神经酰胺对小鼠皮层神经元MTT代谢率的影响
作者：马继文 张 敏 脱厚珍
单位：马继文 青岛市第三人民医院神经内科 青岛 266041；张敏 青岛医学院病理学教研室；脱厚珍 北京友谊医院神经内科
关键词：神经酰胺类；神经元；噻唑类；代谢
齐鲁医学杂志990302 摘要：①目的 探讨神经酰胺(Cer)对小鼠皮层神经元噻唑蓝(MTT)代谢率的影响。②方法 以原代培养的26只小鼠大脑皮层神经元为模型，观察Cer不同浓度(0，50，100，200，500，1 000，2 000， 5 000μmol/L)，不同的作用时间(4，8，12，16，24，36h)对其MTT代谢率的影响。③结果 MTT代谢率随着Cer浓度的增加及作用时间的延长明显下降(t=2.08～2.14,P<0.05)。④结论 Cer可损伤神经元线粒体功能，从而导致神经元死亡。
中国图书馆分类法分类号：R338.1
, http://www.100md.com
THE EFFECT OF CERAMIDE ON MTT METABOLISM RATE OF MOUSE CORTICAL NEURON
Ma Jiwen, Zhang Min, Tuo Houzhen Department of Neurology, Qingdao No.3 People's Hospital, Qingdao 266041
ABSTRACT Objective To explore the effect of ceramide on MTT metabolism rate of mouse cortical neuron. MethodsThe effect of eramide at different concentrations (0,50,100,200,500,1 000,2 000,5 000μmol/L) and different acting times (4,8,12,16,24,36h) on the metabolism rate of MTT in the primary cell culture of 26 mice cortical neuron were studied. Results With the increase of ceramide concentration and acting time, the metabolism rate of MTT decreased (t=2.08-2.14,P<0.05).Conclusion Ceramide can damage the function of neuron mitochondrion and then lead to the death of neurons.
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KEY WORDS ceramides; neurons; thiazoles; metabolism
神经酰胺(Cer)是一种新发现的鞘脂类第二信使，它可中介多种因子在细胞内的作用，如促进细胞分化、诱导细胞凋亡、终止细胞周期等。我们以原代培养的小鼠大脑皮层神经元为模型，观察Cer不同浓度、不同作用时间对其噻唑蓝(MTT)代谢率的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
Cer,Poly-L-Lysine,MTT均购自Sigma公司，MEM培养基购自Gibo公司。
1.2 神经元细胞原代培养
取孕15～18d的昆明小鼠26只(中国医学科学院动物研究所提供)，以拉颈法处死，在无菌条件下取出胚胎，剪取两侧大脑半球部分皮层，剥去脑膜，剪碎，消化，制成单细胞悬液(1×109/L)，接种在预先用1g/L的Poly-L-Lysine处理过的24孔培养板内，每孔0.5mL，置入含体积分数为0.10小牛血清的MEM培养基内，在37℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养。3d后换液并加10μmol/L Uridine, 10μmol/L 5-FOU,24h后去除上述液体，培养5d，细胞突起已生长完全，连成网状，细胞生命力旺盛，存活率为94%.
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1.3 Cer的配制
Cer溶解在98∶2(V∶V)的无水乙醇十二烷中，使其浓度不低于1 000μmol/L，保存于-20℃的冰箱中待用〔1〕。将Cer溶液以不同浓度溶解于Earle液中，取培养5d的小鼠皮层神经元，将原培养基换成含Cer的Earle液，放在37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中培养〔2，3〕。
1.4 MTT代谢率的测定
10g/L MTT贮存液，避光，4℃保存。加浓度分别为10，50，100，200，500，1 000，2 000，5 000μmol/L的Cer，其培养时间分别为4，8，12，16，24，36h的神经细胞，吸出含Cer的Earle液以Earle液清洗1次，每孔加0.45mL Earle溶液及50μL MTT溶液，在37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中避光放置4h，使MTT充分代谢为甲僭 月后取出，弃上清液，每孔加无水二甲基亚砜(DMSO)1mL，使甲僭 月充分溶解，10min后于7230型分光光度计上测其波长510nm处吸光度。以无水DMSO作为对照，样本吸光度与对照吸光度的比值即为代谢率。
, 百拇医药
1.5 统计学处理方法
将浓度先换算成对数，再进行t检验。
2 结果
在无血清条件下，Earle液培养24h，神经元存活率为95.5%.在培养基中加入MTT时，培养细胞摄取并通过线粒体将其代谢为甲僭 月，甲僭 月可溶于无水DMSO，呈紫色，其颜色深浅表示甲僭 月生成的多少，线粒体活力旺盛时，甲僭 月生成的多。一般情况下，甲僭 月的DMSO溶液在570nm处吸光度最高〔4，5〕，而本组在510nm处吸光度最高。结果表明，MTT代谢率随Cer浓度增加而下降，500μmol/L(图中所示其对数值为2.70处)Cer作用24h后MTT代谢率显著下降(t=2.14,P<0.05)。见图1.MTT代谢率随着Cer作用时间的延长而下降，1 000μmol/L的Cer作用12h后MTT代谢率显著下降(t=2.08,P<0.05)。见图2.
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图1 Cer不同浓度对MTT代谢率的影响
图2 Cer不同作用时间对MTT代谢率的影响
3 讨论
Cer可中介多种细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素-1(IL-1)等在细胞内的作用。上述因子与细胞膜上相应受体结合所产生的配基-受体复合物能激活膜上的鞘磷脂酶，水解鞘磷脂，可产生内源性Cer.Cer又可激活它的靶物质，如蛋白激酶(CAPK)、蛋白磷酸酶(CAPD)等，进一步影响细胞的生理活动，如促进细胞分化、诱导细胞凋亡、终止细胞周期等。MTT代谢率是用来检测细胞存活率，或者说是评价细胞线粒体功能的一项有效指标，它不受细胞生长周期的影响，即使在静止期的细胞仍可摄取MTT并进行代谢。因此，MTT代谢率的检测尤其适用于原代培养的神经元。
, 百拇医药
本实验中，我们以原代培养的小鼠大脑皮层神经元为模型，观察Cer不同浓度、不同作用时间对MTT代谢率的影响。结果显示，随着Cer浓度的增加及作用时间的延长，MTT代谢率呈明显下降趋势，说明Cer可损伤神经元线粒体功能，进而导致神经元死亡。正常情况下，Cer存在于脑内，当发生某些异常情况时，Cer可中介某些损伤因子的作用，对神经元进行杀伤。因此，我们推测，Cer可能在多种脑部疾病如Alzheimer，帕金森病的发生中起一定的作用。
参考文献
1 Jil, Zhang G, Vematsus, et al. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death by natural ceramide FEBS. Letters,1995,356:211
2 吴希茹，马 兴，张守一，等.胚鼠大脑皮层神经元细胞的体外原代分离单位培养方法.北京医学院学报，1983，15：3
, 百拇医药
3 Huettner JE, Baughnen RW. Primary culture of identified neurons from the visiual cortex of postnatal rats. J Neurosci,1986,30:44
4 Eemondson JM, Armstrong LS, Marline ZA. A rapid and simple MTT spectrophotometric assay for determining drug sensitivity in monolayer culture. J Tissue Culture Methods, 1988,11(1):15
5 Fairdoth GT, Stewart D, Clement JJ. A simple screening procedure for quantitative measurement of cytotoxicity to resting primary lymphocyte culture. J Tissue Culture Methods, 1988,11(4):201
收稿1999-04-15
修回1999-07-29, 百拇医药
单位：马继文 青岛市第三人民医院神经内科 青岛 266041；张敏 青岛医学院病理学教研室；脱厚珍 北京友谊医院神经内科
关键词：神经酰胺类；神经元；噻唑类；代谢
齐鲁医学杂志990302 摘要：①目的 探讨神经酰胺(Cer)对小鼠皮层神经元噻唑蓝(MTT)代谢率的影响。②方法 以原代培养的26只小鼠大脑皮层神经元为模型，观察Cer不同浓度(0，50，100，200，500，1 000，2 000， 5 000μmol/L)，不同的作用时间(4，8，12，16，24，36h)对其MTT代谢率的影响。③结果 MTT代谢率随着Cer浓度的增加及作用时间的延长明显下降(t=2.08～2.14,P<0.05)。④结论 Cer可损伤神经元线粒体功能，从而导致神经元死亡。
中国图书馆分类法分类号：R338.1
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THE EFFECT OF CERAMIDE ON MTT METABOLISM RATE OF MOUSE CORTICAL NEURON
Ma Jiwen, Zhang Min, Tuo Houzhen Department of Neurology, Qingdao No.3 People's Hospital, Qingdao 266041
ABSTRACT Objective To explore the effect of ceramide on MTT metabolism rate of mouse cortical neuron. MethodsThe effect of eramide at different concentrations (0,50,100,200,500,1 000,2 000,5 000μmol/L) and different acting times (4,8,12,16,24,36h) on the metabolism rate of MTT in the primary cell culture of 26 mice cortical neuron were studied. Results With the increase of ceramide concentration and acting time, the metabolism rate of MTT decreased (t=2.08-2.14,P<0.05).Conclusion Ceramide can damage the function of neuron mitochondrion and then lead to the death of neurons.
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KEY WORDS ceramides; neurons; thiazoles; metabolism
神经酰胺(Cer)是一种新发现的鞘脂类第二信使，它可中介多种因子在细胞内的作用，如促进细胞分化、诱导细胞凋亡、终止细胞周期等。我们以原代培养的小鼠大脑皮层神经元为模型，观察Cer不同浓度、不同作用时间对其噻唑蓝(MTT)代谢率的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
Cer,Poly-L-Lysine,MTT均购自Sigma公司，MEM培养基购自Gibo公司。
1.2 神经元细胞原代培养
取孕15～18d的昆明小鼠26只(中国医学科学院动物研究所提供)，以拉颈法处死，在无菌条件下取出胚胎，剪取两侧大脑半球部分皮层，剥去脑膜，剪碎，消化，制成单细胞悬液(1×109/L)，接种在预先用1g/L的Poly-L-Lysine处理过的24孔培养板内，每孔0.5mL，置入含体积分数为0.10小牛血清的MEM培养基内，在37℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养。3d后换液并加10μmol/L Uridine, 10μmol/L 5-FOU,24h后去除上述液体，培养5d，细胞突起已生长完全，连成网状，细胞生命力旺盛，存活率为94%.
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1.3 Cer的配制
Cer溶解在98∶2(V∶V)的无水乙醇十二烷中，使其浓度不低于1 000μmol/L，保存于-20℃的冰箱中待用〔1〕。将Cer溶液以不同浓度溶解于Earle液中，取培养5d的小鼠皮层神经元，将原培养基换成含Cer的Earle液，放在37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中培养〔2，3〕。
1.4 MTT代谢率的测定
10g/L MTT贮存液，避光，4℃保存。加浓度分别为10，50，100，200，500，1 000，2 000，5 000μmol/L的Cer，其培养时间分别为4，8，12，16，24，36h的神经细胞，吸出含Cer的Earle液以Earle液清洗1次，每孔加0.45mL Earle溶液及50μL MTT溶液，在37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中避光放置4h，使MTT充分代谢为甲僭 月后取出，弃上清液，每孔加无水二甲基亚砜(DMSO)1mL，使甲僭 月充分溶解，10min后于7230型分光光度计上测其波长510nm处吸光度。以无水DMSO作为对照，样本吸光度与对照吸光度的比值即为代谢率。
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1.5 统计学处理方法
将浓度先换算成对数，再进行t检验。
2 结果
在无血清条件下，Earle液培养24h，神经元存活率为95.5%.在培养基中加入MTT时，培养细胞摄取并通过线粒体将其代谢为甲僭 月，甲僭 月可溶于无水DMSO，呈紫色，其颜色深浅表示甲僭 月生成的多少，线粒体活力旺盛时，甲僭 月生成的多。一般情况下，甲僭 月的DMSO溶液在570nm处吸光度最高〔4，5〕，而本组在510nm处吸光度最高。结果表明，MTT代谢率随Cer浓度增加而下降，500μmol/L(图中所示其对数值为2.70处)Cer作用24h后MTT代谢率显著下降(t=2.14,P<0.05)。见图1.MTT代谢率随着Cer作用时间的延长而下降，1 000μmol/L的Cer作用12h后MTT代谢率显著下降(t=2.08,P<0.05)。见图2.
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图1 Cer不同浓度对MTT代谢率的影响
图2 Cer不同作用时间对MTT代谢率的影响
3 讨论
Cer可中介多种细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素-1(IL-1)等在细胞内的作用。上述因子与细胞膜上相应受体结合所产生的配基-受体复合物能激活膜上的鞘磷脂酶，水解鞘磷脂，可产生内源性Cer.Cer又可激活它的靶物质，如蛋白激酶(CAPK)、蛋白磷酸酶(CAPD)等，进一步影响细胞的生理活动，如促进细胞分化、诱导细胞凋亡、终止细胞周期等。MTT代谢率是用来检测细胞存活率，或者说是评价细胞线粒体功能的一项有效指标，它不受细胞生长周期的影响，即使在静止期的细胞仍可摄取MTT并进行代谢。因此，MTT代谢率的检测尤其适用于原代培养的神经元。
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本实验中，我们以原代培养的小鼠大脑皮层神经元为模型，观察Cer不同浓度、不同作用时间对MTT代谢率的影响。结果显示，随着Cer浓度的增加及作用时间的延长，MTT代谢率呈明显下降趋势，说明Cer可损伤神经元线粒体功能，进而导致神经元死亡。正常情况下，Cer存在于脑内，当发生某些异常情况时，Cer可中介某些损伤因子的作用，对神经元进行杀伤。因此，我们推测，Cer可能在多种脑部疾病如Alzheimer，帕金森病的发生中起一定的作用。
参考文献
1 Jil, Zhang G, Vematsus, et al. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death by natural ceramide FEBS. Letters,1995,356:211
2 吴希茹，马 兴，张守一，等.胚鼠大脑皮层神经元细胞的体外原代分离单位培养方法.北京医学院学报，1983，15：3
, 百拇医药
3 Huettner JE, Baughnen RW. Primary culture of identified neurons from the visiual cortex of postnatal rats. J Neurosci,1986,30:44
4 Eemondson JM, Armstrong LS, Marline ZA. A rapid and simple MTT spectrophotometric assay for determining drug sensitivity in monolayer culture. J Tissue Culture Methods, 1988,11(1):15
5 Fairdoth GT, Stewart D, Clement JJ. A simple screening procedure for quantitative measurement of cytotoxicity to resting primary lymphocyte culture. J Tissue Culture Methods, 1988,11(4):201
收稿1999-04-15
修回1999-07-29, 百拇医药