微血管增生及转基因治疗缺血性疾病
作者：肖林生 修瑞娟
单位：100005 北京，中国医学科学院、中国协和医科大学微循环研究所
关键词：
中国微循环990301 生理状态下体内并无微血管增生现象(月经周期中子宫内膜变化是仅有的例外)，但在一些病理情况，如损伤愈合、炎症、类风湿性血管炎、糖尿病伴发的视网膜病变等，微血管增生是基本的病理过程。特别是在缺血性疾病及肿瘤发生过程中，微血管增生的意义提示，可能通过调节微血管增生来治疗这类疾病。早在70年代就提出了抑制微血管增生以治疗肿瘤的研究。对于缺血性疾病，首先采用了外源性促微血管增生活性因子，获得明显的治疗效果。但是嗣后的研究发现，系统给予外源性重组微血管增生因子，可能促发潜在肿瘤的生长，也可能造成意外的微血管增生而致大脑和视网膜不可逆病变，加之昂贵的费用，近几年来转而发展基因治疗方法促进微血管增生以治疗缺血性疾病。本文拟就基因治疗的发展现状作一论述，并探讨今后的研究方向。
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促微血管增生活性因子
已经发现多种活性因子可能影响血管内皮细胞的行为(表1)，其中已用于基因治疗的是纤维母细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
增 生
游 走
炎 症
抑 制 因 子
FGF族
bFGF
IL-1
血管抑素
VEGF
, 百拇医药
VEGF
PAF-4
内皮素
PIGF
PGEα
TNF-α
IFN-α
PDGF
IL-1
ECF
TNF-α
PAF-4
GM-CSF
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TGF-β
Heparincofactor
TGF-β、TIMP
IGF-1
TNF-α
PD-ECGF
TNF-β
TGF-α
TSP
血管营养素
注： FGF，纤维母细胞生长因子；bFGF，碱性FGF；VEGF，血管平滑肌细胞生长因子；PIGF，胎盘生长因子；PDGF，血小板源性生长因子；EGF，上皮生长因子；GM-CSF，粒细胞及巨噬细胞克隆刺激因子；IGF-1，类胰岛素生长因子-1；PD-ECGF，血小板源性内皮细胞生长因子；PAF-4，血小板激活因子-4；TNF，肿瘤坏死因子。
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1 FGF族
至少包括9种亚类多肽，其中酸性FGF(aFGF或FGF-1)和碱性FGF(bFGF或FGF-2)研究较为清楚。两者具有高度的蛋白均一性，并且均不具有分泌信号系列，在体内的释放可能来自死亡细胞或经不明的机制介导。aFGF分布广泛，或与细胞受体或与基质成份结合，但不导致微血管增生，说明其活性在生理状态下受到严格控制。
aFGF和bFGF均对肝素有高度亲和性。与高亲和性细胞受体(FGFR-1，2，3，4)结合后激活酪氨酸激酶和细胞内磷酸化过程，导致细胞增生[1]。abFGF还可能与基质中低亲和性但高效的肝素硫酸蛋白多糖受体结合[2]从而避免FGF被蛋白酶降解，可能是FGF储存的一种形式，只是在细胞外基质酶作用时或有外源肝素引入时才被释放。多个FGF分子可与细胞表面肝素硫酸蛋白多糖基结合，提高FGF的局部浓度并可藉此促进FGF进入细胞内靶结构。
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aFGF是一种154氨基酸多肽，其编码基因位于人第五染色体。心肌和血管平滑肌细胞合成aFGF，aFGF刺激包括血管内皮细胞的多种细胞成份增生[3]。
bFGF有四种同功型式，分子量分别为18、22、22.5和24kDa，由第四染色体上的同一基因的不同片段系列编码。可由多种细胞成份包括血管内皮、平滑肌细胞及心肌细胞合成，并激活多种细胞包括血管内皮细胞的增生和游走形成新的血管[4]。bFGF与VEGF有协同作用。
其他7种FGF多肽(FGF3～9)多为癌基因产物，一般不存在于组织中，仅与胚胎发育有关，FGF—5cDNA已被用于基因治疗研究。
2 血管内皮生长因子(VEGF)
VEGF是肝素结合型的血管内皮细胞选择性丝裂原，也称为血管通透因子，因分子量的不同有四种亚型。VEGF与肝素硫酸蛋白多糖亲和力低，但与两种细胞酪氨酸激酶受体即fms样酪氨酸激酶(flt-1)和激酶功能区(KDR)有高度亲和性[5]。VEGF由多种类型细胞合成，缺氧时血管内皮细胞不仅合成VEGF，而且细胞表面VEGF受体活性明显增高。因此认为VEGF是缺血时微血管增生的主要调节因子[6、7]。VEGF与bFGF可协同促进血管内皮细胞分化并形成新血管[8]。
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基因载体及基因转染技术
除了选择高效的微血管增生活性因子外，克隆相应的cDNA，构建适当的基因载体并选择合适的体内基因导入技术对基因治疗的成功至为重要。
目前已克隆的表达装置包括启动子，与之联结的编码序列及转录终止序列，后者一般为位于基因3’末端的聚腺苷酸结构，编码序列多为编码蛋白的cDNA，也可能为一完整基因，包括内含子及其他非蛋白编码序列，例如反意义结构和核糖代酶等。
1 基因直接转导
最简单的基因转导技术是用未经修饰的裸DNA直接与细胞在体外孵育，已成功用于体内试验[9]。在将基因直接导入血管壁时可将裸基因与由水凝胶(hydrogel)包被的血管整形气囊表面偶连而导入细胞[10]。显然，这种直接基因转导技术转染率很低，但毒性及机体产生的免疫反应也相应较轻。
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2 基因-亲脂疏水介质复合体
为了提高转染率，基因DNA常与多种亲脂/疏水介质如阳离子磷脂(脂质体 liposomes)结合，促进细胞对基因DNA胞饮作用，这类介质还包括Transfeceam、DOTMA、DOPE、DURIE及其他多种磷脂类介质或亲脂性氨基酸[11]等。细胞与DNA-亲脂介质复合体混合，细胞所摄入的DNA大部份将被溶酶体降解，仅少量DNA可到达核内进行表达。为了提高表达率也可将DNA或DNA-亲脂介质复合物与腺病毒或其他病毒蛋白结合应用[12]。
3 病毒载体
是目前基因治疗中应用最多效率较高的基因载体。病毒经基因工程处理后不可能在宿主细胞内包装复制，但在转染前，在装入目的基因后可在体外特定的细胞株内，由整合有适当病毒基因的细胞株合成必须蛋白以包装病毒完成病毒的复制和扩增。
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3.1 反转录病毒载体
是一种RNA病毒，一般可携带9kb的外源DNA。经受体介导进入细胞后病毒合成的反转录酶使病毒RNA反转录为前病毒DNA并整合入宿主细胞遗传物质，随宿主细胞增殖而表达[13]。这种基因转染方式，表达持久适应于慢性疾病治疗的需要，但是也可能由于过度持久的外源基因表达，而对特定器官产生负面作用。特别是病毒DNA的整合，可导致宿主基因畸变或激活癌基因或抑制抑癌基因，反转录病毒载体应用因此受到严格限制。此外，前病毒DNA只能整合于增殖的细胞[14]，因此非增殖的血管内皮细胞、平滑肌细胞及心肌细胞不是这类载体的适合靶细胞。
3.2 腺病毒载体
腺病毒是常见的DNA病毒，毒性低(腺病毒疫苗已安全应用多年)，双链DNA含有36kb并可携带约10kb的外源基因。腺病毒DNA可经标准的重组技术处理，扩增滴度高(1011～1012病毒颗粒/ml)主要感染有丝分裂后静止细胞，是目前较理想的基因载体。但是，由于病毒DNA并不整合入宿主细胞遗传物质，尤其是病毒蛋白在宿主细胞表面的表达具有抗源性，可能刺激机体细胞及体液免疫反应，因此应用这种载体的基因表达时间短暂。不过，有限外源基因的表达似乎更适合于治疗性微血管增生以及抑制血管整形术后再狭窄治疗的需要。
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病毒的抗原性来源于病毒复制时新合成的病毒蛋白在宿主细胞表面的表达，抑制病毒复制，即可阻断由此产生的宿主免疫反应。病毒的复制，可根据DNA合成分成早晚两个时期，并由一系列基因控制。早期首先表达也是最重要的基因是E1A，其表达严格控制其后E1B-E4病毒基因的表达，并与晚时相基因表达直接相联最终合成壳蛋白，完成病毒复制。实验表明单独抑制E1A表达尚不足以抑制病毒复制，现已制备出E1及E4C[15]或E1及E2A[16]表达缺如的腺病毒载体完全失去复制能力，但保持携带外源基因的可能，延长外源基因表达时间。
病毒抗原诱导的免疫反应是MHC限制性的，现已成功地延入特定基因： 如E3-19k[17]或ICP47基因[18]于腺病毒载体。特定基因表达的相应蛋白可抑制宿主细胞MHC分子合成后向细胞表面的移动，从而抑制抗病毒免疫反应，延长转染基因的表达时间。
转基因治疗性血管增生
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1 aFGF
早于1993年Unger(30)在狗慢性心肌缺血模型中证实aFGF促微血管增生的治疗作用。同年Pu等每日肌注aFGF观察到结扎股动脉后兔后肢缺血区有明显的微血管增生和循环改善。以后Muhlhavser先组装成携带非分泌型aFGF-1-154编码基因的非复制性腺病毒载体，然后自FGF-4引入一分泌信使序列，首先组装成携带重组分泌型aFGF1-154cDNA的腺病毒载体(AdCMV.sp+aFGF1-154)。在结扎兔冠状动脉前2周开始心肌注射AdCHV.sp+aFGF1-154可见缺血区显著微血管增生并减少心肌梗塞发生的危险。虽然发现aFGF1-154反复转染NIH3T纤维母细胞株可在体外引起细胞转换及体内肿瘤发生，Pili等用AdCMV.sp+aFGF1-154转染裸鼠发现aFGF1-154表达是短暂的并无致癌性。
2 bFGF
首先在慢性肢体缺血的鼠和兔模型中发现bFGF的促微血管增生治疗作用。在慢性心肌缺血的实验狗，每日经冠状动脉或左心室输注bFGF，1～4周后缺血区血流明显增加。结扎猪冠动脉并于近端应用bFGF也观察到类似的结果。对急性心肌缺血动物bFGF也有治疗作用。在一项研究中，冠状动脉结扎后6小时，开始往冠状动脉内滴注bFGF，一周后梗塞区域面积缩小，血液动力学指标明显改善并伴有毛细血管及小动脉数量的增加。
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3 FGF-5
最近Giordano和Ping P报导猪冠状动脉内注射以腺病毒作载体的编码FGF-5基因明显增加慢性心肌缺血区血流量并增强心肌收缩力[19]。
4 VEGF
每日冠状动脉输注VEGF，28日后可见慢性心肌缺血狗的心侧枝循环血流量及心肌血管密度增加。在慢性后肢缺血的兔模型，股动脉切除后10日，开始在供应缺血区的髂动脉内注射VEGF，30天后，后肢血压及毛细血管密度明显高于对照组。在同样兔后肢慢性缺血模型中，动脉内注射表达VEGF165的质粒(phVEGF165)，明显改善缺血区的血流量。实验中phVEGF165与血管整形气囊表面的多聚体偶联，并释放入髂动脉内。动脉内释放编码VEGF121或VEGF189的重组质粒有同样的疗效。肌内注射phVEGF165也有疗效。在另外的实验中构建了携带表达VEGF165基因的天花病毒载体和腺病毒载体(AdCMVVEGF165)，载体均经处理不能复制，两者均在体外刺激血管内皮细胞增生，并分化为类毛细血管结构。体内也可在鼠皮下诱发微血管增生，但目前尚缺少这类病毒载体在与临床密切相关的动物模型中疗效的研究。转基因诱发治疗性微血管增生的临床研究始于1995年，质粒phVEGF165与血管整形导管气囊的水凝胶多聚体表面结合并经导管导入慢性下肢缺血患者的股动脉或月 国动脉细胞内，研究目的在于确定重组基因质粒转染的安全性以及转基因诱发微血管增生的解剖和生理功能特征。经由临床检查，常规和磁性resonce血管造影及血流多普勒等方法判定治疗效果。据报导[20]缺血肢体有明显的微血管增生，血管内多普勒检查显示血流量增加，但是新生血管数尚不足以预防转基因治疗5个月后仍需行下肢切除术。
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基因治疗的进一步研究方向
转基因刺激微血管增生以治疗缺血性疾病的研究已有很大进步，但是在发展成为一种实际应用的新治疗方法前尚需作更深入的观察并解决一些重要问题。
首先，体内转染基因的最佳途径或方式尚不清楚，这直接影响到转基因后的治疗性微血管增生。目前，实验动物中采用血管壁导入VEGF基因质粒、动脉内导入携带FGF-5基因的腺病毒载体、肌肉注射VEGF质粒或携带有分泌型aFGF1-154cDNA腺病毒载体均可在体内诱发产生治疗性微血管增生，但是迄今尚缺乏对不同基因释放系统作用的比较，需要进一步研究确定。不过，理论上肌肉直接导入克隆基因载体方法由于严格限制导入基因的表达于靶组织，可能是最佳的基因导入方式。
其次，尚需比较不同微血管增生因子不同组合的作用以提高疗效，降低副作用。转基因治疗临床应用的安全性(特别是与肿瘤发生的关系)，仍需要全面的研究评价。靶器官或靶组织以外微血管增生所致的病理，目前似缺乏充分的探讨，还不清楚转基因后诱发的微血管增生的持续时间。目前经各种途径所导入基因在体内的表达时间，决定于所采用的基因释放系统，大多限于数周。数周的时间足以诱导产生治疗性的微血管增生。但是，尚不清楚在生血管因子停止合成后是否新生的血管仍能持久存在。
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是否缺血是各种促微血管增生因子活性表达的必要条件？换言之，在没有缺血时，促微血管增生因子是否也能引起治疗性微血管增生？明确这一点对于转基因治疗有重要的临床意义。因为，实质上多数临床患者具有血管狭窄或病变时并无缺血发生，而往往只在代谢变化时，对供血需求增加，才出现缺血现象。如果微血管增生因子的活性，可能是缺血非依赖性的，则转基因治疗释放微血管增生因子更可能对血管狭窄患者缺血的发生有预防作用。一项初步实验发现，转导克隆有编码分泌型aFGF1-154基因的腺病毒载体，可能在非缺血状态下引发治疗性微血管增生，但是迄今几乎所有的相关实验均在缺血模型中进行。显然，还需要更进一步的研究。
最后，对基因转导及微血管增生后缺血区解剖及循环功能，特别是优先建立的微循环状态，尚缺乏肯定而敏感的观察方法和指标。这无疑对于评价基因治疗的临床意义是十分重要的。
总之，可以肯定转基因技术对于缺血性疾病的治疗具有巨大潜力和应用前景，目前该领域的研究也日趋活跃。在进一步深入研究的基础上，无疑将会积极改善缺血性疾病的治疗。
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参考文献
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14 Hiler DG，Adam MA，Miller AD.Gene transfer by retrovirus occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.Mol Cell Biol.1990，10：4239～4242
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16 Engelgardt JF，Ye X，Doranz B，et al.Ablation of E2A in recombinant adenoviruses improves transgene persistence and decreases inflammatory response in mouse liver.Proc Natl Acad Aci USA.1994，91：6196～6200
17 Lee MG，Abina MA，Hadada H，et al.The constitutive expression of the immunomodulatory gp 19k protein in E1-，E3-adenoviral vectors stronly reduces the host cytotoxic T cell response against the vector.Gene Ther.1995，2：256～262
18 York IA，Roop C，Andrewa DW，et al.A cytosolic herpes simplex virus protein inhibits antigen.Cell.1994，77：525～535
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20 Isner Jm，Pieczek A，Schainfeld R，et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene trasfer of ph VEGF 165 in patient with ischaemic limb.Lancet.1996，348：370～374
收稿： 1998-09-15 修回： 1998-11-07, 百拇医药
单位：100005 北京，中国医学科学院、中国协和医科大学微循环研究所
关键词：
中国微循环990301 生理状态下体内并无微血管增生现象(月经周期中子宫内膜变化是仅有的例外)，但在一些病理情况，如损伤愈合、炎症、类风湿性血管炎、糖尿病伴发的视网膜病变等，微血管增生是基本的病理过程。特别是在缺血性疾病及肿瘤发生过程中，微血管增生的意义提示，可能通过调节微血管增生来治疗这类疾病。早在70年代就提出了抑制微血管增生以治疗肿瘤的研究。对于缺血性疾病，首先采用了外源性促微血管增生活性因子，获得明显的治疗效果。但是嗣后的研究发现，系统给予外源性重组微血管增生因子，可能促发潜在肿瘤的生长，也可能造成意外的微血管增生而致大脑和视网膜不可逆病变，加之昂贵的费用，近几年来转而发展基因治疗方法促进微血管增生以治疗缺血性疾病。本文拟就基因治疗的发展现状作一论述，并探讨今后的研究方向。
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促微血管增生活性因子
已经发现多种活性因子可能影响血管内皮细胞的行为(表1)，其中已用于基因治疗的是纤维母细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
增 生
游 走
炎 症
抑 制 因 子
FGF族
bFGF
IL-1
血管抑素
VEGF
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VEGF
PAF-4
内皮素
PIGF
PGEα
TNF-α
IFN-α
PDGF
IL-1
ECF
TNF-α
PAF-4
GM-CSF
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TGF-β
Heparincofactor
TGF-β、TIMP
IGF-1
TNF-α
PD-ECGF
TNF-β
TGF-α
TSP
血管营养素
注： FGF，纤维母细胞生长因子；bFGF，碱性FGF；VEGF，血管平滑肌细胞生长因子；PIGF，胎盘生长因子；PDGF，血小板源性生长因子；EGF，上皮生长因子；GM-CSF，粒细胞及巨噬细胞克隆刺激因子；IGF-1，类胰岛素生长因子-1；PD-ECGF，血小板源性内皮细胞生长因子；PAF-4，血小板激活因子-4；TNF，肿瘤坏死因子。
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1 FGF族
至少包括9种亚类多肽，其中酸性FGF(aFGF或FGF-1)和碱性FGF(bFGF或FGF-2)研究较为清楚。两者具有高度的蛋白均一性，并且均不具有分泌信号系列，在体内的释放可能来自死亡细胞或经不明的机制介导。aFGF分布广泛，或与细胞受体或与基质成份结合，但不导致微血管增生，说明其活性在生理状态下受到严格控制。
aFGF和bFGF均对肝素有高度亲和性。与高亲和性细胞受体(FGFR-1，2，3，4)结合后激活酪氨酸激酶和细胞内磷酸化过程，导致细胞增生[1]。abFGF还可能与基质中低亲和性但高效的肝素硫酸蛋白多糖受体结合[2]从而避免FGF被蛋白酶降解，可能是FGF储存的一种形式，只是在细胞外基质酶作用时或有外源肝素引入时才被释放。多个FGF分子可与细胞表面肝素硫酸蛋白多糖基结合，提高FGF的局部浓度并可藉此促进FGF进入细胞内靶结构。
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aFGF是一种154氨基酸多肽，其编码基因位于人第五染色体。心肌和血管平滑肌细胞合成aFGF，aFGF刺激包括血管内皮细胞的多种细胞成份增生[3]。
bFGF有四种同功型式，分子量分别为18、22、22.5和24kDa，由第四染色体上的同一基因的不同片段系列编码。可由多种细胞成份包括血管内皮、平滑肌细胞及心肌细胞合成，并激活多种细胞包括血管内皮细胞的增生和游走形成新的血管[4]。bFGF与VEGF有协同作用。
其他7种FGF多肽(FGF3～9)多为癌基因产物，一般不存在于组织中，仅与胚胎发育有关，FGF—5cDNA已被用于基因治疗研究。
2 血管内皮生长因子(VEGF)
VEGF是肝素结合型的血管内皮细胞选择性丝裂原，也称为血管通透因子，因分子量的不同有四种亚型。VEGF与肝素硫酸蛋白多糖亲和力低，但与两种细胞酪氨酸激酶受体即fms样酪氨酸激酶(flt-1)和激酶功能区(KDR)有高度亲和性[5]。VEGF由多种类型细胞合成，缺氧时血管内皮细胞不仅合成VEGF，而且细胞表面VEGF受体活性明显增高。因此认为VEGF是缺血时微血管增生的主要调节因子[6、7]。VEGF与bFGF可协同促进血管内皮细胞分化并形成新血管[8]。
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基因载体及基因转染技术
除了选择高效的微血管增生活性因子外，克隆相应的cDNA，构建适当的基因载体并选择合适的体内基因导入技术对基因治疗的成功至为重要。
目前已克隆的表达装置包括启动子，与之联结的编码序列及转录终止序列，后者一般为位于基因3’末端的聚腺苷酸结构，编码序列多为编码蛋白的cDNA，也可能为一完整基因，包括内含子及其他非蛋白编码序列，例如反意义结构和核糖代酶等。
1 基因直接转导
最简单的基因转导技术是用未经修饰的裸DNA直接与细胞在体外孵育，已成功用于体内试验[9]。在将基因直接导入血管壁时可将裸基因与由水凝胶(hydrogel)包被的血管整形气囊表面偶连而导入细胞[10]。显然，这种直接基因转导技术转染率很低，但毒性及机体产生的免疫反应也相应较轻。
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2 基因-亲脂疏水介质复合体
为了提高转染率，基因DNA常与多种亲脂/疏水介质如阳离子磷脂(脂质体 liposomes)结合，促进细胞对基因DNA胞饮作用，这类介质还包括Transfeceam、DOTMA、DOPE、DURIE及其他多种磷脂类介质或亲脂性氨基酸[11]等。细胞与DNA-亲脂介质复合体混合，细胞所摄入的DNA大部份将被溶酶体降解，仅少量DNA可到达核内进行表达。为了提高表达率也可将DNA或DNA-亲脂介质复合物与腺病毒或其他病毒蛋白结合应用[12]。
3 病毒载体
是目前基因治疗中应用最多效率较高的基因载体。病毒经基因工程处理后不可能在宿主细胞内包装复制，但在转染前，在装入目的基因后可在体外特定的细胞株内，由整合有适当病毒基因的细胞株合成必须蛋白以包装病毒完成病毒的复制和扩增。
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3.1 反转录病毒载体
是一种RNA病毒，一般可携带9kb的外源DNA。经受体介导进入细胞后病毒合成的反转录酶使病毒RNA反转录为前病毒DNA并整合入宿主细胞遗传物质，随宿主细胞增殖而表达[13]。这种基因转染方式，表达持久适应于慢性疾病治疗的需要，但是也可能由于过度持久的外源基因表达，而对特定器官产生负面作用。特别是病毒DNA的整合，可导致宿主基因畸变或激活癌基因或抑制抑癌基因，反转录病毒载体应用因此受到严格限制。此外，前病毒DNA只能整合于增殖的细胞[14]，因此非增殖的血管内皮细胞、平滑肌细胞及心肌细胞不是这类载体的适合靶细胞。
3.2 腺病毒载体
腺病毒是常见的DNA病毒，毒性低(腺病毒疫苗已安全应用多年)，双链DNA含有36kb并可携带约10kb的外源基因。腺病毒DNA可经标准的重组技术处理，扩增滴度高(1011～1012病毒颗粒/ml)主要感染有丝分裂后静止细胞，是目前较理想的基因载体。但是，由于病毒DNA并不整合入宿主细胞遗传物质，尤其是病毒蛋白在宿主细胞表面的表达具有抗源性，可能刺激机体细胞及体液免疫反应，因此应用这种载体的基因表达时间短暂。不过，有限外源基因的表达似乎更适合于治疗性微血管增生以及抑制血管整形术后再狭窄治疗的需要。
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病毒的抗原性来源于病毒复制时新合成的病毒蛋白在宿主细胞表面的表达，抑制病毒复制，即可阻断由此产生的宿主免疫反应。病毒的复制，可根据DNA合成分成早晚两个时期，并由一系列基因控制。早期首先表达也是最重要的基因是E1A，其表达严格控制其后E1B-E4病毒基因的表达，并与晚时相基因表达直接相联最终合成壳蛋白，完成病毒复制。实验表明单独抑制E1A表达尚不足以抑制病毒复制，现已制备出E1及E4C[15]或E1及E2A[16]表达缺如的腺病毒载体完全失去复制能力，但保持携带外源基因的可能，延长外源基因表达时间。
病毒抗原诱导的免疫反应是MHC限制性的，现已成功地延入特定基因： 如E3-19k[17]或ICP47基因[18]于腺病毒载体。特定基因表达的相应蛋白可抑制宿主细胞MHC分子合成后向细胞表面的移动，从而抑制抗病毒免疫反应，延长转染基因的表达时间。
转基因治疗性血管增生
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1 aFGF
早于1993年Unger(30)在狗慢性心肌缺血模型中证实aFGF促微血管增生的治疗作用。同年Pu等每日肌注aFGF观察到结扎股动脉后兔后肢缺血区有明显的微血管增生和循环改善。以后Muhlhavser先组装成携带非分泌型aFGF-1-154编码基因的非复制性腺病毒载体，然后自FGF-4引入一分泌信使序列，首先组装成携带重组分泌型aFGF1-154cDNA的腺病毒载体(AdCMV.sp+aFGF1-154)。在结扎兔冠状动脉前2周开始心肌注射AdCHV.sp+aFGF1-154可见缺血区显著微血管增生并减少心肌梗塞发生的危险。虽然发现aFGF1-154反复转染NIH3T纤维母细胞株可在体外引起细胞转换及体内肿瘤发生，Pili等用AdCMV.sp+aFGF1-154转染裸鼠发现aFGF1-154表达是短暂的并无致癌性。
2 bFGF
首先在慢性肢体缺血的鼠和兔模型中发现bFGF的促微血管增生治疗作用。在慢性心肌缺血的实验狗，每日经冠状动脉或左心室输注bFGF，1～4周后缺血区血流明显增加。结扎猪冠动脉并于近端应用bFGF也观察到类似的结果。对急性心肌缺血动物bFGF也有治疗作用。在一项研究中，冠状动脉结扎后6小时，开始往冠状动脉内滴注bFGF，一周后梗塞区域面积缩小，血液动力学指标明显改善并伴有毛细血管及小动脉数量的增加。
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3 FGF-5
最近Giordano和Ping P报导猪冠状动脉内注射以腺病毒作载体的编码FGF-5基因明显增加慢性心肌缺血区血流量并增强心肌收缩力[19]。
4 VEGF
每日冠状动脉输注VEGF，28日后可见慢性心肌缺血狗的心侧枝循环血流量及心肌血管密度增加。在慢性后肢缺血的兔模型，股动脉切除后10日，开始在供应缺血区的髂动脉内注射VEGF，30天后，后肢血压及毛细血管密度明显高于对照组。在同样兔后肢慢性缺血模型中，动脉内注射表达VEGF165的质粒(phVEGF165)，明显改善缺血区的血流量。实验中phVEGF165与血管整形气囊表面的多聚体偶联，并释放入髂动脉内。动脉内释放编码VEGF121或VEGF189的重组质粒有同样的疗效。肌内注射phVEGF165也有疗效。在另外的实验中构建了携带表达VEGF165基因的天花病毒载体和腺病毒载体(AdCMVVEGF165)，载体均经处理不能复制，两者均在体外刺激血管内皮细胞增生，并分化为类毛细血管结构。体内也可在鼠皮下诱发微血管增生，但目前尚缺少这类病毒载体在与临床密切相关的动物模型中疗效的研究。转基因诱发治疗性微血管增生的临床研究始于1995年，质粒phVEGF165与血管整形导管气囊的水凝胶多聚体表面结合并经导管导入慢性下肢缺血患者的股动脉或月 国动脉细胞内，研究目的在于确定重组基因质粒转染的安全性以及转基因诱发微血管增生的解剖和生理功能特征。经由临床检查，常规和磁性resonce血管造影及血流多普勒等方法判定治疗效果。据报导[20]缺血肢体有明显的微血管增生，血管内多普勒检查显示血流量增加，但是新生血管数尚不足以预防转基因治疗5个月后仍需行下肢切除术。
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基因治疗的进一步研究方向
转基因刺激微血管增生以治疗缺血性疾病的研究已有很大进步，但是在发展成为一种实际应用的新治疗方法前尚需作更深入的观察并解决一些重要问题。
首先，体内转染基因的最佳途径或方式尚不清楚，这直接影响到转基因后的治疗性微血管增生。目前，实验动物中采用血管壁导入VEGF基因质粒、动脉内导入携带FGF-5基因的腺病毒载体、肌肉注射VEGF质粒或携带有分泌型aFGF1-154cDNA腺病毒载体均可在体内诱发产生治疗性微血管增生，但是迄今尚缺乏对不同基因释放系统作用的比较，需要进一步研究确定。不过，理论上肌肉直接导入克隆基因载体方法由于严格限制导入基因的表达于靶组织，可能是最佳的基因导入方式。
其次，尚需比较不同微血管增生因子不同组合的作用以提高疗效，降低副作用。转基因治疗临床应用的安全性(特别是与肿瘤发生的关系)，仍需要全面的研究评价。靶器官或靶组织以外微血管增生所致的病理，目前似缺乏充分的探讨，还不清楚转基因后诱发的微血管增生的持续时间。目前经各种途径所导入基因在体内的表达时间，决定于所采用的基因释放系统，大多限于数周。数周的时间足以诱导产生治疗性的微血管增生。但是，尚不清楚在生血管因子停止合成后是否新生的血管仍能持久存在。
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是否缺血是各种促微血管增生因子活性表达的必要条件？换言之，在没有缺血时，促微血管增生因子是否也能引起治疗性微血管增生？明确这一点对于转基因治疗有重要的临床意义。因为，实质上多数临床患者具有血管狭窄或病变时并无缺血发生，而往往只在代谢变化时，对供血需求增加，才出现缺血现象。如果微血管增生因子的活性，可能是缺血非依赖性的，则转基因治疗释放微血管增生因子更可能对血管狭窄患者缺血的发生有预防作用。一项初步实验发现，转导克隆有编码分泌型aFGF1-154基因的腺病毒载体，可能在非缺血状态下引发治疗性微血管增生，但是迄今几乎所有的相关实验均在缺血模型中进行。显然，还需要更进一步的研究。
最后，对基因转导及微血管增生后缺血区解剖及循环功能，特别是优先建立的微循环状态，尚缺乏肯定而敏感的观察方法和指标。这无疑对于评价基因治疗的临床意义是十分重要的。
总之，可以肯定转基因技术对于缺血性疾病的治疗具有巨大潜力和应用前景，目前该领域的研究也日趋活跃。在进一步深入研究的基础上，无疑将会积极改善缺血性疾病的治疗。
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收稿： 1998-09-15 修回： 1998-11-07, 百拇医药