肿瘤细胞AO/EB荧光染色法在药敏试验中的可行性探讨
作者：袁小鹏 焦伟华 徐如祥
单位：第一军医大学珠江医院神经外科(广州，510282)
关键词：细胞凋亡；荧光染色；药敏试验
中图号
中图号：R730.5 文献标识码：B 文章编号：1000-467X(1999)03-0359-02
药物诱导肿瘤细胞凋亡被认为是药物杀伤肿瘤细胞的一种途径，对药物作用后肿瘤细胞的凋亡和坏死同时观察则更有意义。在鉴别肿瘤细胞坏死和凋亡的方法中，吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染色荧光显微镜观察法简便易行，结果判断容易，可以直接从形态上进行观察。我们参考Duke等〔1〕的方法，比较了AO/EB荧光染色法与流式细胞仪检测结果及MTT试验结果。
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1 材料与方法
1.1 细胞系及主要试剂
U251人脑胶质瘤细胞系引自第二军医大学长征医院神经外科。吖啶橙(Acridine orange,AO)、溴乙锭(Ethidium bromide,EB)、噻唑蓝(Thiazolyl blue,MTT)、碘化丙锭(Propidium iodide,PI)均为Sigma公司生产，DMEM(Gibco公司生产)，顺铂(DDP，山东齐鲁制药厂生产)。
1.2 实验处理及方法
1.2.1 细胞培养：U251细胞由含10%小牛血清的DMEM培养基37℃5%CO2恒温孵箱培养。试验前用台盼蓝染色法鉴定活力在98%以上。
1.2.2 凋亡的诱导及AO/EB双染色〔1〕：待细胞长至80%汇合，加入顺铂(5、10、20μg/ml)作用24、48、72h后，再加入0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化细胞，制备单细胞悬液，调细胞浓度为107/ml，取细胞悬液25μl，加2μlAO染液(100μg/ml)及2μlEB染液(100μg/ml)，滴于载玻片，盖片封片后荧光显微镜直接观察，于20min内计数500个细胞。
, 百拇医药
1.2.3 改良MTT试验〔2〕：细胞消化后以104个/孔接种于96孔细胞培养板，培育24h后加入不同浓度的顺铂，培养48h后加MTT10μl(5mg/ml)再培养4h，然后去上清，加100μl0.04mmol/LHCl酸化的异丙醇溶解生成的结晶，置微量振荡器振荡10min，用酶标仪在570nm测OD值。计算细胞抑制率=(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100%，每孔设8个复孔。
1.2.4 流式细胞仪检测：离心收集1×106细胞，PBS洗涤后制成单细胞悬液，用预冷的70%乙醇固定24h以上。染色前用400目筛网过滤2次，加200μlRNase(1mg/ml)，37℃水浴30min，再加800μlPI染液(100μg/ml)混匀，4℃避光保存，24h内上机测试，每组实验重复3次。
1.2.5 统计学方法：两均数间比较采用配对t检验，3个均数间比较采用方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 AO/EB双染色荧光显微镜观察
可将细胞分为4种类型：①正常活细胞(viablenonapoptoticcell,VNA)，②早期凋亡细胞(viable apoptotic cell,VA)，③晚期凋亡细胞(non-viable apoptotic cell,NVA)和④坏死细胞(non-viable non-apoptotic cell,NVNA)。细胞凋亡率按以下公式计算：Apoptosis%=(VA+NVA)/Total cellcount×100%；细胞毒性按以下公式计算：Cytotoxicity%=(VA+NVA+NVNA)/Total cell count×100%。不同浓度顺铂作用后各组的细胞凋亡率见表1，在同一浓度各时间点之间均有显著差异(P<0.01)；在同一时间各浓度间比较，24h无显著差异(P>0.05)，48h、72h均有显著差异(P<0.01)
, 百拇医药
表1 AO/EB荧光染色细胞毒性率(%)
时间
(h)
DDP浓度(μg/ml)
5
10
20
24
10.83±1.29
11.23±1.32
11.17±1.21★
48
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46.80±2.71
58.67±1.01
84.53±3.57★★
72
79.83±1.50Δ
89.27±3.31Δ
97.13±1.26★★Δ
时间之间比较，P<0.01；★浓度之间比较P>0.05；
★★浓度之间比较，P<0.01；
, http://www.100md.com 2.2 改良MTT检测法
在同一浓度各时间点之间，同一时间点各浓度之间细胞抑制率均有显著差异(P<0.01)(见表2)。
表2 改良MTT法细胞毒性率(%)
时间
(h)
DDP浓度(μg/ml)
5
10
20
24
8.83±3.18Δ
, 百拇医药 16.97±1.85Δ
32.90±2.08★★Δ
48
19.99±4.89
34.45±2.11
61.38±4.75★★
72
62.56±3.82
77.44±2.33
83.03±1.75★★
Δ时间之间比较，P<0.01；★★浓度之间比较P>0.01；
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2.3 流式细胞仪检测
在各浓度顺铂作用48h后，用流式细胞仪检测的细胞凋亡率均比相应AO/EB法所得的细胞凋亡率高(见表3)。
表3 荧光染色法与流式细胞术凋亡率(%)比较
检测方法
DDP浓度(μg/ml)
5
10
20
荧光染色法
26.3±1.7
41.0±1.6
, 百拇医药
57.6±2.1
流式细胞术
31.7±1.5★
47.2±0.9★★
6.7±1.8★★
两种方法间比较：★P<0.05；★★P>0.01；
3 讨论
抗癌药物对肿瘤细胞作用的结果有多种，如细胞增殖抑制、分化、凋亡和坏死。其中的细胞坏死和凋亡能够通过形态学方法加以鉴别。AO/EB双荧光染色法是一种鉴别细胞坏死和凋亡的简便方法。
, http://www.100md.com AO能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光，与RNA结合显桔红色荧光。早期凋亡细胞的细胞膜正常，胞浆浓缩，核DNA浓缩致密，低倍镜下呈荧光亢进的圆珠状小体，高倍镜下可见不规则的块状荧光。晚期凋亡细胞胞膜通透性破坏被EB染成红色，核形态与早期凋亡细胞相似，或为浓染的红色碎片(核碎裂)或凋亡小体。而细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，呈不均匀的橙红色荧光(图1)。
图1 AO/EB双荧光染色的(U251细胞(40×)
A.正常活细胞；B.早期凋亡细胞；C.晚期凋亡细胞；D.坏死细胞
MTT法检测的是活性细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的活性，对部分早期凋亡细胞则存在漏检的可能性。而AO/EB荧光染色法对细胞增殖抑制作用不能作出评估；使用两种方法评价药物的细胞毒性作用时，除24h组存在差别外，其余各组结果完全一致，这可能由于较高浓度顺铂的抑制细胞增殖作用更明显，MTT法可显示此差异，而荧光染色法未能显示此差异。AO/EB荧光染色法所得的细胞凋亡率较PI单染色流式细胞仪检测法结果为低，原因可能有两个方面：①流式细胞术检测时部分坏死细胞或细胞碎片混入亚二倍体细胞群(峰)中，而使细胞凋亡率偏高〔3〕；②部分早期凋亡细胞虽已出现DNA断裂，但尚未出现明显的形态学改变。国内亦有报道采用形态学鉴定法所得的细胞凋亡率比末端脱氧核苷酰转移酶法(TUNEL法)低〔4〕。我们在AO/EB荧光染色法的应用过程中亦发现有些细胞的形态介于VA和VNA之间，难以分类。细胞凋亡的发生是一个连续的过程，因而在应用AO/EB荧光染色法筛选化疗药物时，最好应用小剂量的药物作48h以上的处理。AO/EB荧光染色法能提供肿瘤细胞凋亡和坏死的发生率，用它判断的细胞毒性与MTT试验一致。因此，AO/EB荧光染色法有可能能用于肿瘤化疗药物的筛选。AO/EB荧光染色法和MTT法各有优缺点，如能结合使用，则能提供更准确的信息。
, 百拇医药
参考文献
1 Duke RC,Cohen JJ.Morphological and biological assays of apoptosis〔J〕.Curr Prot Immunol, 1992,1：3,17
2 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays〔J〕.J Immunol Methods, 1983,65：55～63.
3 郑泽铣，李宁丽，沈佰华，等流式细胞术定量检测细胞凋亡〔J〕.上海免疫学杂志，1995，15(5)：273
4 童彤，孙含笑，刘丽影，等.应用末端脱氧核苷酰转移酶法研究化疗药诱导人肿瘤细胞的凋亡〔J〕.中华肿瘤杂志，1997，19(2)：111
收稿日期：1998-02-01；修回日期：1998-04-16, 百拇医药
单位：第一军医大学珠江医院神经外科(广州，510282)
关键词：细胞凋亡；荧光染色；药敏试验
中图号
中图号：R730.5 文献标识码：B 文章编号：1000-467X(1999)03-0359-02
药物诱导肿瘤细胞凋亡被认为是药物杀伤肿瘤细胞的一种途径，对药物作用后肿瘤细胞的凋亡和坏死同时观察则更有意义。在鉴别肿瘤细胞坏死和凋亡的方法中，吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染色荧光显微镜观察法简便易行，结果判断容易，可以直接从形态上进行观察。我们参考Duke等〔1〕的方法，比较了AO/EB荧光染色法与流式细胞仪检测结果及MTT试验结果。
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1 材料与方法
1.1 细胞系及主要试剂
U251人脑胶质瘤细胞系引自第二军医大学长征医院神经外科。吖啶橙(Acridine orange,AO)、溴乙锭(Ethidium bromide,EB)、噻唑蓝(Thiazolyl blue,MTT)、碘化丙锭(Propidium iodide,PI)均为Sigma公司生产，DMEM(Gibco公司生产)，顺铂(DDP，山东齐鲁制药厂生产)。
1.2 实验处理及方法
1.2.1 细胞培养：U251细胞由含10%小牛血清的DMEM培养基37℃5%CO2恒温孵箱培养。试验前用台盼蓝染色法鉴定活力在98%以上。
1.2.2 凋亡的诱导及AO/EB双染色〔1〕：待细胞长至80%汇合，加入顺铂(5、10、20μg/ml)作用24、48、72h后，再加入0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化细胞，制备单细胞悬液，调细胞浓度为107/ml，取细胞悬液25μl，加2μlAO染液(100μg/ml)及2μlEB染液(100μg/ml)，滴于载玻片，盖片封片后荧光显微镜直接观察，于20min内计数500个细胞。
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1.2.3 改良MTT试验〔2〕：细胞消化后以104个/孔接种于96孔细胞培养板，培育24h后加入不同浓度的顺铂，培养48h后加MTT10μl(5mg/ml)再培养4h，然后去上清，加100μl0.04mmol/LHCl酸化的异丙醇溶解生成的结晶，置微量振荡器振荡10min，用酶标仪在570nm测OD值。计算细胞抑制率=(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100%，每孔设8个复孔。
1.2.4 流式细胞仪检测：离心收集1×106细胞，PBS洗涤后制成单细胞悬液，用预冷的70%乙醇固定24h以上。染色前用400目筛网过滤2次，加200μlRNase(1mg/ml)，37℃水浴30min，再加800μlPI染液(100μg/ml)混匀，4℃避光保存，24h内上机测试，每组实验重复3次。
1.2.5 统计学方法：两均数间比较采用配对t检验，3个均数间比较采用方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 AO/EB双染色荧光显微镜观察
可将细胞分为4种类型：①正常活细胞(viablenonapoptoticcell,VNA)，②早期凋亡细胞(viable apoptotic cell,VA)，③晚期凋亡细胞(non-viable apoptotic cell,NVA)和④坏死细胞(non-viable non-apoptotic cell,NVNA)。细胞凋亡率按以下公式计算：Apoptosis%=(VA+NVA)/Total cellcount×100%；细胞毒性按以下公式计算：Cytotoxicity%=(VA+NVA+NVNA)/Total cell count×100%。不同浓度顺铂作用后各组的细胞凋亡率见表1，在同一浓度各时间点之间均有显著差异(P<0.01)；在同一时间各浓度间比较，24h无显著差异(P>0.05)，48h、72h均有显著差异(P<0.01)
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表1 AO/EB荧光染色细胞毒性率(%)
时间
(h)
DDP浓度(μg/ml)
5
10
20
24
10.83±1.29
11.23±1.32
11.17±1.21★
48
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46.80±2.71
58.67±1.01
84.53±3.57★★
72
79.83±1.50Δ
89.27±3.31Δ
97.13±1.26★★Δ
时间之间比较，P<0.01；★浓度之间比较P>0.05；
★★浓度之间比较，P<0.01；
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在同一浓度各时间点之间，同一时间点各浓度之间细胞抑制率均有显著差异(P<0.01)(见表2)。
表2 改良MTT法细胞毒性率(%)
时间
(h)
DDP浓度(μg/ml)
5
10
20
24
8.83±3.18Δ
, 百拇医药 16.97±1.85Δ
32.90±2.08★★Δ
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19.99±4.89
34.45±2.11
61.38±4.75★★
72
62.56±3.82
77.44±2.33
83.03±1.75★★
Δ时间之间比较，P<0.01；★★浓度之间比较P>0.01；
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2.3 流式细胞仪检测
在各浓度顺铂作用48h后，用流式细胞仪检测的细胞凋亡率均比相应AO/EB法所得的细胞凋亡率高(见表3)。
表3 荧光染色法与流式细胞术凋亡率(%)比较
检测方法
DDP浓度(μg/ml)
5
10
20
荧光染色法
26.3±1.7
41.0±1.6
, 百拇医药
57.6±2.1
流式细胞术
31.7±1.5★
47.2±0.9★★
6.7±1.8★★
两种方法间比较：★P<0.05；★★P>0.01；
3 讨论
抗癌药物对肿瘤细胞作用的结果有多种，如细胞增殖抑制、分化、凋亡和坏死。其中的细胞坏死和凋亡能够通过形态学方法加以鉴别。AO/EB双荧光染色法是一种鉴别细胞坏死和凋亡的简便方法。
, http://www.100md.com AO能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光，与RNA结合显桔红色荧光。早期凋亡细胞的细胞膜正常，胞浆浓缩，核DNA浓缩致密，低倍镜下呈荧光亢进的圆珠状小体，高倍镜下可见不规则的块状荧光。晚期凋亡细胞胞膜通透性破坏被EB染成红色，核形态与早期凋亡细胞相似，或为浓染的红色碎片(核碎裂)或凋亡小体。而细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，呈不均匀的橙红色荧光(图1)。
图1 AO/EB双荧光染色的(U251细胞(40×)
A.正常活细胞；B.早期凋亡细胞；C.晚期凋亡细胞；D.坏死细胞
MTT法检测的是活性细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的活性，对部分早期凋亡细胞则存在漏检的可能性。而AO/EB荧光染色法对细胞增殖抑制作用不能作出评估；使用两种方法评价药物的细胞毒性作用时，除24h组存在差别外，其余各组结果完全一致，这可能由于较高浓度顺铂的抑制细胞增殖作用更明显，MTT法可显示此差异，而荧光染色法未能显示此差异。AO/EB荧光染色法所得的细胞凋亡率较PI单染色流式细胞仪检测法结果为低，原因可能有两个方面：①流式细胞术检测时部分坏死细胞或细胞碎片混入亚二倍体细胞群(峰)中，而使细胞凋亡率偏高〔3〕；②部分早期凋亡细胞虽已出现DNA断裂，但尚未出现明显的形态学改变。国内亦有报道采用形态学鉴定法所得的细胞凋亡率比末端脱氧核苷酰转移酶法(TUNEL法)低〔4〕。我们在AO/EB荧光染色法的应用过程中亦发现有些细胞的形态介于VA和VNA之间，难以分类。细胞凋亡的发生是一个连续的过程，因而在应用AO/EB荧光染色法筛选化疗药物时，最好应用小剂量的药物作48h以上的处理。AO/EB荧光染色法能提供肿瘤细胞凋亡和坏死的发生率，用它判断的细胞毒性与MTT试验一致。因此，AO/EB荧光染色法有可能能用于肿瘤化疗药物的筛选。AO/EB荧光染色法和MTT法各有优缺点，如能结合使用，则能提供更准确的信息。
, 百拇医药
参考文献
1 Duke RC,Cohen JJ.Morphological and biological assays of apoptosis〔J〕.Curr Prot Immunol, 1992,1：3,17
2 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays〔J〕.J Immunol Methods, 1983,65：55～63.
3 郑泽铣，李宁丽，沈佰华，等流式细胞术定量检测细胞凋亡〔J〕.上海免疫学杂志，1995，15(5)：273
4 童彤，孙含笑，刘丽影，等.应用末端脱氧核苷酰转移酶法研究化疗药诱导人肿瘤细胞的凋亡〔J〕.中华肿瘤杂志，1997，19(2)：111
收稿日期：1998-02-01；修回日期：1998-04-16, 百拇医药