环磷酰胺治疗小鼠S180肉瘤的体内31P磁共振波谱研究
作者：田建广 魏昌华 冯锐 李光玉 茹祥斌 杜泽涵
单位：田建广 冯锐 李光玉 杜泽涵(军事医学科学院国家生物医学分析中心(北京 100850))；魏昌华 茹祥斌(军事医学科学院毒物药物研究所)；杜泽涵(通讯作者)
关键词：环磷酰胺；S180肉瘤；表面线圈；31PMRS；小鼠
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【摘要】目的：观察环磷酰胺治疗小鼠S180肉瘤的31PMRS参数变化，以及这些参数的变化是否早于常规观察的瘤体积的变化。方法：利用表面线圈31PNMR方法，并研究小鼠皮下接种S180肉瘤的体积。结果：对照组的PCr/Pi和β-NTP/Pi比值降低，而环磷酰胺给药组升高，且给药后24、48、72h时显著高于对照组(P<0.05)。对照组的PME/β-NTP比值继续升高，而给药组PME/β-NTP比值在给药后24h、48h、72h时均显著低于对照组(P<0.05)。因此，对照组和给药组的PCr/Pi、PME/β-NTP、β-NTP/Pi比值在给药后24h时基本已具有显著性差别，这3个参数的变化均早于肿瘤体积的变化。结论：小鼠S180肉瘤的31PMRS不仅可以给出定量的结果，而且可以较早地显示出治疗的效果。
, 百拇医药
中图号：R730.4 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0285-03
In vivo studies of cyclophosphamide chemotherapy on mouse S180
sarcoma by 31P magnetic resonance spectroscopy
TIAN Jian-guang1，WEI Chang-hua2，FENG Rui1,et al
1 National Center for Biomedical Analysis,2 Instiute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Sciences,Beijing 100850, China
, 百拇医药
【Abstract】Objective：To investigate the effect of cyclophosphamide (CTX) on the metabolic profile of mouse S180 sarcoma and whether the changes of 31P MRS parameters is earlier than the changes of tumor volume.Methods：Murine S180 sarcoma (s.c.) was studied by using surface-coil 31P NMR.Results：Twenty-four hours after cyclophosphamide treatment,PCr/Pi and β-NTP/Pi ratios of CTX treated groups increased significantly relative to control (P<0.05).PME/β-NTP ratio of CTX treated groups was lower than those of control (P< 0.05). The tumor volume between treated groups and control group showed no significant difference before 72h aflter treatment.Conclusions：31P MRS of mouse S180 sarcoma could not only provide quantitative information,but also show earlier response to therapy than the change of tumor volume.
, http://www.100md.com
Key words：Cyclophosphamide;Mouse S180 sarcoma;Surface-coil;31P MRS
目前对肿瘤患者治疗后的效果通常利用磁共振成像(MRI)和CT技术进行判断，判断治疗是否出现显著性效果往往需要数星期。若能寻求一种能及早、准确地判断的方法，可为及时调整治疗方案，挽救患者生命争取时间。磁共振波谱(MRS)是一种无损伤的测试技术，31P MRS已用于实验肿瘤模型和临床，有希望成为早期判断肿瘤治疗效果的工具之一〔1-3〕。本文利用表面线圈31P NMR技术研究皮下接种S180肉瘤的小鼠接受环磷酰胺治疗后31PMRS参数的变化。
1 实验材料方法
1.1 仪器
日本JEOL公司的JNMGX400型超导核磁共振仪。
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1.2 探头
自制31PNMR表面线圈探头〔4〕，平面环形线圈2匝，由直径为1.5mm的铜漆包线绕成，内径为9.5mm。
1.3 药物
15%噻胺酮注射液(军事医学科学院毒物药物研究所产)，小鼠的麻醉剂量为40mg/kg，腹腔注射0.1ml/10g体重。环磷酰胺(CTX，上海第十二制药厂产)，腹腔给药，分150mg/kg和250mg/kg两个剂量组；对照组给予生理盐水。
1.4 动物
昆明种小鼠，雌性，体重20±2g，军事医学科学院动物中心繁殖(动物合格证号：军医动字第BDW95007号，一级)。S180腹水瘤种鼠，在无菌条件下，抽取腹水，用灭菌生理盐水稀释后，每只小鼠右腋皮下接种106细胞。接种后第7天时，肿瘤生长体积可达800mm3左右，肿瘤大小用卡尺测量[V=0.52×(a×b2)，a为肿瘤长径，b为与a垂直的肿瘤短径，于第7天开始测量。其中对照组小鼠11只，CTX150mg/kg组小鼠9只，CTX250mg/kg组小鼠11只。
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1.5 31PNMR测定
共振频率161.83MHz，谱宽10kHz，脉冲宽度10μs(线圈中心90脉冲宽度)，脉冲间隔0.5s，扫描次数250，单脉冲序列采样，傅立叶变换前加指数窗函数(增宽因子40Hz)和梯形窗函数(T1，0.00，T2，0.05，T3，90.0，T4，100)。由于动物放置以及肿瘤和线圈的相对位置不易重复，所以用相对比值定量，本文用峰高比值计算〔5〕。ATP的变化以β-NTP为基准。
1.6 数据处理
利用SAS软件的一元方差分析方法比较各组谱图参数间的差异。
2 结果
2.1 鼠S180内瘤的31P MRS
, 百拇医药
图1为一张典型的鼠S180肉瘤的31P MRS。谱图中有7个共振峰，分别为磷酸单酯(PME)、无机磷(Pi)、磷酸双酯(PDE)、磷酸肌酸(PCr)和核苷三磷酸(NTP)的三个磷原子(γ-NTP，α-NTP，β-NTP)。这7个共振峰可分成2组，一组与生物能态有关，另一组与膜代谢有关。PME主要包括磷酸胆碱(PC)和磷酸胆胺(PE)，是磷脂类合成的前体。PDE主要包括甘油磷酸胆碱(GPC)和甘油磷酸胆胺(GPE)，是磷脂类的降解产物。
图1 小鼠S180肉瘤的31P MRS
谱峰归属：1PME，2pi,3PDE,4PCr,5γ-NTP,6α-NTP,7β-NTP
, 百拇医药
2.2 肿瘤体积的变化
对照组和给药组的肿瘤体积在给药前无显著性差别，在给药后72h时，150mg/kg组的肿瘤体积显著小于对照组(P<0.05)，250mg/kg组的肿瘤体积虽小于对照组，但无显著性差异(见表1)。
表1 对照组和环磷酰胺给药组小鼠S180肉瘤体积(mm3)的变化
组别
n
给药后
给药前
24h
48h
72h
, http://www.100md.com
N.S
11
726±136
795±147
911±180
1145±213
CTX150mg/kg组
9
756±162
756±162
791±220
733±159*
, http://www.100md.com
CTX250mg/kg组
11
853±93
841±88
911±201
971±323
*表示与对照组有显著性差别(P<0.05)，n为动物数
2.3 31PMRS参数的变化
由于动物之间的个体差异，给药前各动物肿瘤的31P MRS参数有一定的波动性，为此要将各动物的数据进行归一化，即定义给药前各动物肿瘤31P MRS参数比值为1.0。从表2和图2可以看到：(1)对照组的PCr/Pi比值降低，而环磷酰胺给药组升高，且给药后24h时，250mg/kg组的PCr/Pi比值已显著高于对照组(P<0.05)；150mg/kg组的PCr/Pi比值虽高于对照组但差别不显著。给药组在药后48h、72h时均显著高于对照组；(2)对照组的PME/β-NTP比值继续升高，而给药组PME/β-NTP比值逐渐降低。给药后24h、48h、72h时，给药组均显著低于对照组(P<0.05)；(3)与PCr/Pi比值变化一样，给药后β-NTP/Pi比值升高。给药后24h、48h、72h时，给药组显著高于对照组(P<0.05)。
, 百拇医药
图2 受治疗和未治疗小鼠肿瘤31P MRS参数比值的变化，*与对照组比较有显著性差别(P<0.05)
表2 环磷酰胺治疗小鼠S180肉瘤31P MRS参数的变化
组别
给药前
给药后
24h
48h
72h
PCr/Pi
对照组
1
, http://www.100md.com
0.7112±0.1575
0.5069±0.2245
0.4293±0.1726
150mg/kg组
1
1.0630±0.5178
1.1108±0.6733*
1.9591±0.5026*
250mg/kg组
1
2.2504±0.2480*
, 百拇医药
2.1217±0.5139*
2.1090±0.5102*
PME/β-NTP
对照组
1
3.4892±0.4072
3.8405±0.7309
3.2443±0.7689
150mg/kg组
1
4.9523±0.1613*
, 百拇医药
4.9483±0.3633*
4.0972±0.4580*
250mg/kg组
1
5.0102±0.1426*
5.9014±0.300*2
5.8838±0.3092*
β-NTP/Pi
对照组
1
6.6871±0.2021
, 百拇医药
6.5555±0.2838
6.4201±0.2171
150mg/kg组
1
1.0269±0.3499*
1.1342±0.4330*
0.9802±0.3536*
250mg/kg组
1
1.0267±0.1740*
1.2859±0.7256*
, 百拇医药
1.1691±0.3922*
*表示与对照组有显著性差别(P<0.05)
3 讨论
PCr/Pi和β-NTP/Pi比值的变化可以反映肿瘤生物能态的变化。从上面的实验结果可以看到肿瘤经治疗后PCr/Pi和β-NTP/Pi比值升高，即肿瘤生物能态改善，而这种改善与肿瘤的血流量改善〔6〕和氧供应改善〔7〕有关。肿瘤细胞经处理后部分被杀死，产生炎症的反应，吸引巨噬细胞到肿瘤，从而正常细胞部分在谱图中的贡献增加；肿瘤中细胞被杀死，从而对氧和养分的竞争减少，低能量细胞被优先杀死或静息期细胞复苏成为代谢活跃细胞都会增加高能量状态细胞的比例；杀死细胞可使肿瘤的细胞密度降低，降低肿瘤内的静水压从而改善血流量。
磷脂类代谢物浓度的变化可能与膜更新代谢变化(膜受损或细胞增殖受抑制)有关。大多数肿瘤模型和人肿瘤的PME升高，因而认为PME升高与细胞增殖有关。PME峰分为PC和PME’(主要是PE)两种成分，肿瘤接受治疗后PE/PC升高，其中主要是PE升高而不是PC降低，而静息期细胞的PE高，增殖细胞的PC高，因此静息期细胞比例升高〔8，9〕。很多研究表明肿瘤接受治疗后出现PME/β-NTP比值降低〔10〕。实验结果表明使用环磷酰胺治疗24h后PME/β-NTP比值就已显著降低。
, http://www.100md.com
从上可见，对照组和给药组的PCr/Pi、PME/β-NTP、β-NTP/Pi比值在给药后24h时基本已具有显著性差别。这3个参数的变化均早于肿瘤体积的变化，说明肿瘤的31P MRS能较早达到反映出治疗的效果。
参考文献
1 Negendank W.Studies of human tumors by MRS：a review. NMR Biomed,1992,5：303.
2 De Certaines JD, Larsen VA, Podo F, et al. In vivo 31P MRS of experimental tumors〔J〕. NMR Biomed,1993,6：345.
3 Leach MO. Introduction to in vivo MRS of cancer：new perspectives and open problems〔J〕 .Anticancer Res,1996,16：1503.
, 百拇医药
4 颜贤忠，李桦，冯锐，等.活体动物代谢过程的31P NMR研究：方法与初步结果〔J〕.波谱学杂志，1994，11(3)：257.
5 Allavena C, Guerquin-Kern JL, Lhoste JM. Follow-up by 31P NMR spectroscopy of the energy metabolism of malignant tumor in rats during treatment〔J〕. Radiother Oncol, 1991,21：48.
6 Braunschweiger PG. Effect of cyclophosphamide on the pathophysiology of RIF-1 solid tumors〔J〕.Cancer Res,1988,48： 4206.
7 Tozer GM,Griffiths JR. The contribution made by cell death and oxygenation to 31P MRS observations of tumour energy metabolism〔J〕.NMR Biomed,1992,5：279.
, 百拇医药
8 Street JC, Mahmood U,Matei C, et al. In vivo and in vitro studies of cyclophosphamide chemotherapy in a mouse mammary carcinoma by 31P NMR spectroscopy 〔J〕.NMR Biomed,1995,8：149.
9 Aiken NR,Gillies RJ. Phosphomonoester metabolism as a function of cell prolifeative status and exogenous precursors〔J〕. Anticancer Res,1996 16：1393.
10 Redmond OM, Stack JP, O'Connor NG, et al.31P MRS as an early prognostic indicator of patient response to chemotherapy〔J〕.Magn Reson Med,1992,25：30.
收稿日期：1998-08-17；修回日期：1998-10-06, 百拇医药
单位：田建广 冯锐 李光玉 杜泽涵(军事医学科学院国家生物医学分析中心(北京 100850))；魏昌华 茹祥斌(军事医学科学院毒物药物研究所)；杜泽涵(通讯作者)
关键词：环磷酰胺；S180肉瘤；表面线圈；31PMRS；小鼠
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【摘要】目的：观察环磷酰胺治疗小鼠S180肉瘤的31PMRS参数变化，以及这些参数的变化是否早于常规观察的瘤体积的变化。方法：利用表面线圈31PNMR方法，并研究小鼠皮下接种S180肉瘤的体积。结果：对照组的PCr/Pi和β-NTP/Pi比值降低，而环磷酰胺给药组升高，且给药后24、48、72h时显著高于对照组(P<0.05)。对照组的PME/β-NTP比值继续升高，而给药组PME/β-NTP比值在给药后24h、48h、72h时均显著低于对照组(P<0.05)。因此，对照组和给药组的PCr/Pi、PME/β-NTP、β-NTP/Pi比值在给药后24h时基本已具有显著性差别，这3个参数的变化均早于肿瘤体积的变化。结论：小鼠S180肉瘤的31PMRS不仅可以给出定量的结果，而且可以较早地显示出治疗的效果。
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中图号：R730.4 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0285-03
In vivo studies of cyclophosphamide chemotherapy on mouse S180
sarcoma by 31P magnetic resonance spectroscopy
TIAN Jian-guang1，WEI Chang-hua2，FENG Rui1,et al
1 National Center for Biomedical Analysis,2 Instiute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Sciences,Beijing 100850, China
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【Abstract】Objective：To investigate the effect of cyclophosphamide (CTX) on the metabolic profile of mouse S180 sarcoma and whether the changes of 31P MRS parameters is earlier than the changes of tumor volume.Methods：Murine S180 sarcoma (s.c.) was studied by using surface-coil 31P NMR.Results：Twenty-four hours after cyclophosphamide treatment,PCr/Pi and β-NTP/Pi ratios of CTX treated groups increased significantly relative to control (P<0.05).PME/β-NTP ratio of CTX treated groups was lower than those of control (P< 0.05). The tumor volume between treated groups and control group showed no significant difference before 72h aflter treatment.Conclusions：31P MRS of mouse S180 sarcoma could not only provide quantitative information,but also show earlier response to therapy than the change of tumor volume.
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Key words：Cyclophosphamide;Mouse S180 sarcoma;Surface-coil;31P MRS
目前对肿瘤患者治疗后的效果通常利用磁共振成像(MRI)和CT技术进行判断，判断治疗是否出现显著性效果往往需要数星期。若能寻求一种能及早、准确地判断的方法，可为及时调整治疗方案，挽救患者生命争取时间。磁共振波谱(MRS)是一种无损伤的测试技术，31P MRS已用于实验肿瘤模型和临床，有希望成为早期判断肿瘤治疗效果的工具之一〔1-3〕。本文利用表面线圈31P NMR技术研究皮下接种S180肉瘤的小鼠接受环磷酰胺治疗后31PMRS参数的变化。
1 实验材料方法
1.1 仪器
日本JEOL公司的JNMGX400型超导核磁共振仪。
, http://www.100md.com
1.2 探头
自制31PNMR表面线圈探头〔4〕，平面环形线圈2匝，由直径为1.5mm的铜漆包线绕成，内径为9.5mm。
1.3 药物
15%噻胺酮注射液(军事医学科学院毒物药物研究所产)，小鼠的麻醉剂量为40mg/kg，腹腔注射0.1ml/10g体重。环磷酰胺(CTX，上海第十二制药厂产)，腹腔给药，分150mg/kg和250mg/kg两个剂量组；对照组给予生理盐水。
1.4 动物
昆明种小鼠，雌性，体重20±2g，军事医学科学院动物中心繁殖(动物合格证号：军医动字第BDW95007号，一级)。S180腹水瘤种鼠，在无菌条件下，抽取腹水，用灭菌生理盐水稀释后，每只小鼠右腋皮下接种106细胞。接种后第7天时，肿瘤生长体积可达800mm3左右，肿瘤大小用卡尺测量[V=0.52×(a×b2)，a为肿瘤长径，b为与a垂直的肿瘤短径，于第7天开始测量。其中对照组小鼠11只，CTX150mg/kg组小鼠9只，CTX250mg/kg组小鼠11只。
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1.5 31PNMR测定
共振频率161.83MHz，谱宽10kHz，脉冲宽度10μs(线圈中心90脉冲宽度)，脉冲间隔0.5s，扫描次数250，单脉冲序列采样，傅立叶变换前加指数窗函数(增宽因子40Hz)和梯形窗函数(T1，0.00，T2，0.05，T3，90.0，T4，100)。由于动物放置以及肿瘤和线圈的相对位置不易重复，所以用相对比值定量，本文用峰高比值计算〔5〕。ATP的变化以β-NTP为基准。
1.6 数据处理
利用SAS软件的一元方差分析方法比较各组谱图参数间的差异。
2 结果
2.1 鼠S180内瘤的31P MRS
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图1为一张典型的鼠S180肉瘤的31P MRS。谱图中有7个共振峰，分别为磷酸单酯(PME)、无机磷(Pi)、磷酸双酯(PDE)、磷酸肌酸(PCr)和核苷三磷酸(NTP)的三个磷原子(γ-NTP，α-NTP，β-NTP)。这7个共振峰可分成2组，一组与生物能态有关，另一组与膜代谢有关。PME主要包括磷酸胆碱(PC)和磷酸胆胺(PE)，是磷脂类合成的前体。PDE主要包括甘油磷酸胆碱(GPC)和甘油磷酸胆胺(GPE)，是磷脂类的降解产物。
图1 小鼠S180肉瘤的31P MRS
谱峰归属：1PME，2pi,3PDE,4PCr,5γ-NTP,6α-NTP,7β-NTP
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2.2 肿瘤体积的变化
对照组和给药组的肿瘤体积在给药前无显著性差别，在给药后72h时，150mg/kg组的肿瘤体积显著小于对照组(P<0.05)，250mg/kg组的肿瘤体积虽小于对照组，但无显著性差异(见表1)。
表1 对照组和环磷酰胺给药组小鼠S180肉瘤体积(mm3)的变化
组别
n
给药后
给药前
24h
48h
72h
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N.S
11
726±136
795±147
911±180
1145±213
CTX150mg/kg组
9
756±162
756±162
791±220
733±159*
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CTX250mg/kg组
11
853±93
841±88
911±201
971±323
*表示与对照组有显著性差别(P<0.05)，n为动物数
2.3 31PMRS参数的变化
由于动物之间的个体差异，给药前各动物肿瘤的31P MRS参数有一定的波动性，为此要将各动物的数据进行归一化，即定义给药前各动物肿瘤31P MRS参数比值为1.0。从表2和图2可以看到：(1)对照组的PCr/Pi比值降低，而环磷酰胺给药组升高，且给药后24h时，250mg/kg组的PCr/Pi比值已显著高于对照组(P<0.05)；150mg/kg组的PCr/Pi比值虽高于对照组但差别不显著。给药组在药后48h、72h时均显著高于对照组；(2)对照组的PME/β-NTP比值继续升高，而给药组PME/β-NTP比值逐渐降低。给药后24h、48h、72h时，给药组均显著低于对照组(P<0.05)；(3)与PCr/Pi比值变化一样，给药后β-NTP/Pi比值升高。给药后24h、48h、72h时，给药组显著高于对照组(P<0.05)。
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图2 受治疗和未治疗小鼠肿瘤31P MRS参数比值的变化，*与对照组比较有显著性差别(P<0.05)
表2 环磷酰胺治疗小鼠S180肉瘤31P MRS参数的变化
组别
给药前
给药后
24h
48h
72h
PCr/Pi
对照组
1
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0.7112±0.1575
0.5069±0.2245
0.4293±0.1726
150mg/kg组
1
1.0630±0.5178
1.1108±0.6733*
1.9591±0.5026*
250mg/kg组
1
2.2504±0.2480*
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2.1217±0.5139*
2.1090±0.5102*
PME/β-NTP
对照组
1
3.4892±0.4072
3.8405±0.7309
3.2443±0.7689
150mg/kg组
1
4.9523±0.1613*
, 百拇医药
4.9483±0.3633*
4.0972±0.4580*
250mg/kg组
1
5.0102±0.1426*
5.9014±0.300*2
5.8838±0.3092*
β-NTP/Pi
对照组
1
6.6871±0.2021
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6.5555±0.2838
6.4201±0.2171
150mg/kg组
1
1.0269±0.3499*
1.1342±0.4330*
0.9802±0.3536*
250mg/kg组
1
1.0267±0.1740*
1.2859±0.7256*
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1.1691±0.3922*
*表示与对照组有显著性差别(P<0.05)
3 讨论
PCr/Pi和β-NTP/Pi比值的变化可以反映肿瘤生物能态的变化。从上面的实验结果可以看到肿瘤经治疗后PCr/Pi和β-NTP/Pi比值升高，即肿瘤生物能态改善，而这种改善与肿瘤的血流量改善〔6〕和氧供应改善〔7〕有关。肿瘤细胞经处理后部分被杀死，产生炎症的反应，吸引巨噬细胞到肿瘤，从而正常细胞部分在谱图中的贡献增加；肿瘤中细胞被杀死，从而对氧和养分的竞争减少，低能量细胞被优先杀死或静息期细胞复苏成为代谢活跃细胞都会增加高能量状态细胞的比例；杀死细胞可使肿瘤的细胞密度降低，降低肿瘤内的静水压从而改善血流量。
磷脂类代谢物浓度的变化可能与膜更新代谢变化(膜受损或细胞增殖受抑制)有关。大多数肿瘤模型和人肿瘤的PME升高，因而认为PME升高与细胞增殖有关。PME峰分为PC和PME’(主要是PE)两种成分，肿瘤接受治疗后PE/PC升高，其中主要是PE升高而不是PC降低，而静息期细胞的PE高，增殖细胞的PC高，因此静息期细胞比例升高〔8，9〕。很多研究表明肿瘤接受治疗后出现PME/β-NTP比值降低〔10〕。实验结果表明使用环磷酰胺治疗24h后PME/β-NTP比值就已显著降低。
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从上可见，对照组和给药组的PCr/Pi、PME/β-NTP、β-NTP/Pi比值在给药后24h时基本已具有显著性差别。这3个参数的变化均早于肿瘤体积的变化，说明肿瘤的31P MRS能较早达到反映出治疗的效果。
参考文献
1 Negendank W.Studies of human tumors by MRS：a review. NMR Biomed,1992,5：303.
2 De Certaines JD, Larsen VA, Podo F, et al. In vivo 31P MRS of experimental tumors〔J〕. NMR Biomed,1993,6：345.
3 Leach MO. Introduction to in vivo MRS of cancer：new perspectives and open problems〔J〕 .Anticancer Res,1996,16：1503.
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收稿日期：1998-08-17；修回日期：1998-10-06, 百拇医药