卵巢癌抗独特型单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达
作者：刘玉英 钱和年 黄华梁 冯捷 崔恒
单位：100034 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心(刘玉英、钱和年、冯捷、崔恒)；中国科学院遗传学研究所(黄华梁)
关键词：卵巢肿瘤；抗体，抗独特型；基因表达
中华医学杂志990326 【摘要】 目的 制备在大肠杆菌中高效表达6B11卵巢癌抗独特型单链抗体。方法 采用聚合酶链反应(PCR)克隆技术，将6B11scFv基因克隆到原核高效表达载体pKPL-3a上，重组子转化大肠杆菌pop2136，温度诱导表达；复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换层析纯化，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶鉴定蛋白纯度；直接法和竞争抑制法ELISA检测其活性。结果 6B11scFv以包涵体形式表达获高效表达；包涵体经溶解复性纯化，纯度达95%以上；表达蛋白能与卵巢癌单抗COC166-9特异结合并能有效抑制卵巢癌抗原OC166-9与卵巢癌单抗COC166-9的特异结合。结论 6B11scFv基因可在原核细胞中高效表达，表达产物经复性纯化后具有较好的免疫活性。
, http://www.100md.com
High-level expression of 6B11 ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody scFv genes in E.Coli LIU Yuying *, QIAN Henian, HUANG Hualiang, et al. * Gynecologic Oncology Center, People′s Hospital Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To express high-level 6B11 ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody single chain Fv (scFv) genes in E. Coli. Methods Using PCR cloning technique, We cloned 6B11scFv genes into bacterial expression vector pKPL-3a. Recombinant plasmid vector pL-6B11scFv was transformed into E. Coli pop2136 with temperature control to produce proteins. Renaturated proteins were purified on DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange column with salt gradient elution. Immunoactivity was determined with ELISA and inhibition ELISA tests respectively. Results 6B11scFv genes were expressed as inclusion bodies in the cytoplasm. The purity of 6B11scFv turned out by SDS-PAGE was more than 95%. The expressed proteins after purification specifically reacted with anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody COC166-9 and efficiently inhibited the reaction between primary ovarian carcinoma antigen OC166-9 and COC166-9. Conclusion We successfully expressed high-level 6B11scFv genes in E. Coli. Expressed proteins showed pretty good immunoactivity.
, 百拇医药
【Key words】 Ovarian neoplasms Antibody, anti-idiotypic Gene expression
(Natl Med J, China 1999,79:221-223)
卵巢癌抗独特型抗体6B11能模拟卵巢癌抗原诱导动物体内产生特异性抗肿瘤免疫应答[1]。为降低其鼠源性，本中心已成功制备了基因工程抗独特型单链抗体(6B11scFv)[2]。但其表达量较低，限制了进一步研究和临床应用。本研究旨在采用聚合酶链反应(PCR)克隆技术，选择高效表达载体，高效表达有免疫活性的6B11scFv，为卵巢癌免疫防治提供基础。
材料与方法
1.质粒和菌株：pCANTAB5E-6B11scFv为本中心构建。原核高效表达载体pKPL-3a(3.6 kb含PL启动子，一个天然SD序列，一个人工SD序列，Nco Ⅰ，Xba Ⅰ等酶切位点及终止子)以及大肠杆菌pop2136(含CI857基因，编码温度敏感性λ阻遏蛋白)均为北京医科大学免疫学系马大龙教授惠赠。
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2.抗原和抗体：卵巢癌组织抗原OC166-9及卵巢癌单克隆抗体COC166-9为本中心制备。
3.6B11scFv基因的PCR扩增：根据6B11scFv全序列[2]，设计5′和3′一对引物，为便于重组，在5′引物5′端加上NcoⅠ酶切位点，因其内含ATG起始密码，为保证读码框架一致，在酶切位点后加上2个碱基G和T，使ATG后第一个氨基酸为甘氨酸；在3′引物的5′端加上XbaⅠ酶切位点及终止密码TAA。5′引物：5′-CTCCATGGGTCAGGTCAAACTGCAGGAGTC -3′，3′引物：5′-GCTCTAGATTACCGTTTTATTTC CAACTTTGTCC-3′。引物由美国Cybersyn公司合成。以pCANTAB5E-6B11scFv为模板，首次变性95℃5分钟后，进入PCR循环：60℃90秒，72℃120秒，95℃50秒，共30个周期，最后72℃延伸7分钟。
4.高效表达质粒pL-6B11scFv的构建与鉴定：将纯化PCR产物用NcoⅠ和XbaⅠ消化，在T4DNA连接酶的作用下，连入经相同内切酶消化的pKPL-3a中，获得含6B11scFv全序列的质粒pL-6B11scFv。将重组质粒分别用NcoⅠ、XbaⅠ和BglⅡ酶切，1 kg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段的大小；将重组质粒中的目的基因6B11scFv亚克隆到PUC19中，由美国Cybersyn公司自动测序。
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5.重组质粒的诱导表达、蛋白复性及纯化：将含有重组质粒的大肠杆菌pop2136在30℃活化，1∶100稀释后继续扩增培养至A600约为0.4时，立即42℃诱导4～6小时后收集菌体。超声破碎细菌细胞分离包涵体，包涵体经反复洗涤后用8 mol/L尿素变性溶解，加入复性液[50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris Cl)，1 mmol/L依地酸，1 mmol/L PMSF，5 mmol/L二硫化谷胱甘肽和0.5 mmol/L谷胱甘肽]稀释复性，10℃复性48小时。聚乙二醇浓缩后，对20 mmol/L Tris Cl (pH 8.0)、0.5 mol/L尿素透析平衡。采用二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换剂(瑞典Pharmacia公司产品)离子交换层析柱纯化浓缩后复性蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其纯度。
6.表达蛋白的活性检测：采用直接法ELISA和竞争抑制法ELISA检测活性[3]。
结 果
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一、6B11scFv基因PCR扩增
根据6B11scFv基因全序列设计一对引物，以pCANTAB5E-6B11scFv为模板，30个循环后，PCR产物经1 kg/L的琼脂糖凝胶电泳检测，在780 bp左右有一特异性扩增带，为6B11scFv基因片段(图1)。
1、2.6B11scFv DNA；3.相对分子质量标准(Φ 174DNA/Hae Ⅲ为1353、1078、872、603及310 bp)
图1 6B11scFv基因PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳
二、6B11scFv高效表达克隆的构建及其鉴定
6B11scFv基因插入pKPL-3a的NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点，重组表达载体为pL-6B11scFv。重组质粒经NcoⅠ和XbaⅠ双酶切，切下780 bp左右DNA片段，与6B11scFv片段大小一致；BglⅡ仅位于6B11scFv轻链可变区基因大约70 bp位置，重组质粒经NcoⅠ和BglⅡ双酶切，切下约500 bp DNA片段，与理论计算的片段大小相符合。
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为确定重组质粒中目的基因读码框架及序列是否正确，对重组质粒中的6B11scFv目的基因片段继续DNA序列分析表明，DNA序列与原序列相同且读码框架完全正确。
三、表达的6B11scFv蛋白分析
pL-6B11scFv转化大肠杆菌pop2136，温度诱导后，6B11scFv以包涵体的形式获高效表达，在相对分子质量为28 000处有浓表达带(图2)，表达量占菌体蛋白的30%以上。包涵体分离溶解复性后，经离子交换层析纯化，0.12 mol/L洗脱峰是表达蛋白，SDS-PAGE分析，纯度可达95%以上。
1.相对分子质量标准(相对分子质量为94 000、67 000、43 000及30 000)；2.诱导前；3.诱导后；4.超声破碎后上清；5.包涵体洗涤上清；6.包涵体；7.DEAE-Sepharose FF纯化带
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图2 SDS-PAGE鉴定6B11svFv表达和纯化
四、表达蛋白质的活性检测
直接法ELISA检测，纯化后表达蛋白质孔的A490值高于阴性对照的3倍以上，当辣根过氧化物酶标记的卵巢癌单克隆抗COC166-9(HRP-COC166-9)为1∶500稀释时，纯化表达蛋白质浓度在5 mg/L左右时，A490值接近于阳性对照。
竞争抑制法ELISA检测，纯化后表达蛋白质6B11scFv能特异性竞争卵巢癌抗原(OC166-9)与卵巢癌单克隆抗体(COC166-9)的结合，其抑制率达67%。
讨 论
卵巢癌在妇科恶性肿瘤中死亡率居首位，采用手术、化疗及放疗5年生存率仍较低，徘徊在30%～40%，生物治疗为卵巢癌的治疗提供了一条新的途径。因抗原内影像型抗独特型抗体，具有模拟抗原和免疫调节双重作用[4，5]，在肿瘤生物治疗中具有一定的意义。
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6B11为本中心制备的卵巢癌抗原内影像型抗独特型抗体，能诱导同系小鼠产生特异性抗卵巢癌免疫应答。为去除鼠抗体异源性，本中心利用基因工程方法克隆和表达了6B11抗独特型单链抗体(6B11scFv)。但其表达量低，限制了进一步基础和临床研究。因此，高效表达出具有免疫活性的6B11scFv蛋白质具有重要意义。
外源基因在大肠杆菌中的表达量与启动子、SD序列及转录终止子等有关。原核高效表达载体pKPL-3a具有PL强启动子，两个SD序列及转录终止子属温度控制诱导表达型[6]。我们根据已知6B11scFv全序列，设计并合成了扩增6B11scFv基因的引物，在6B11scFv基因两端引入NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点，将其克隆到pKPL-3a载体上，重组子转化大肠杆菌pop2136，温度诱导以包涵体的形式获高效表达，表达量占菌体蛋白的30%以上。
同时对6B11scFv表达动态进行了观察，不同的诱导时间及细菌生长状态对表达量有影响，当A600约为0.4时开始诱导，诱导4～5小时表达量最高。
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与分泌型表达相比，包涵体表达的蛋白量更大。但这种表达形式是没有抗原结合功能的，必须经过复性过程才能得到具有免疫活性的蛋白质。8 mol/L尿素能使包涵体蛋白质溶解，在二硫键还原剂的作用下，错配的二硫键被打开，包涵体蛋白被还原成只具有一级结构形式，在谷胱甘肽氧化还原体系中，抗体分子正确地形成二硫键，折叠成具有抗原结合能力的单链抗体。包涵体经溶解复性纯化后，能与卵巢癌单抗COC166-9反应并能有效竞争抑制卵巢癌初始抗原OC166-9与COC166-9的结合，说明表达蛋白能模拟卵巢癌初始抗原，具有较好的免疫活性。
6B11scFv在大肠杆菌中高效表达的研究，为进一步探讨利用基因工程抗独特型单链抗体作为抗原，引起机体免疫反应，提供了必要条件，为卵巢癌免疫防治奠定基础。
参考文献
1 Qian HN, Lu WY. Anti-idiotypic monoclonal antibodies against anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody COC166-9. Chin Med J, 1994, 107: 99-103.
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2 张香云，钱和年，邱并生，等.6B11卵巢癌抗独特型单链抗体表达及序列分析.北京医科大学学报，1996，28：252-255.
3 刘玉英，钱和年，黄华梁，等.以包涵体形式表达的6B11卵巢癌抗独特型单链抗体的复性、纯化和活性研究.北京医科大学学报，1998，30：400.
4 Herlyn D, Zaloudik J, Somasundaram R, et al. Anti-idiotype vaccine in colo-rectal cancer patients. Hybridoma, 1993, 12: 515-520.
5 Schlebusch H, Wagner U, Gruenn U, et al. A monoclonal antiidiotypic antibody ACA125 mimicking the tumor-associated antigen CA125 for immunotherapy of ovarian cancer. Hybridoma, 1995, 14: 167-173.
6 周宝宏，马大龙，狄春辉，等.人单核细胞衍生IL-8cDNA的体外PCR扩增及其在大肠杆菌中高效表达.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12：174-176.
(收稿：1998-05-04 修回：1998-10-10), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心(刘玉英、钱和年、冯捷、崔恒)；中国科学院遗传学研究所(黄华梁)
关键词：卵巢肿瘤；抗体，抗独特型；基因表达
中华医学杂志990326 【摘要】 目的 制备在大肠杆菌中高效表达6B11卵巢癌抗独特型单链抗体。方法 采用聚合酶链反应(PCR)克隆技术，将6B11scFv基因克隆到原核高效表达载体pKPL-3a上，重组子转化大肠杆菌pop2136，温度诱导表达；复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换层析纯化，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶鉴定蛋白纯度；直接法和竞争抑制法ELISA检测其活性。结果 6B11scFv以包涵体形式表达获高效表达；包涵体经溶解复性纯化，纯度达95%以上；表达蛋白能与卵巢癌单抗COC166-9特异结合并能有效抑制卵巢癌抗原OC166-9与卵巢癌单抗COC166-9的特异结合。结论 6B11scFv基因可在原核细胞中高效表达，表达产物经复性纯化后具有较好的免疫活性。
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High-level expression of 6B11 ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody scFv genes in E.Coli LIU Yuying *, QIAN Henian, HUANG Hualiang, et al. * Gynecologic Oncology Center, People′s Hospital Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To express high-level 6B11 ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody single chain Fv (scFv) genes in E. Coli. Methods Using PCR cloning technique, We cloned 6B11scFv genes into bacterial expression vector pKPL-3a. Recombinant plasmid vector pL-6B11scFv was transformed into E. Coli pop2136 with temperature control to produce proteins. Renaturated proteins were purified on DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange column with salt gradient elution. Immunoactivity was determined with ELISA and inhibition ELISA tests respectively. Results 6B11scFv genes were expressed as inclusion bodies in the cytoplasm. The purity of 6B11scFv turned out by SDS-PAGE was more than 95%. The expressed proteins after purification specifically reacted with anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody COC166-9 and efficiently inhibited the reaction between primary ovarian carcinoma antigen OC166-9 and COC166-9. Conclusion We successfully expressed high-level 6B11scFv genes in E. Coli. Expressed proteins showed pretty good immunoactivity.
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【Key words】 Ovarian neoplasms Antibody, anti-idiotypic Gene expression
(Natl Med J, China 1999,79:221-223)
卵巢癌抗独特型抗体6B11能模拟卵巢癌抗原诱导动物体内产生特异性抗肿瘤免疫应答[1]。为降低其鼠源性，本中心已成功制备了基因工程抗独特型单链抗体(6B11scFv)[2]。但其表达量较低，限制了进一步研究和临床应用。本研究旨在采用聚合酶链反应(PCR)克隆技术，选择高效表达载体，高效表达有免疫活性的6B11scFv，为卵巢癌免疫防治提供基础。
材料与方法
1.质粒和菌株：pCANTAB5E-6B11scFv为本中心构建。原核高效表达载体pKPL-3a(3.6 kb含PL启动子，一个天然SD序列，一个人工SD序列，Nco Ⅰ，Xba Ⅰ等酶切位点及终止子)以及大肠杆菌pop2136(含CI857基因，编码温度敏感性λ阻遏蛋白)均为北京医科大学免疫学系马大龙教授惠赠。
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2.抗原和抗体：卵巢癌组织抗原OC166-9及卵巢癌单克隆抗体COC166-9为本中心制备。
3.6B11scFv基因的PCR扩增：根据6B11scFv全序列[2]，设计5′和3′一对引物，为便于重组，在5′引物5′端加上NcoⅠ酶切位点，因其内含ATG起始密码，为保证读码框架一致，在酶切位点后加上2个碱基G和T，使ATG后第一个氨基酸为甘氨酸；在3′引物的5′端加上XbaⅠ酶切位点及终止密码TAA。5′引物：5′-CTCCATGGGTCAGGTCAAACTGCAGGAGTC -3′，3′引物：5′-GCTCTAGATTACCGTTTTATTTC CAACTTTGTCC-3′。引物由美国Cybersyn公司合成。以pCANTAB5E-6B11scFv为模板，首次变性95℃5分钟后，进入PCR循环：60℃90秒，72℃120秒，95℃50秒，共30个周期，最后72℃延伸7分钟。
4.高效表达质粒pL-6B11scFv的构建与鉴定：将纯化PCR产物用NcoⅠ和XbaⅠ消化，在T4DNA连接酶的作用下，连入经相同内切酶消化的pKPL-3a中，获得含6B11scFv全序列的质粒pL-6B11scFv。将重组质粒分别用NcoⅠ、XbaⅠ和BglⅡ酶切，1 kg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段的大小；将重组质粒中的目的基因6B11scFv亚克隆到PUC19中，由美国Cybersyn公司自动测序。
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5.重组质粒的诱导表达、蛋白复性及纯化：将含有重组质粒的大肠杆菌pop2136在30℃活化，1∶100稀释后继续扩增培养至A600约为0.4时，立即42℃诱导4～6小时后收集菌体。超声破碎细菌细胞分离包涵体，包涵体经反复洗涤后用8 mol/L尿素变性溶解，加入复性液[50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris Cl)，1 mmol/L依地酸，1 mmol/L PMSF，5 mmol/L二硫化谷胱甘肽和0.5 mmol/L谷胱甘肽]稀释复性，10℃复性48小时。聚乙二醇浓缩后，对20 mmol/L Tris Cl (pH 8.0)、0.5 mol/L尿素透析平衡。采用二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换剂(瑞典Pharmacia公司产品)离子交换层析柱纯化浓缩后复性蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其纯度。
6.表达蛋白的活性检测：采用直接法ELISA和竞争抑制法ELISA检测活性[3]。
结 果
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一、6B11scFv基因PCR扩增
根据6B11scFv基因全序列设计一对引物，以pCANTAB5E-6B11scFv为模板，30个循环后，PCR产物经1 kg/L的琼脂糖凝胶电泳检测，在780 bp左右有一特异性扩增带，为6B11scFv基因片段(图1)。
1、2.6B11scFv DNA；3.相对分子质量标准(Φ 174DNA/Hae Ⅲ为1353、1078、872、603及310 bp)
图1 6B11scFv基因PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳
二、6B11scFv高效表达克隆的构建及其鉴定
6B11scFv基因插入pKPL-3a的NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点，重组表达载体为pL-6B11scFv。重组质粒经NcoⅠ和XbaⅠ双酶切，切下780 bp左右DNA片段，与6B11scFv片段大小一致；BglⅡ仅位于6B11scFv轻链可变区基因大约70 bp位置，重组质粒经NcoⅠ和BglⅡ双酶切，切下约500 bp DNA片段，与理论计算的片段大小相符合。
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为确定重组质粒中目的基因读码框架及序列是否正确，对重组质粒中的6B11scFv目的基因片段继续DNA序列分析表明，DNA序列与原序列相同且读码框架完全正确。
三、表达的6B11scFv蛋白分析
pL-6B11scFv转化大肠杆菌pop2136，温度诱导后，6B11scFv以包涵体的形式获高效表达，在相对分子质量为28 000处有浓表达带(图2)，表达量占菌体蛋白的30%以上。包涵体分离溶解复性后，经离子交换层析纯化，0.12 mol/L洗脱峰是表达蛋白，SDS-PAGE分析，纯度可达95%以上。
1.相对分子质量标准(相对分子质量为94 000、67 000、43 000及30 000)；2.诱导前；3.诱导后；4.超声破碎后上清；5.包涵体洗涤上清；6.包涵体；7.DEAE-Sepharose FF纯化带
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图2 SDS-PAGE鉴定6B11svFv表达和纯化
四、表达蛋白质的活性检测
直接法ELISA检测，纯化后表达蛋白质孔的A490值高于阴性对照的3倍以上，当辣根过氧化物酶标记的卵巢癌单克隆抗COC166-9(HRP-COC166-9)为1∶500稀释时，纯化表达蛋白质浓度在5 mg/L左右时，A490值接近于阳性对照。
竞争抑制法ELISA检测，纯化后表达蛋白质6B11scFv能特异性竞争卵巢癌抗原(OC166-9)与卵巢癌单克隆抗体(COC166-9)的结合，其抑制率达67%。
讨 论
卵巢癌在妇科恶性肿瘤中死亡率居首位，采用手术、化疗及放疗5年生存率仍较低，徘徊在30%～40%，生物治疗为卵巢癌的治疗提供了一条新的途径。因抗原内影像型抗独特型抗体，具有模拟抗原和免疫调节双重作用[4，5]，在肿瘤生物治疗中具有一定的意义。
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6B11为本中心制备的卵巢癌抗原内影像型抗独特型抗体，能诱导同系小鼠产生特异性抗卵巢癌免疫应答。为去除鼠抗体异源性，本中心利用基因工程方法克隆和表达了6B11抗独特型单链抗体(6B11scFv)。但其表达量低，限制了进一步基础和临床研究。因此，高效表达出具有免疫活性的6B11scFv蛋白质具有重要意义。
外源基因在大肠杆菌中的表达量与启动子、SD序列及转录终止子等有关。原核高效表达载体pKPL-3a具有PL强启动子，两个SD序列及转录终止子属温度控制诱导表达型[6]。我们根据已知6B11scFv全序列，设计并合成了扩增6B11scFv基因的引物，在6B11scFv基因两端引入NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点，将其克隆到pKPL-3a载体上，重组子转化大肠杆菌pop2136，温度诱导以包涵体的形式获高效表达，表达量占菌体蛋白的30%以上。
同时对6B11scFv表达动态进行了观察，不同的诱导时间及细菌生长状态对表达量有影响，当A600约为0.4时开始诱导，诱导4～5小时表达量最高。
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与分泌型表达相比，包涵体表达的蛋白量更大。但这种表达形式是没有抗原结合功能的，必须经过复性过程才能得到具有免疫活性的蛋白质。8 mol/L尿素能使包涵体蛋白质溶解，在二硫键还原剂的作用下，错配的二硫键被打开，包涵体蛋白被还原成只具有一级结构形式，在谷胱甘肽氧化还原体系中，抗体分子正确地形成二硫键，折叠成具有抗原结合能力的单链抗体。包涵体经溶解复性纯化后，能与卵巢癌单抗COC166-9反应并能有效竞争抑制卵巢癌初始抗原OC166-9与COC166-9的结合，说明表达蛋白能模拟卵巢癌初始抗原，具有较好的免疫活性。
6B11scFv在大肠杆菌中高效表达的研究，为进一步探讨利用基因工程抗独特型单链抗体作为抗原，引起机体免疫反应，提供了必要条件，为卵巢癌免疫防治奠定基础。
参考文献
1 Qian HN, Lu WY. Anti-idiotypic monoclonal antibodies against anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody COC166-9. Chin Med J, 1994, 107: 99-103.
, 百拇医药
2 张香云，钱和年，邱并生，等.6B11卵巢癌抗独特型单链抗体表达及序列分析.北京医科大学学报，1996，28：252-255.
3 刘玉英，钱和年，黄华梁，等.以包涵体形式表达的6B11卵巢癌抗独特型单链抗体的复性、纯化和活性研究.北京医科大学学报，1998，30：400.
4 Herlyn D, Zaloudik J, Somasundaram R, et al. Anti-idiotype vaccine in colo-rectal cancer patients. Hybridoma, 1993, 12: 515-520.
5 Schlebusch H, Wagner U, Gruenn U, et al. A monoclonal antiidiotypic antibody ACA125 mimicking the tumor-associated antigen CA125 for immunotherapy of ovarian cancer. Hybridoma, 1995, 14: 167-173.
6 周宝宏，马大龙，狄春辉，等.人单核细胞衍生IL-8cDNA的体外PCR扩增及其在大肠杆菌中高效表达.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12：174-176.
(收稿：1998-05-04 修回：1998-10-10), 百拇医药