组织形态学观察 从距离回盲瓣5cm处，向近端切取2cm回肠段，用10%福尔马林固定。空、回肠固定后，常规切片，HE染色，光镜观察，并采用Quic图像分析软件测定肠粘膜厚度，绒毛高度及单位长度内绒毛数目。
5 统计学处理 数据均以均数±标准差(
±s)表示。采用方差分析进行统计学数据处理。
结果
, 百拇医药
1 各组大鼠血清ALT、总蛋白、白蛋白及空肠粘膜GSH含量测定结果 见表1。
2 各组动物死亡率 实验期间，正常组无死亡。模型对照组死亡率为23.1%(3/13)，GLN治疗组死亡率为15.4%(2/13)，后两者间差异无显著性。
3 空、回肠组织形态学观察 光镜观察：模型对照组空、回肠粘膜水肿明显，肠绒毛肿胀、断裂，粘膜局灶糜烂、坏死，粘膜及粘膜下层有大量炎性细胞浸润。GLN治疗组空、回肠粘膜病变明显减轻，肠绒毛高度及粘膜厚度明显增加，基本恢复正常。空、回肠组织图像分析见表2。
表1 各组大鼠血清ALT、TP、Alb及空肠粘膜中GSH含量测定 组别
ALT(U/L)
TP(g/L)
, 百拇医药
Alb(g/L)
空肠粘膜(μmol/g蛋白)
A
67.3±16.3
71.5±4.7
42.5±5.1
92.6±23
B
147.4±25.2*
72.7±6.2
41.2±2.0
65.3±23#
, 百拇医药
C
150.5±40.2*
68.9±8.4
40.6±1.9
115.6±40△
与A组比较*P<0.01,#P<0.05，与B组比较△P<0.05
表2 各组大鼠空、回肠组织、粘膜厚度、绒毛高度、单位长度内绒毛数比较 组别
空 肠
回肠
粘膜厚度
(μm)
, 百拇医药
绒毛高度
(μm)
1mm内绒
毛数(个)
粘膜厚度
(μm)
绒毛高度
(μm)
1mm内绒
毛数(个)
A
688±68
418±47
, http://www.100md.com
5.72±1.26
565±70
254±64
5.50±0.14
B
627±47*
351±58*
6.39±1.44
488±76*
251±66
6.22±1.18
, http://www.100md.com
C
720±61#
420±65△
6.92±0.44
580±98△
302±48*△
6.04±0.65
与A组比较*P<0.05 与B组比较#P<0.01,△P<0.05
讨论
肝硬化高氨血症时，由于内毒素的影响，肠GLN的代谢受到抑制，这时血氨升高主要是由肝细胞损伤所致[1，2]。肝硬化患者体内蛋白合成下降，分解增加，在进食生物利用度低的蛋白质时，肠壁净蛋白合成减少，而分解增加，这些可能是氨的主要来源。本研究表明，给肝硬化大鼠补充GLN并不增加肝损害及大鼠死亡率，所以GLN的应用并非肝硬化时的禁忌。
, 百拇医药
本研究发现，肝硬化时空肠粘膜GSH含量减少，而补充GLN可使肝硬化大鼠空肠粘膜GSH含量恢复正常水平。GSH是一种重要的抗氧化剂，其谷氨酸部分由细胞内GLN代谢提供。各类细胞中GSH水平降低将增加细胞对损害物质的敏感性。小肠细胞利用GSH来维持细胞的解毒系统对抗自由基及化学物质的损害作用，并维持肠的正常功能。补充外源性GLN可增强肝硬化大鼠肠粘膜 抗氧化及化学损伤能力，并维持肠正常功能。
本研究及既往研究表明，肝硬化时肠粘膜屏障明显受损，肠液及胆汁中SIgA含量下降，小肠细菌过长[3]，使细菌及内毒素移位率增加，可导致内毒素血症及自发性腹膜炎。内毒素及其刺激单核-巨噬细胞系统释放的多种细胞因子及自由基又可引起肝脏及肝外其他器官的进一步损伤[4]。因此，如何减轻肝硬化时肠粘膜屏障功能的损伤，减少肠道细菌及其内毒素移位有着极重要的意义。
补充GLN可使肝硬化大鼠空、回肠粘膜病理损伤明显减轻，修复肠粘膜屏障。GLN是小肠细胞的重要能源物质，它的缺乏可引起肠粘膜损伤及细菌移位，同时肠液及胆汁中SIgA含量减少。以往研究[5]表明补充GLN可促进小肠粘膜屏障的修复，减少细菌移位的发生和程度，还可增加肠液及胆汁中SIgA含量。由此我们推测，肝硬化时补充外源性GLN可改善小肠粘膜细胞的营养状况，修复损伤的肠粘膜，减少肠道细菌及其内毒素移位，从而预防肝硬化时与肠粘膜损伤有关的病理损害和并发症的发生。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Gebhardt R,Reichen J.Changes in distribution and activity of glutamine synthetase in carbon tetrachloride-induced cirrhosis in the rat:potential role in hyperammonemia.Hepatology,1994;20(3)∶684
2 Teran JC，Mullen KD，mcCllougn AJ.Glutamine-a conditionally essential amino acid in cirrhosis?Am J Clin Nutr.1995;62(5)∶897
3 Chesta J,Defilippi C,Defilippi C.Abnormalities in proximal small bowel motility in patients with cirrhosis.Hepatology.1993;17(5)∶828
4 NoLan JP.Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-An idea whose time has come again. Hepatology,1989;10(5)∶887
5 Grant JP.Nutrtional support in critically ill patients .Ann Surg,1994;220(5)∶610
(1998-12-23收稿 1999-03-12修回), 百拇医药
单位：赵平 董蕾 罗金燕(第二临床医学院内科学教研室 西安 710004)
关键词：谷氨酰胺；肝硬化；肠粘膜
西安医科大学学报/990311 摘要 采用四氯化碳致大鼠肝硬化模型，观察口服谷氨酰胺对肝硬化大鼠肝功、死亡率及空肠粘膜谷胱甘肽含量的影响，并对空、回肠粘膜进行了组织形态学观察。结果表明，谷氨酰胺对肝硬化大鼠肝功、死亡率无明显影响。与模型对照组相比，谷氨酰胺治疗组空肠粘膜谷胱甘肽含量及空、回肠粘膜厚度、绒毛高度显著增加(P<0.05),且上述指标与正常组比较差异无显著性。表明补充外源性谷氨酰胺可明显减轻肝硬化时肠粘膜损伤，增加空肠粘膜谷胱甘肽含量。提示谷氨酰胺可用于预防肝硬化时与肠粘膜损伤有关的各种并发症的发生。
PREVENTION EFFECT OF GLUTAMINE ON GUT MUCOSA OF
, 百拇医药
CARBON TETRACHLORIDE-INDUCED CIRRHOSIS RATS
Zhao Ping, Dong Lei ,Luo Jinyan
(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital)
Abstract To determine whether glutamine supplement could repair the disrupted gut mucosal barrier of cirrhosis, rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis were used.Then rats were killed and studied for serum TP,ALT,albudmin concentration, mortality rate, and glutathione content of gut mucosa.Morphology of jejunum and ileum mucosa was analyzed simultaneously.Results of present study showed,to compair with the cirrhosis control group,glutamine-enriched diets to rats resulted villus height of intestinc and mucosal thickness of intestine(P<0.05).Cirrhosis rats with glutamine supplement were similar to the normal rats at intestinal morphology and glutathione content in jejunum mucosa.Glutamine supplement did not influence serum TP,ALT, albumin concentration and mortality rate.It is suggested that glutamine supplentation can reverse small bowel disruption and restore glutathione content in jejunum mucosa in rats with cirrhosis.It indicated that glutamine supplentation can be used to prevent some complications of cirrhosis that related to disruption of gut mucosal barrier.
, 百拇医药
Key words glutamine;cirrhosis;gut mucosa
肝硬化时，肠粘膜屏障受损，通透性增加，肠道细菌及其内毒素大量入血，成为引发肠源性感染、肝性脑病及肝损害加重的重要原因。谷氨酰胺(Glutamine, GLN)作为肠粘膜细胞的重要能源物质，用于烧伤、外科术后、化疗及全胃肠外营养时，可增强肠粘膜屏障功能，使肠粘膜谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量及胆汁中SIgA含量上升.但GLN对肝硬化时肠粘膜损伤有无保护作用以及其可否用于肝硬化治疗，尚未见文献报道。为此我们采用CCl4致大鼠肝硬化模型，探讨GLN对大鼠肠粘膜的影响。
材料与方法
1 实验动物 雄性SD大鼠36只，体重180～200g(由西安医科大学实验动物中心提供)，随机分为3组：A正常对照组(正常组)10只；B肝硬化模型对照组(模型对照组)13只；C肝硬化GLN治疗组(GLN治疗组)13只。
, 百拇医药
2 试剂、药品和仪器 L-GLN,层析纯(上海康达氨基酸厂)，CCl4，分析纯(西安化学试剂厂)；GSH检测试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)；7170A自动生化分析仪(日本日立公司)；Quantimet 570图像分析仪(Leica公司)。
3 动物模型建立及处理 模型对照组及GLN治疗组大鼠，于实验日起皮下注射40% CCl4花生油溶液，剂量为5ml/kg体重。以后每隔3～4日皮下注射3ml/kg体重。用79.5%纯玉米粉加20%猪油和0.5%胆固醇制成的混合饲料喂养，自由饮水，共6周。随后停用CCl4，模型对照组改喂标准大鼠饲料，GLN治疗组给予含2%L-GLN的强化标准大鼠饲料喂养，共2周。正常组始终给予标准大鼠饲料，自由饮水。于实验第58日处死所有动物，取血、空肠及回肠。
4 观察指标及方法
4.1 血清谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白、白蛋白测定 采用7170A自动生化分析仪测定。
, http://www.100md.com
4.2 空肠粘膜 GSH含量测定 从距离十二指肠空肠曲以远约20cm处向近端切取4cm空肠段，再等分成两段。取其中一段在系膜侧沿长轴剪开。0℃生理盐水冲洗干净后，用手术刀片刮取肠粘膜，加入适量生理盐水制成组织匀浆；另一段用10%福尔马林固定，备组织形态学观察。上述匀浆在4℃时以3000r/min的转速离心30min，取上清液，按试剂盒说明检测匀浆中GSH含量，同时用考马斯亮蓝法测定其中蛋白含量。 4.3 空、回肠组织形态学观察 从距离回盲瓣5cm处，向近端切取2cm回肠段，用10%福尔马林固定。空、回肠固定后，常规切片，HE染色，光镜观察，并采用Quic图像分析软件测定肠粘膜厚度，绒毛高度及单位长度内绒毛数目。
5 统计学处理 数据均以均数±标准差(
±s)表示。采用方差分析进行统计学数据处理。结果
, 百拇医药
1 各组大鼠血清ALT、总蛋白、白蛋白及空肠粘膜GSH含量测定结果 见表1。
2 各组动物死亡率 实验期间，正常组无死亡。模型对照组死亡率为23.1%(3/13)，GLN治疗组死亡率为15.4%(2/13)，后两者间差异无显著性。
3 空、回肠组织形态学观察 光镜观察：模型对照组空、回肠粘膜水肿明显，肠绒毛肿胀、断裂，粘膜局灶糜烂、坏死，粘膜及粘膜下层有大量炎性细胞浸润。GLN治疗组空、回肠粘膜病变明显减轻，肠绒毛高度及粘膜厚度明显增加，基本恢复正常。空、回肠组织图像分析见表2。
表1 各组大鼠血清ALT、TP、Alb及空肠粘膜中GSH含量测定 组别
ALT(U/L)
TP(g/L)
, 百拇医药
Alb(g/L)
空肠粘膜(μmol/g蛋白)
A
67.3±16.3
71.5±4.7
42.5±5.1
92.6±23
B
147.4±25.2*
72.7±6.2
41.2±2.0
65.3±23#
, 百拇医药
C
150.5±40.2*
68.9±8.4
40.6±1.9
115.6±40△
与A组比较*P<0.01,#P<0.05，与B组比较△P<0.05
表2 各组大鼠空、回肠组织、粘膜厚度、绒毛高度、单位长度内绒毛数比较 组别
空 肠
回肠
粘膜厚度
(μm)
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绒毛高度
(μm)
1mm内绒
毛数(个)
粘膜厚度
(μm)
绒毛高度
(μm)
1mm内绒
毛数(个)
A
688±68
418±47
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5.72±1.26
565±70
254±64
5.50±0.14
B
627±47*
351±58*
6.39±1.44
488±76*
251±66
6.22±1.18
, http://www.100md.com
C
720±61#
420±65△
6.92±0.44
580±98△
302±48*△
6.04±0.65
与A组比较*P<0.05 与B组比较#P<0.01,△P<0.05
讨论
肝硬化高氨血症时，由于内毒素的影响，肠GLN的代谢受到抑制，这时血氨升高主要是由肝细胞损伤所致[1，2]。肝硬化患者体内蛋白合成下降，分解增加，在进食生物利用度低的蛋白质时，肠壁净蛋白合成减少，而分解增加，这些可能是氨的主要来源。本研究表明，给肝硬化大鼠补充GLN并不增加肝损害及大鼠死亡率，所以GLN的应用并非肝硬化时的禁忌。
, 百拇医药
本研究发现，肝硬化时空肠粘膜GSH含量减少，而补充GLN可使肝硬化大鼠空肠粘膜GSH含量恢复正常水平。GSH是一种重要的抗氧化剂，其谷氨酸部分由细胞内GLN代谢提供。各类细胞中GSH水平降低将增加细胞对损害物质的敏感性。小肠细胞利用GSH来维持细胞的解毒系统对抗自由基及化学物质的损害作用，并维持肠的正常功能。补充外源性GLN可增强肝硬化大鼠肠粘膜 抗氧化及化学损伤能力，并维持肠正常功能。
本研究及既往研究表明，肝硬化时肠粘膜屏障明显受损，肠液及胆汁中SIgA含量下降，小肠细菌过长[3]，使细菌及内毒素移位率增加，可导致内毒素血症及自发性腹膜炎。内毒素及其刺激单核-巨噬细胞系统释放的多种细胞因子及自由基又可引起肝脏及肝外其他器官的进一步损伤[4]。因此，如何减轻肝硬化时肠粘膜屏障功能的损伤，减少肠道细菌及其内毒素移位有着极重要的意义。
补充GLN可使肝硬化大鼠空、回肠粘膜病理损伤明显减轻，修复肠粘膜屏障。GLN是小肠细胞的重要能源物质，它的缺乏可引起肠粘膜损伤及细菌移位，同时肠液及胆汁中SIgA含量减少。以往研究[5]表明补充GLN可促进小肠粘膜屏障的修复，减少细菌移位的发生和程度，还可增加肠液及胆汁中SIgA含量。由此我们推测，肝硬化时补充外源性GLN可改善小肠粘膜细胞的营养状况，修复损伤的肠粘膜，减少肠道细菌及其内毒素移位，从而预防肝硬化时与肠粘膜损伤有关的病理损害和并发症的发生。
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参考文献
1 Gebhardt R,Reichen J.Changes in distribution and activity of glutamine synthetase in carbon tetrachloride-induced cirrhosis in the rat:potential role in hyperammonemia.Hepatology,1994;20(3)∶684
2 Teran JC，Mullen KD，mcCllougn AJ.Glutamine-a conditionally essential amino acid in cirrhosis?Am J Clin Nutr.1995;62(5)∶897
3 Chesta J,Defilippi C,Defilippi C.Abnormalities in proximal small bowel motility in patients with cirrhosis.Hepatology.1993;17(5)∶828
4 NoLan JP.Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-An idea whose time has come again. Hepatology,1989;10(5)∶887
5 Grant JP.Nutrtional support in critically ill patients .Ann Surg,1994;220(5)∶610
(1998-12-23收稿 1999-03-12修回), 百拇医药