阿霉素化疗与热化疗对兔毛细胞白血病VX－2细胞体外作用的比较
作者：张洪新 王执民 郭卫平 王义清 吴智群 李文献 陈江浩 关 燕
单位：第四军医大学唐都医院介入放射科(西安，710038)
关键词：阿霉素；热化疗；VX-2
癌症990312
【摘要】目的：观察比较热疗、化疗、热化疗对体外兔VX-2细胞的生长抑制规律的影响，为临床介入性热化疗提供实验数据。方法：以体外长期培养的兔VX-2细胞为靶细胞，采用水浴加温法、进行体外细胞毒试验(MTT法)，观察单纯热疗，单纯化疗及热疗与化疗结合对兔VX-2细胞的生长抑制规律的影响及差别。结果：(1)温热和阿霉素对VX-2均有一定的抑制和杀伤作用，两者一定方式的联合具有协同或相加作用；(2)热化疗加热温度以42～43℃为佳，加热时间以30分钟以上为佳。结论：(1)热对化疗有增敏作用；(2)一定温度的热化疗优于单纯热疗和单纯化疗。
, 百拇医药
中图号：R7357 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0276-03
Synergistic effect of combined use of hyperthermia and
adriamycin (ADM) on rabbit hairy cell line VX-2
ZHANG Hong-xin WANG Zhi-min GUO Wei-ping,et al
Department of Interventional Radiology,Tangdu Hospital,Fourth
Military Medical University, Xian 710038,China
, 百拇医药
【Abstract】 Objective：To observe the inhibition of cell growth of VX-2 with MTT assay under water-heating with ADM.Method：The hare leukemia VX-2 cell line was used in this study.The inhibiton of cell growth was observed with MTT assay under water-heating with ADM.Results：1.Both hyperthermia and ADM can inhibit or kill the VX-2 cells directly.The combination use of hyperthermia and ADM shows evidence of synergistic or additional effect.2.The optimal temperature and time of hyperthermia are 42～ 43 ℃ and 30 minutes. Conclusions：1.Hyperthermia enhanced the efficacy of chemotherapy,2.Hyperthermia of definite temperature showed better effect than those of heat or chemotherapy alone.
, 百拇医药
Key words：Adriamycin(ADM);Thermochemotherapy;Hare cell line;VX-2
热疗对肿瘤的抑制效应已广为接受，成为肿瘤治疗的一种方法[1]。热疗一般采用射频方式，操作复杂，加热时间长，病人难以接受而限制了应用。由于介入放射医学的发展，使解决这个问题成为可能，即通过导管将一定温度的热盐水或热的化疗药物注入局部肿瘤病灶，可以称之为介入性热化疗。为了制定安全合理的介入性热化疗方案，我们采用MTT比色法，研究了临床常用的阿霉素(ADM)与热疗结合对兔VX-2作用的最佳温度，最佳加热时间，及最佳组合方式，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
兔VX-2由本校实验动物中心提供，按常规方法培养于含10%小牛血清的RPMI-1640全培养液中(含青霉素PC)100U/ml，链霉素(SM)100μg/ml)，单层培养于37℃CO2恒温孵育箱内，用接种传代第3天的细胞(处于对数生长期)做实验。
, 百拇医药
1.2 加热处理
设37℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃等6个温度点。采用水浴加热法，(数字式恒温浴槽，温度波动≤±01℃)，将培养瓶浸没于水中，加热时间设0，15，30，60分钟共4组。
1.3 药物处理
阿霉素(ADM，FarmitaliaCarloErba)，设0，1，2，4，8，16，32，64μg/ml等共8组，用微量进样器加药。
1.4 热药顺序
先化后热(先化疗1小时再热疗)，热化同时(加热同时加药化疗1小时)，先热后化(先加热后化疗1小时)
1.5 实验分组设计
按不同温度、不同加热时间、不同热化顺序和不同药物浓度4个因素设计，即组内分组设计，化疗时间统一为1小时，将实验处理过的细胞消化成细胞悬液(5×105个细胞/ml)接种到96孔板上，设3个复孔，每孔200μl(1×105个细胞/ml)，以未经处理的细胞为阴性对照，以不含细胞的1640全培养液为空白对照，常规法孵育24小时后每孔加入MTT50μl，继续培养4～6小时，去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔，充分振荡5分钟，上酶联免疫检测仪，测定波长490nm每孔的光密度值(A值)，计算细胞毒指数(CI)公式：
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CI值=(1-实验孔的平均OD值/阴性对照孔的平均OD值)×100%
1.6 统计学处理
采用方差分析，Q检验。
2 结果
2.1 单纯热疗的细胞毒作用
42℃30min以下较弱；43℃30min以上较强；超过44℃CI值接近100%；低于41℃30min同37℃没有明显差别(如图1)。
图1 单纯热疗
2.2 单纯化疗的细胞毒作用(常温37℃非热化疗)
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2μg/ml以下较弱；超过2μg/ml则随着浓度提高而CI值明显增强，32μg/ml时CI值接近100%(如图2)。
图2 单纯化疗1小时
2.3 热疗和化疗联合的细胞毒性作用
随着温度提高，CI值增大，曲线上移，42℃以上显著(如图3)；随着热疗的时间延长，CI值亦增大，曲线上移，30min以上显著(如图4)；随着温度升高和时间延长，取得相同CI值所需药物浓度降低。提示浓度，温度，时间之间有一定关系(如图3，4)。
图3 不同温度化疗加热30分
, 百拇医药
图4 43℃不同时间化疗
2.4 热疗与化疗顺序的影响
同一浓度和温度下，顺序不同，CI值有所不同。同一温度下，4～16μg/ml间，先化后热与热化同时有差异(P<0.05)，两者与先热后化差异显著(P<0.01)，但2 μg/ml以下及32μg/ml以上差异不显著(P>0.05)。同一浓度(8μg/ml)下，42～43℃间，结果同上，但41℃以下和44℃以上差异不显著(P>0.05)(如图5，6)。
图5 43℃不同热化顺序
图6 相同浓度(μg/ml)加热30分钟不同热化顺序
, 百拇医药
3 讨论
3.1 ADM对热疗的抑制效应具有增效作用
ADM是周期非特异性药物，主要作用机制是在NA复制过程中诱导TOPOⅡ抑制剂—DNA断裂复合物的形成，引起细胞死亡或停滞于S期，G2[2]。由于ADM使大量细胞处于S期，S期对热最感[3]，因此先化后热毒性作用较强，是化疗对热的增效。
3.2 高热对细胞具有明显抑制效应
高热对细胞膜具有独特作用，可改变生物膜的流动性，导致细胞浆破坏；高热能抑制细胞DNA，RNA，蛋白质的合成与修复；高热可以改变细胞膜的通透性，提高胞浆中的药物浓度。S期的细胞对热最敏感，慢性乏氧细胞对热最敏感，一定温度可引起蛋白质和DNA变性称热变性[1，4，5]。但温热必须达到一定温度对细胞才有毒性，乏氧的肿瘤细胞比正常组织细胞对热更敏感。本实验中看出单纯热疗43℃30min以上毒性较强，超过44℃VX-2细胞几乎全部死亡，即热变性作用，低于41℃、30min较弱。因此在体内应用时，既要注意温度过高对正常细胞的损伤，又要注意温度不能过低以致影响疗效。介入治疗中要尽可能超选择插管到肿瘤靶血管内。
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3.3 热对化疗有增敏作用
42～43℃化疗作用明显强于37℃化疗如(图3，4)提示浓度、温度、时间之间存在一定关系。一定范围内，随着温度提高，达到相同CI值所需药物浓度降低，说明高热对化疗具有热增敏作用。低于这一范围，药物的毒性起主要作用，浓度越高作用越强；高于这一范围，热变性起主要作用，温度越高作用越强。一定浓度范围内，同一浓度，43℃的CI值是37℃的10倍以上，即化疗毒性增强10倍以上。
3.4 ADM热化疗
先化后热强于热化同时，后者强于先热后化。不同的药物与热疗联合的最佳顺序不同，如丝裂霉素与热和药同时应用效果最佳[6]。在本实验中发现ADM与热合用，效果依次为先化后热，热化同时，先热后化，这是由药物的机理决定的。ADM与热疗相互增敏作用机理可能为：(1)ADM使对高热敏感的S期细胞增多；(2)热疗增加细胞膜的通透性，提高细胞内的药物浓度。作者在另一研究中，通过流式细胞仪检测加热前后细胞内阿霉素荧光强度，已证实加热可提高细胞浆中的药物浓度(文章正待发表)；(3)高温可使蛋白质变性，高热同样可使酶的活性受到抑制，障碍DNA的修复。
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本实验从一定角度对VX-2的ADM热化疗规律进行了研究，下一步准备建立兔VX-2肝移植性癌模型，并以此模型为研究对象，以本实验结果为指导，研究在体热化疗的疗效，温度控制及安全性等问题，为临床介入性热化疗提供指导。
参考文献
1 Storm FK.Hyperthermia in Cancer therapy[A].G.K.Hall medical publishers Boston[M]. Massachusetts, 1983:585.
2 Tewey KM,Rowe TC,Yang L,et al.Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase Ⅱ〔J〕. Science,1984， 226:466～ 468.
3 Valdagni R .International consensus meeting on.hyperthermia:final report〔J〕.Int J Hyperthermia, 1990, 6:839-877.
, 百拇医药
4 Overgaard J,Nielsen OS.The role of tissue environmental factors on the kinetics and morphology of tumur cells exposed to hyperthermia〔J〕.Ann NY Acad Sci,1980,335:254～ 259.
5 Overgaard J,Radacic MM,Grau C.Interaction of hyperthermia and cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ) alone or combined with radiation in a C3H mammary carcinoma in vivo〔J〕.Cancer Res,1991,51:707～ 711.
6 Kobayashi K, Fujimoto S,Takahashi M,et al.The experimental and clinical study of hyperthermia with thermosensitizer for gastric cancer patient with peritoneal seeding 〔J〕.Gan TO Kagaku Ryoho,1992,19(10):1615～ 1620.
收稿日期：1998-05-25；修回日期：1998-10-21, 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院介入放射科(西安，710038)
关键词：阿霉素；热化疗；VX-2
癌症990312
【摘要】目的：观察比较热疗、化疗、热化疗对体外兔VX-2细胞的生长抑制规律的影响，为临床介入性热化疗提供实验数据。方法：以体外长期培养的兔VX-2细胞为靶细胞，采用水浴加温法、进行体外细胞毒试验(MTT法)，观察单纯热疗，单纯化疗及热疗与化疗结合对兔VX-2细胞的生长抑制规律的影响及差别。结果：(1)温热和阿霉素对VX-2均有一定的抑制和杀伤作用，两者一定方式的联合具有协同或相加作用；(2)热化疗加热温度以42～43℃为佳，加热时间以30分钟以上为佳。结论：(1)热对化疗有增敏作用；(2)一定温度的热化疗优于单纯热疗和单纯化疗。
, 百拇医药
中图号：R7357 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0276-03
Synergistic effect of combined use of hyperthermia and
adriamycin (ADM) on rabbit hairy cell line VX-2
ZHANG Hong-xin WANG Zhi-min GUO Wei-ping,et al
Department of Interventional Radiology,Tangdu Hospital,Fourth
Military Medical University, Xian 710038,China
, 百拇医药
【Abstract】 Objective：To observe the inhibition of cell growth of VX-2 with MTT assay under water-heating with ADM.Method：The hare leukemia VX-2 cell line was used in this study.The inhibiton of cell growth was observed with MTT assay under water-heating with ADM.Results：1.Both hyperthermia and ADM can inhibit or kill the VX-2 cells directly.The combination use of hyperthermia and ADM shows evidence of synergistic or additional effect.2.The optimal temperature and time of hyperthermia are 42～ 43 ℃ and 30 minutes. Conclusions：1.Hyperthermia enhanced the efficacy of chemotherapy,2.Hyperthermia of definite temperature showed better effect than those of heat or chemotherapy alone.
, 百拇医药
Key words：Adriamycin(ADM);Thermochemotherapy;Hare cell line;VX-2
热疗对肿瘤的抑制效应已广为接受，成为肿瘤治疗的一种方法[1]。热疗一般采用射频方式，操作复杂，加热时间长，病人难以接受而限制了应用。由于介入放射医学的发展，使解决这个问题成为可能，即通过导管将一定温度的热盐水或热的化疗药物注入局部肿瘤病灶，可以称之为介入性热化疗。为了制定安全合理的介入性热化疗方案，我们采用MTT比色法，研究了临床常用的阿霉素(ADM)与热疗结合对兔VX-2作用的最佳温度，最佳加热时间，及最佳组合方式，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
兔VX-2由本校实验动物中心提供，按常规方法培养于含10%小牛血清的RPMI-1640全培养液中(含青霉素PC)100U/ml，链霉素(SM)100μg/ml)，单层培养于37℃CO2恒温孵育箱内，用接种传代第3天的细胞(处于对数生长期)做实验。
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1.2 加热处理
设37℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃等6个温度点。采用水浴加热法，(数字式恒温浴槽，温度波动≤±01℃)，将培养瓶浸没于水中，加热时间设0，15，30，60分钟共4组。
1.3 药物处理
阿霉素(ADM，FarmitaliaCarloErba)，设0，1，2，4，8，16，32，64μg/ml等共8组，用微量进样器加药。
1.4 热药顺序
先化后热(先化疗1小时再热疗)，热化同时(加热同时加药化疗1小时)，先热后化(先加热后化疗1小时)
1.5 实验分组设计
按不同温度、不同加热时间、不同热化顺序和不同药物浓度4个因素设计，即组内分组设计，化疗时间统一为1小时，将实验处理过的细胞消化成细胞悬液(5×105个细胞/ml)接种到96孔板上，设3个复孔，每孔200μl(1×105个细胞/ml)，以未经处理的细胞为阴性对照，以不含细胞的1640全培养液为空白对照，常规法孵育24小时后每孔加入MTT50μl，继续培养4～6小时，去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔，充分振荡5分钟，上酶联免疫检测仪，测定波长490nm每孔的光密度值(A值)，计算细胞毒指数(CI)公式：
, http://www.100md.com
CI值=(1-实验孔的平均OD值/阴性对照孔的平均OD值)×100%
1.6 统计学处理
采用方差分析，Q检验。
2 结果
2.1 单纯热疗的细胞毒作用
42℃30min以下较弱；43℃30min以上较强；超过44℃CI值接近100%；低于41℃30min同37℃没有明显差别(如图1)。
图1 单纯热疗
2.2 单纯化疗的细胞毒作用(常温37℃非热化疗)
, 百拇医药
2μg/ml以下较弱；超过2μg/ml则随着浓度提高而CI值明显增强，32μg/ml时CI值接近100%(如图2)。
图2 单纯化疗1小时
2.3 热疗和化疗联合的细胞毒性作用
随着温度提高，CI值增大，曲线上移，42℃以上显著(如图3)；随着热疗的时间延长，CI值亦增大，曲线上移，30min以上显著(如图4)；随着温度升高和时间延长，取得相同CI值所需药物浓度降低。提示浓度，温度，时间之间有一定关系(如图3，4)。
图3 不同温度化疗加热30分
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图4 43℃不同时间化疗
2.4 热疗与化疗顺序的影响
同一浓度和温度下，顺序不同，CI值有所不同。同一温度下，4～16μg/ml间，先化后热与热化同时有差异(P<0.05)，两者与先热后化差异显著(P<0.01)，但2 μg/ml以下及32μg/ml以上差异不显著(P>0.05)。同一浓度(8μg/ml)下，42～43℃间，结果同上，但41℃以下和44℃以上差异不显著(P>0.05)(如图5，6)。
图5 43℃不同热化顺序
图6 相同浓度(μg/ml)加热30分钟不同热化顺序
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3 讨论
3.1 ADM对热疗的抑制效应具有增效作用
ADM是周期非特异性药物，主要作用机制是在NA复制过程中诱导TOPOⅡ抑制剂—DNA断裂复合物的形成，引起细胞死亡或停滞于S期，G2[2]。由于ADM使大量细胞处于S期，S期对热最感[3]，因此先化后热毒性作用较强，是化疗对热的增效。
3.2 高热对细胞具有明显抑制效应
高热对细胞膜具有独特作用，可改变生物膜的流动性，导致细胞浆破坏；高热能抑制细胞DNA，RNA，蛋白质的合成与修复；高热可以改变细胞膜的通透性，提高胞浆中的药物浓度。S期的细胞对热最敏感，慢性乏氧细胞对热最敏感，一定温度可引起蛋白质和DNA变性称热变性[1，4，5]。但温热必须达到一定温度对细胞才有毒性，乏氧的肿瘤细胞比正常组织细胞对热更敏感。本实验中看出单纯热疗43℃30min以上毒性较强，超过44℃VX-2细胞几乎全部死亡，即热变性作用，低于41℃、30min较弱。因此在体内应用时，既要注意温度过高对正常细胞的损伤，又要注意温度不能过低以致影响疗效。介入治疗中要尽可能超选择插管到肿瘤靶血管内。
, http://www.100md.com
3.3 热对化疗有增敏作用
42～43℃化疗作用明显强于37℃化疗如(图3，4)提示浓度、温度、时间之间存在一定关系。一定范围内，随着温度提高，达到相同CI值所需药物浓度降低，说明高热对化疗具有热增敏作用。低于这一范围，药物的毒性起主要作用，浓度越高作用越强；高于这一范围，热变性起主要作用，温度越高作用越强。一定浓度范围内，同一浓度，43℃的CI值是37℃的10倍以上，即化疗毒性增强10倍以上。
3.4 ADM热化疗
先化后热强于热化同时，后者强于先热后化。不同的药物与热疗联合的最佳顺序不同，如丝裂霉素与热和药同时应用效果最佳[6]。在本实验中发现ADM与热合用，效果依次为先化后热，热化同时，先热后化，这是由药物的机理决定的。ADM与热疗相互增敏作用机理可能为：(1)ADM使对高热敏感的S期细胞增多；(2)热疗增加细胞膜的通透性，提高细胞内的药物浓度。作者在另一研究中，通过流式细胞仪检测加热前后细胞内阿霉素荧光强度，已证实加热可提高细胞浆中的药物浓度(文章正待发表)；(3)高温可使蛋白质变性，高热同样可使酶的活性受到抑制，障碍DNA的修复。
, http://www.100md.com
本实验从一定角度对VX-2的ADM热化疗规律进行了研究，下一步准备建立兔VX-2肝移植性癌模型，并以此模型为研究对象，以本实验结果为指导，研究在体热化疗的疗效，温度控制及安全性等问题，为临床介入性热化疗提供指导。
参考文献
1 Storm FK.Hyperthermia in Cancer therapy[A].G.K.Hall medical publishers Boston[M]. Massachusetts, 1983:585.
2 Tewey KM,Rowe TC,Yang L,et al.Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase Ⅱ〔J〕. Science,1984， 226:466～ 468.
3 Valdagni R .International consensus meeting on.hyperthermia:final report〔J〕.Int J Hyperthermia, 1990, 6:839-877.
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4 Overgaard J,Nielsen OS.The role of tissue environmental factors on the kinetics and morphology of tumur cells exposed to hyperthermia〔J〕.Ann NY Acad Sci,1980,335:254～ 259.
5 Overgaard J,Radacic MM,Grau C.Interaction of hyperthermia and cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ) alone or combined with radiation in a C3H mammary carcinoma in vivo〔J〕.Cancer Res,1991,51:707～ 711.
6 Kobayashi K, Fujimoto S,Takahashi M,et al.The experimental and clinical study of hyperthermia with thermosensitizer for gastric cancer patient with peritoneal seeding 〔J〕.Gan TO Kagaku Ryoho,1992,19(10):1615～ 1620.
收稿日期：1998-05-25；修回日期：1998-10-21, 百拇医药