DNA引物酶抑制剂筛选方法的建立及应用
作者：朱孝峰 刘宗潮 谢冰芬 冯公侃 潘启超
单位：中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室(广州，510060)
关键词：DNA引物酶；抑制剂；药物筛选
New Page 1
【摘要】目的：建立DNA引物酶抑制剂的筛选方法，并应用于大量筛选，找出对DNA引物酶有抑制作用的抗癌药物或先导化合物。方法：以小鼠艾氏腹水癌细胞破碎液为材料，过DE-52和P-11层析柱，提取分离DNA引物酶，用大肠杆菌大片段DNA多聚酶Ⅰ延长引物法检测DNA引物酶的活性。并在此反应液中加入化合物检测对DNA引物酶活性的抑制作用，以激活的小牛胸腺DNA为模板排除化合物对大片断DNA多聚酶Ⅰ的抑制作用。结果：部分纯化的DNA引物酶比活性为8753U/mg，酶的总获得率为22.1%。在100μg/ml浓度下，氯霉素和鞘氨醇对DNA引物酶活性抑制率分另为71.2%±3.7%和83.0%±5.4%。结论：该方法已经建立，大量筛选发现非抗癌药物的氯霉素和鞘氨醇两种化合物对DNA引物酶活性有抑制作用。临床常用的抗癌药物未发现对此酶活性有抑制作用。
, http://www.100md.com
中图号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0292-03
The establishment of a screening method of DNA primase inhibitors
ZHU Xiao-feng，LIU Zoug-chao，XIE Bin-feng，et al
Department of Therapeutic Basis Cancer Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,China
【Abstract】Objective：To establish the screening method of DNA primase inhibitors.The leading compouds of inhibiting DNA primase activity were found through this method.Methods：DNA primase was extracted from mouse EAC cells, then was partially purified and identified.Its activity was assayed using indirect method, namely poly〔dT〕,ATP,3H-dATP as substrate,and 0.2u E.coli.DNA polymerase ⅠKlenow fragment was added to the reaction mixture.The inhibitory effects of the drugs on DNA primase activity were assayed.Results：The effect of drugs on DNA primase activity were studied.Under the concentration of 100 μ g/ml ,inhibitory rate of chloramphenicol and sphingosine were 70.5%± 2.7% and 83.0%±5.4%.However,all the conventional antitumor agents showed no inhibitory effect.Conclusion：1.The screening method of DNA primase inhibitors was established.2. Chloramphenicol and sphingosine have inhibitory effect on primase activity.
, 百拇医药
Key words：DNA primase;Inhibitor;Screening
DNA引物酶是存在于细胞核中，由48KD、58KD两个亚基组成，其中48KD亚基是引物酶活性所在，而58KD亚基可能是起着与DNA结合的作用〔1〕。DNA引物酶的功能是在DNA复制时完成引物的合成，从而启动DNA的复制的作用，该酶在DNA复制中起着十分重要的作用〔2〕。肿瘤细胞的DNA复制活跃，此酶的活性高于正常细胞6倍之多〔3〕。抑制DNA引物酶即抑制了引物的合成，DNA的合成就会受到抑制，肿瘤细胞不能繁殖，因此可能达到抗瘤作用〔4〕。本文建立了一个快速而可用于大规模筛选的方法，并用此法筛选了临床常用的抗癌药物和一些其它化合物。
1 材料与方法
1.1 实验材料
, 百拇医药
昆明种小白鼠购自中山医科大学实验动物中心，小鼠艾氏腹水癌瘤株由本实验室提供。Poly(dT)为Sigma公司，DDT为Promeger公司产品，磷酸纤维素柱(Phosphocellulose 11,P-11)为Whatman公司产品。DEAE-cellulose(DE-52),SERVA公司产品。3H-dATP、苯甲磺胺氟(PMSF)、乙酸纤维素薄膜等均为国内购买。大肠杆菌DNA多聚酶I大片段为Promega产品。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA引物酶的提取：取接种7～9d艾氏腹水癌细胞的小鼠腹水，4000r/min离心(转子半径11cm)，再用磷酸缓冲液洗涤后4000r/min离心(转子半径11cm)。以下步骤在4℃下进行，取细胞5g加30ml缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl,pH=7.5,1mmol/L DTT,0.1mmol/L EDTA,0.1mmol/L PMSF)，混匀后超声破碎癌细胞(超声作用每次30s，停1min，共5次，功率为145W)，镜检罕见完整细胞为准。匀浆18000r/min离心(转子半径11cm)30min，收集上清液加到预先用bufferB(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,20mmol/L KCl,0.1mmol/L EDTA,20%甘油)平衡过的DEAE-cellulose(ED-52)柱(35ml)用70mLbufferB洗之。再用25mlbufferB和25mlbufferC(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,300mmol/LKCl,0.1mmol/LEDTA,20%甘油)线性梯度洗脱，检测DNA引物酶的活性后取少量酶液真空浓缩，检测蛋白含量，收集酶活性部分，加入预先用bufferD(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,150mmol/LKCl,1mmol/LDTT,30%甘油)平衡过的P-11柱(25ml)中，用50mlbufferD洗之，再用10mlbufferD和10mlBufferE(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,400mmol/LKCl,1mmol/LDTT,30%甘油)作线性梯度洗脱，检测酶活性，收集有酶活性的部分，保存在-80℃下备用。
, 百拇医药
1.2.2 酶活性的测定：反应液(30μl)含有50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,0.1%PEG6000，0.1mg/mlBSA,3mmol/LDTT,6mmol/LMgCl2,33μg/mlpoly(dT),2mmol/LATP,0.25μmol/L3H-dATP,10%甘油，3μl酶液，0.2U大肠杆菌大片断DNA多聚酶Ⅰ，37℃保温30min后，加入EDTA至10mmol/L终止反应，移至乙酸纤维薄膜上，晾干后，除1管不漂洗用于测定总CPM数外，其它均用5%三氯醋酸漂洗3min×2次，95%乙醇漂洗2min×2次，晾干后，放入含有4ml闪烁液的测定瓶中，在LKB液体闪烁计数仪中检测CPM。以每聚合1pmoldATP为一个酶活性单位。
1.2.3 DNA引物酶活性的抑制实验：在酶活性反应液中加入一定浓度的待测的化合物样品，设一个无药对照，每个样品均设2个平行管，每种药物做3批重复实验，其他实验步骤基本与酶活性测定相同，分别计算抑制率。
, http://www.100md.com
2 实验结果
2.1 DNA引物酶的分离提取
通过DE52柱和P-11柱后，提取DNA引物酶，酶的总活性获得率为22%，酶的比活性从粗酶液的39.6U/mg蛋白到部纯分化酶液的8753U/mg蛋白(见表1)。
表1 DNA引物酶的分离提取
项目
体积(ml)
总蛋白(mg)
总活性(U)
比活性(U/mg蛋白)
收得率(%)
, http://www.100md.com
Crude
30
150
3960
39.6
100
DE52
8
1.6
1655
1034.4
41.8
P-11
, 百拇医药
3
0.15
902
8753
22.1
2.2 DNA引物酶活性的抑制实验
化合物的浓度均取100μg/ml，发现氯霉素和鞘氨醇对DNA引物酶活性有明显的抑制作用，抑制率分别为71.2%±3.7%和83%±5.4%，而临床常用的抗癌药物阿霉素、米托蒽醌、氨甲喋呤、环磷酰胺、顺氯氨铂、长春新碱、噻替哌、甲基苄肼、表阿霉素、氮芥等对DNA引物酶活性均无抑制作用。用激活的小牛胸腺DNA为模板检测发现氯霉素和鞘氨醇对大片段DNA多聚酶Ⅰ均无抑制作用。
3 讨论
, http://www.100md.com
DNA的复制是肿瘤细胞增殖的关键，DNA复制首先是解旋，随后由DNA引物酶结合于DNA单链上，并在其上滑动，寻找复制起始点，合成一长7～10个核苷酸的RNA引物，随后由多聚酶α聚合dNTP完成引物的延长〔5〕。DNA引物酶只参与DNA复制的起始引物的合成，不象DNA多聚酶不仅参与DNA的复制而且还参与DNA的修复，所以抑制DNA引物酶活性的药物可能有着更小的副作用；而DNA引物酶活性直接检测需要用32P-ATP作底物，聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影〔6〕，此法不可能用于大量的药物筛选中。本实验根据DNA引物酶合成引物后，DNA多聚酶延长引物这一特性，建立DNA引物酶抑制剂的筛选方法。但是现有的抗癌药物均在本试验上不呈现抑制作用，所以本法能否用于筛选抗癌药物尚未肯定，或仅适用于某种结构的抗癌药物的筛选，亦未可知。但另一种可能性为目前常用的抗癌药物中还没有通过抑制DNA引物酶活性而达到抗瘤作用的，DNA引物酶抑制剂有可能是一类新作用机理的抗癌药物，因为Longhese〔7〕用基因工程方法使细胞中的DNA引物酶产生无活性突变后，细胞无法存活，表明抑制DNA引物酶活性可以抑制细胞生长。用本实验建立的方法对大量的化合物进行了筛选，发现氯霉素和鞘氨醇两种化合物对DNA引物酶有抑制作用，这两种化合物本身无抗瘤作用，可能是因为抑制DNA引物酶活性不够强或其它原因以致在细胞中不能很地抑制DNA引物酶活性，但此两种化合物在结构上有一定的共同之处。我们准备根据此两种化合物的结构以及DNA引物酶的氨基酸序列、活性中心的结构，设计一系列化合物进行筛选，找出一个抑制作用更强且可应用为抗癌药物的DNA引物酶抑制剂。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助(No：39370800；39870886)
参考文献
1 Kuchta RD, Reid B, Chang LM. DNA primase processivity and the primase to polymerase α activity switch〔J〕.J Biol Chem,1990, 265：16158.
2 Catapano CV, Perrino FW,Fernandes DJ.Primase RNA chain termination Induced by 9-β-D arabinofuranosyladenosine triphosphate〔J〕. J Biol Chem,1993,268：7179.
3 Kuchta Rd,IlsLey D,Kravig KD. Inhibition of DNA primase and polymerase alpha by arabinofuranosylnucleoside triphosphates and related compounds 〔J〕. Biochem,1992,31：4720.
, 百拇医药
4 Nasheuer HP, Grosse F. DNA polymerase α-primase from calf thymus〔J〕.J Biol Chem,1988,263： 8981.
5 Sheaff RJ,Kuchta RD, IlsLey D. Calf thymus DNA polymerase α-primase：“ communication” and primer template movement between the two activesites〔J〕.Biochemistry,1994,33：2247.
6 朱孝峰，刘宗潮，谢冰芬，等.DNA引物酶的提取分离与引物合成活性研究〔J〕.中山医科大学学报，1997，18(4)：279.
7 Longhese MP, Paciotti V, Fraschini R, et al. The novel DNA damage checkpoint protein ddc1p is phosphorylated periodically during the cell cycle and in response to DNA damage in budding yeast〔J〕. EMBO-J,1997,16(17)：5216.
收稿日期：1998-10-19；修回日期：1999-01-19, 百拇医药
单位：中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室(广州，510060)
关键词：DNA引物酶；抑制剂；药物筛选
New Page 1
【摘要】目的：建立DNA引物酶抑制剂的筛选方法，并应用于大量筛选，找出对DNA引物酶有抑制作用的抗癌药物或先导化合物。方法：以小鼠艾氏腹水癌细胞破碎液为材料，过DE-52和P-11层析柱，提取分离DNA引物酶，用大肠杆菌大片段DNA多聚酶Ⅰ延长引物法检测DNA引物酶的活性。并在此反应液中加入化合物检测对DNA引物酶活性的抑制作用，以激活的小牛胸腺DNA为模板排除化合物对大片断DNA多聚酶Ⅰ的抑制作用。结果：部分纯化的DNA引物酶比活性为8753U/mg，酶的总获得率为22.1%。在100μg/ml浓度下，氯霉素和鞘氨醇对DNA引物酶活性抑制率分另为71.2%±3.7%和83.0%±5.4%。结论：该方法已经建立，大量筛选发现非抗癌药物的氯霉素和鞘氨醇两种化合物对DNA引物酶活性有抑制作用。临床常用的抗癌药物未发现对此酶活性有抑制作用。
, http://www.100md.com
中图号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0292-03
The establishment of a screening method of DNA primase inhibitors
ZHU Xiao-feng，LIU Zoug-chao，XIE Bin-feng，et al
Department of Therapeutic Basis Cancer Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,China
【Abstract】Objective：To establish the screening method of DNA primase inhibitors.The leading compouds of inhibiting DNA primase activity were found through this method.Methods：DNA primase was extracted from mouse EAC cells, then was partially purified and identified.Its activity was assayed using indirect method, namely poly〔dT〕,ATP,3H-dATP as substrate,and 0.2u E.coli.DNA polymerase ⅠKlenow fragment was added to the reaction mixture.The inhibitory effects of the drugs on DNA primase activity were assayed.Results：The effect of drugs on DNA primase activity were studied.Under the concentration of 100 μ g/ml ,inhibitory rate of chloramphenicol and sphingosine were 70.5%± 2.7% and 83.0%±5.4%.However,all the conventional antitumor agents showed no inhibitory effect.Conclusion：1.The screening method of DNA primase inhibitors was established.2. Chloramphenicol and sphingosine have inhibitory effect on primase activity.
, 百拇医药
Key words：DNA primase;Inhibitor;Screening
DNA引物酶是存在于细胞核中，由48KD、58KD两个亚基组成，其中48KD亚基是引物酶活性所在，而58KD亚基可能是起着与DNA结合的作用〔1〕。DNA引物酶的功能是在DNA复制时完成引物的合成，从而启动DNA的复制的作用，该酶在DNA复制中起着十分重要的作用〔2〕。肿瘤细胞的DNA复制活跃，此酶的活性高于正常细胞6倍之多〔3〕。抑制DNA引物酶即抑制了引物的合成，DNA的合成就会受到抑制，肿瘤细胞不能繁殖，因此可能达到抗瘤作用〔4〕。本文建立了一个快速而可用于大规模筛选的方法，并用此法筛选了临床常用的抗癌药物和一些其它化合物。
1 材料与方法
1.1 实验材料
, 百拇医药
昆明种小白鼠购自中山医科大学实验动物中心，小鼠艾氏腹水癌瘤株由本实验室提供。Poly(dT)为Sigma公司，DDT为Promeger公司产品，磷酸纤维素柱(Phosphocellulose 11,P-11)为Whatman公司产品。DEAE-cellulose(DE-52),SERVA公司产品。3H-dATP、苯甲磺胺氟(PMSF)、乙酸纤维素薄膜等均为国内购买。大肠杆菌DNA多聚酶I大片段为Promega产品。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA引物酶的提取：取接种7～9d艾氏腹水癌细胞的小鼠腹水，4000r/min离心(转子半径11cm)，再用磷酸缓冲液洗涤后4000r/min离心(转子半径11cm)。以下步骤在4℃下进行，取细胞5g加30ml缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl,pH=7.5,1mmol/L DTT,0.1mmol/L EDTA,0.1mmol/L PMSF)，混匀后超声破碎癌细胞(超声作用每次30s，停1min，共5次，功率为145W)，镜检罕见完整细胞为准。匀浆18000r/min离心(转子半径11cm)30min，收集上清液加到预先用bufferB(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,20mmol/L KCl,0.1mmol/L EDTA,20%甘油)平衡过的DEAE-cellulose(ED-52)柱(35ml)用70mLbufferB洗之。再用25mlbufferB和25mlbufferC(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,300mmol/LKCl,0.1mmol/LEDTA,20%甘油)线性梯度洗脱，检测DNA引物酶的活性后取少量酶液真空浓缩，检测蛋白含量，收集酶活性部分，加入预先用bufferD(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,150mmol/LKCl,1mmol/LDTT,30%甘油)平衡过的P-11柱(25ml)中，用50mlbufferD洗之，再用10mlbufferD和10mlBufferE(50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,400mmol/LKCl,1mmol/LDTT,30%甘油)作线性梯度洗脱，检测酶活性，收集有酶活性的部分，保存在-80℃下备用。
, 百拇医药
1.2.2 酶活性的测定：反应液(30μl)含有50mmol/LTris-HCl,pH=7.2,0.1%PEG6000，0.1mg/mlBSA,3mmol/LDTT,6mmol/LMgCl2,33μg/mlpoly(dT),2mmol/LATP,0.25μmol/L3H-dATP,10%甘油，3μl酶液，0.2U大肠杆菌大片断DNA多聚酶Ⅰ，37℃保温30min后，加入EDTA至10mmol/L终止反应，移至乙酸纤维薄膜上，晾干后，除1管不漂洗用于测定总CPM数外，其它均用5%三氯醋酸漂洗3min×2次，95%乙醇漂洗2min×2次，晾干后，放入含有4ml闪烁液的测定瓶中，在LKB液体闪烁计数仪中检测CPM。以每聚合1pmoldATP为一个酶活性单位。
1.2.3 DNA引物酶活性的抑制实验：在酶活性反应液中加入一定浓度的待测的化合物样品，设一个无药对照，每个样品均设2个平行管，每种药物做3批重复实验，其他实验步骤基本与酶活性测定相同，分别计算抑制率。
, http://www.100md.com
2 实验结果
2.1 DNA引物酶的分离提取
通过DE52柱和P-11柱后，提取DNA引物酶，酶的总活性获得率为22%，酶的比活性从粗酶液的39.6U/mg蛋白到部纯分化酶液的8753U/mg蛋白(见表1)。
表1 DNA引物酶的分离提取
项目
体积(ml)
总蛋白(mg)
总活性(U)
比活性(U/mg蛋白)
收得率(%)
, http://www.100md.com
Crude
30
150
3960
39.6
100
DE52
8
1.6
1655
1034.4
41.8
P-11
, 百拇医药
3
0.15
902
8753
22.1
2.2 DNA引物酶活性的抑制实验
化合物的浓度均取100μg/ml，发现氯霉素和鞘氨醇对DNA引物酶活性有明显的抑制作用，抑制率分别为71.2%±3.7%和83%±5.4%，而临床常用的抗癌药物阿霉素、米托蒽醌、氨甲喋呤、环磷酰胺、顺氯氨铂、长春新碱、噻替哌、甲基苄肼、表阿霉素、氮芥等对DNA引物酶活性均无抑制作用。用激活的小牛胸腺DNA为模板检测发现氯霉素和鞘氨醇对大片段DNA多聚酶Ⅰ均无抑制作用。
3 讨论
, http://www.100md.com
DNA的复制是肿瘤细胞增殖的关键，DNA复制首先是解旋，随后由DNA引物酶结合于DNA单链上，并在其上滑动，寻找复制起始点，合成一长7～10个核苷酸的RNA引物，随后由多聚酶α聚合dNTP完成引物的延长〔5〕。DNA引物酶只参与DNA复制的起始引物的合成，不象DNA多聚酶不仅参与DNA的复制而且还参与DNA的修复，所以抑制DNA引物酶活性的药物可能有着更小的副作用；而DNA引物酶活性直接检测需要用32P-ATP作底物，聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影〔6〕，此法不可能用于大量的药物筛选中。本实验根据DNA引物酶合成引物后，DNA多聚酶延长引物这一特性，建立DNA引物酶抑制剂的筛选方法。但是现有的抗癌药物均在本试验上不呈现抑制作用，所以本法能否用于筛选抗癌药物尚未肯定，或仅适用于某种结构的抗癌药物的筛选，亦未可知。但另一种可能性为目前常用的抗癌药物中还没有通过抑制DNA引物酶活性而达到抗瘤作用的，DNA引物酶抑制剂有可能是一类新作用机理的抗癌药物，因为Longhese〔7〕用基因工程方法使细胞中的DNA引物酶产生无活性突变后，细胞无法存活，表明抑制DNA引物酶活性可以抑制细胞生长。用本实验建立的方法对大量的化合物进行了筛选，发现氯霉素和鞘氨醇两种化合物对DNA引物酶有抑制作用，这两种化合物本身无抗瘤作用，可能是因为抑制DNA引物酶活性不够强或其它原因以致在细胞中不能很地抑制DNA引物酶活性，但此两种化合物在结构上有一定的共同之处。我们准备根据此两种化合物的结构以及DNA引物酶的氨基酸序列、活性中心的结构，设计一系列化合物进行筛选，找出一个抑制作用更强且可应用为抗癌药物的DNA引物酶抑制剂。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助(No：39370800；39870886)
参考文献
1 Kuchta RD, Reid B, Chang LM. DNA primase processivity and the primase to polymerase α activity switch〔J〕.J Biol Chem,1990, 265：16158.
2 Catapano CV, Perrino FW,Fernandes DJ.Primase RNA chain termination Induced by 9-β-D arabinofuranosyladenosine triphosphate〔J〕. J Biol Chem,1993,268：7179.
3 Kuchta Rd,IlsLey D,Kravig KD. Inhibition of DNA primase and polymerase alpha by arabinofuranosylnucleoside triphosphates and related compounds 〔J〕. Biochem,1992,31：4720.
, 百拇医药
4 Nasheuer HP, Grosse F. DNA polymerase α-primase from calf thymus〔J〕.J Biol Chem,1988,263： 8981.
5 Sheaff RJ,Kuchta RD, IlsLey D. Calf thymus DNA polymerase α-primase：“ communication” and primer template movement between the two activesites〔J〕.Biochemistry,1994,33：2247.
6 朱孝峰，刘宗潮，谢冰芬，等.DNA引物酶的提取分离与引物合成活性研究〔J〕.中山医科大学学报，1997，18(4)：279.
7 Longhese MP, Paciotti V, Fraschini R, et al. The novel DNA damage checkpoint protein ddc1p is phosphorylated periodically during the cell cycle and in response to DNA damage in budding yeast〔J〕. EMBO-J,1997,16(17)：5216.
收稿日期：1998-10-19；修回日期：1999-01-19, 百拇医药