大鼠蛛网膜下腔出血脑微区血流量与血清一氧化氮变化
作者：孙保亮 夏作理 杨明峰 张显忠 戴小牛
单位：孙保亮 夏作理 杨明峰 271000 山东省泰安市，泰山医学院微循环研究所；张显忠 泰山医学院附院生化室；戴小牛 南京铁道医学院生理教研室
关键词：蛛网膜下腔出血；脑缺血；脑微区血流量；脑血管痉挛；一氧化氮
中国微循环990309
【摘要】 目的 探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后继发性脑缺血损害及其一氧化氮(NO)的作用。方法 应用非开颅性方法建立大鼠SAH模型，检测24h内脑微区血流量和颅内血清NO的动态改变，并测量基底动脉(BA)管径。结果 SAH后脑微区血流量迅速降低，1h达最低值，24h内无明显恢复趋势(P<0.01)。SAH后1h血清NO开始减低，并持续24h(P<0.01)。BA管径于SAH后明显缩小(P<0.01)。结论 SAH时脑灌注压降低、脑血管痉挛及微循环异常均可能与脑血流量降低有关。NO减少是脑血管痉挛和微循环异常发生的重要因素之一。
, 百拇医药
Changes of Microregional Cerebral Blood Flow and Serum Nitric Oxide Content Following Subarachnoid Hemorrhage in Rats
Sun Baoliang，Xia Zuoli，Yang Mingfen，et al.
Institute of Microcirculation，Taishan Medical College，Taian 271000
【Abstract】 Objective To investigate the secondary brain ischemic damage and the role that nitric oxide plays after subarachnoid hemorrhage(SAH).Methods Noncraniotomy models of SAH in Wistar rats were used to determine the dynamic changes of microregional cerebral blood flow and intracranial serum nitric oxide content within 24h.Diameter of basilar artery was also measured.Results Microregional cerebral blood flow reduced immediately after SAH，reaching its nadir at 1h，maintaining at a lower level within 24h(P<0.01).Serum nitric oxide content decreased from 1h to 24hs after SAH(P<0.01).Diameter of basilar artery reduced significantly 0.5h after onset of SAH(P<0.01).Conclusions Reduction of cerebral perfusion pressure，spasm of the cerebral arteries and microcirculatory disturbance may contribute to the decrease of microregional cerebral blood flow following SAH.Reduction of nitric oxide level may be one of the important factors that are responsible for cerebral vasospasm and disturbance of microcirculation.
, 百拇医药
【Key words】 Subarachnoid hemorrhage Brain ischemia Microregional cerebral blood flowCerebral vasospasm Nitric oxide
急性和迟发性脑缺血损害是导致蛛网膜下腔出血(SAH)病人死亡和伤残的重要原因[1]。一氧化氮(NO)为一种新型的血管活性物质，又具有自由基特性，在生理和病理情况下发挥着复杂作用[2]。本文利用大鼠非开颅SAH模型，通过对脑微区血流量和血清NO水平检测，以进一步了解SAH继发性脑缺血损害的有关问题。
材料与方法
1 实验动物与模型制作
健康Wistar大鼠66只，雌雄兼有，体重300—350g，分为假手术组(Sham组，n=13)和SAH组(n=53)。两组各用8只行脑微区血流量动态测量，各5只测量手术前后基底动脉(BA)管径。SAH组另于SAH前(对照)、SAH后即刻、1h、6h、24h各8只检测血清NO水平。SAH模型的制作参照1995年Bederson等[1]非开颅方法并略作改良，自一侧颈外动脉插入经浓硝酸处理的玻璃纤维(日本Aatron3号渔线，直径0.285mm)至颈内动脉颅内段，刺破Willis环前部造成SAH。Sham组动物除不刺破Willis环外，余操作过程均相同。行右侧股动脉插管监测血压并定时取血观察血气指标。
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2 脑微区血流量及基底动脉管径测量
于大鼠前囟后、中线左侧各3mm处钻一直径2～3mm小孔，在立体定向仪控制下，将激光多普勒血流仪(LDF—Pf2型，瑞典RERIMED公司)探头(直径1.5mm)垂直置放于颅骨内板。脑血流信号经LDF软件(中国医科院微循环研究所研制)处理，相对数值由计算机打印。经斜坡开骨窗暴露BA，用显微镜测微尺及显微摄影方法测量BA三个部位(椎基底动脉汇合处、BA脑桥中部和分叉处)直径，取其均值。
3 血清一氧化氮测定
将动物快速断头取颅内血液1ml。采用铜离子活化镉还原法[3]测定NO2(NO3还原为NO2)浓度反映NO水平。镉粒系北京57601化工厂产品，纯度99.9%。余试剂均为分析纯。
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4 统计学分析
采用配对或组间t检验，数据以均值±标准差表示。
结 果
Sham组大鼠颅脑解剖无异常发现，SAH模型动物均见有大量血液或血凝块分布于蛛网膜下腔，所有动物均无脑实质损伤。实验过程中各组动物PaO2、PaCO2、血PH值无明显变化。SAH组产生SAH后股动脉平均动脉压(MABP)稍增高，1h后恢复。见表1。
表1 Sham组和SAH组手术前后某些生理指标变化 组 别
PaO2(KPa)
PaCO2(KPa)
, 百拇医药 血PH值
MABP(KPa)
Sham组(n=6)
术前对照
术后0.5h
术后1h
16.44±1.21
16.92±1.09
16.57±0.68
4.48±0.64
4.69±0.47
4.63±0.45
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7.39±0.01
7.39±0.03
7.40±0.02
14.33±1.40
15.62±1.40
14.16±1.27
SAH组(n=6)
术前对照
术后0.5h
术后1h
16.47±1.09
16.37±1.40
, http://www.100md.com
16.24±1.39
4.41±0.49
4.61±0.71
4.33±0.63
7.41±0.03
7.40±0.04
7.38±0.03
14.13±1.25
17.41±1.15*
14.49±1.21
*P<0.05，与术前对照比较
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在实验过程中，Sham组脑微区血流量保持相对恒定。SAH组术前脑微区血流量为821.4±87.3LDF单位，产生SAH后立即开始下降，1h降至最低值(360.6±43.0LDF单位，较术前降低56.12%)，在24h内无恢复趋势。在SAH后各测定时间的数值均较术前对照为低(P<0.01)。见图1。
图1 Sham组和SAH组脑微区血流量变化(n=8)
Sham组假手术前后BA管径未见明显变化。SAH组于术后0.5hBA明显收缩(表2)。
表2 Sham组及SAH组手术前后BA管径(μm) 组 别
n
术前对照
, 百拇医药
术后0.5h
Sham
SAH
5
5
235.5±34.2
245.7±23.9
227.4±34.2
125.2±16.7*
*P<0.01，与术前对照比较
SAH组术前血清NO2/NO3浓度为72.98±15.9μmol/L，于产生SAH后1h开始明显降低，6h降至最低值(34.90±7.88μmol/L，较SAH前减低52.18%)，24h时仍维持于低水平(图2)。
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图2 SAH组颅内血清NO水平改变(n=8)
*P<0.01，与SAH前比较
讨 论
由于缺少一种合适的动物模型，使对SAH及其继发性脑缺血损害的研究受到一定限制。目前多数SAH模型系用犬、猫、猴等大动物经脑池注入自体血而制作，具有以下不足： ① 需广泛性手术，损害重；② 忽略了动脉壁受损这一重要因素；③ 插入的导管影响血管舒缩；④ 颅腔开放，不能造成出血早期颅内压(ICP)急剧升高；⑤ 花费较大[1，4，5]。本文采用的非开颅性大鼠SAH模型则克服了上述缺陷。
脑细胞与血液之间物质、能量交换是在微循环中进行的，因此测量脑微区血流量较之观察大血管血流能更好地反映脑细胞的血供状态。无损伤LDF能客观检测探头下约1mm脑微区血流的相对变化[1]。本实验中，脑微区血流量于SAH后立即下降，0.5h降至最低值，24h内无明显恢复，说明SAH后产生了继发性脑缺血。SAH后0.5hBA明显收缩，表明发生了脑血管痉挛(CVS)。然而CVS并不能完全解释脑微区血流量的降低。本实验采用颅腔闭合的动物模型，SAH早期ICP可升高至正常的30—50倍[5]，因此脑灌注压降低是早期脑血流减低的重要原因。CVS的出现促使脑血流量进一步持续减少而加重脑缺血。
, 百拇医药
NO系一种小分子活性物质，脑内NO主要由血管(包括微血管)内皮细胞，其次由含NO合酶的神经纤维和神经元、胶质细胞合成和分泌。NO对脑血流的维持有重要作用，它除可直接扩张血管外，尚具有抗血小板和白细胞聚集与粘附的作用，因而可保护血管内皮细胞，并有助于改善血液流变性和保持微循环的畅通[6～8]。本实验发现，颅内血液NO水平在SAH后1h开始明显降低，24h仍维持于低水平。SAH时血管内皮细胞受损、红细胞释放的氧合血红蛋白及其代谢产生的自由基，可使NO生成、释放减少或过多灭活[9，10]。NO减少既可促使CVS的发生，又能造成血液流变及脑微循环状态异常，从而可导致脑微区血流量减低和脑缺血发生。
根据上述结果，我们认为SAH时反映脑缺血的脑微区血流量减低是脑灌注压降低、CVS和微循环异常的综合作用结果；NO减少是促使CVS和微循环异常发生的重要因素之一。在临床防治SAH脑缺血损害时，应注意提升脑灌注压，缓解CVS和改善微循环状态并举，以取得满意效果；寻找有效NO供体亦有积极意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Bederson JB，Germano M，Guarino L.Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncranitomy model of subarachnoid hemorrhage in rats.Strok.1995，26(6)：1087
2 Iadecola C，Pellgrino DA，Moskowitz MA，et al.Nitric oxide synthase inhibition and cerebrovascular regulation.J Cereb Blood Flow Metab.1994，14：175
3 王成彬，沈文梅，田亚平，等.铜离子活化镉还原法测定血清中硝酸盐浓度.中华医学检验杂志.1996，19(5)：281
, http://www.100md.com
4 Zuccarello M，Soattin GB，Lwis AI，et al.Prevention of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm by oral administration of endothelin receptor antagonists.J Neurosurg.1996，84：503
5 Veelken JA，Laing RJC，Takubouski J.The sheffield model of subarachnoid hemorrhage in the rat.Strok.1995，26(7)：1279～1283
6 Kim P，Franco L，Sasaki T，et al.Observation of myogenic rhythmic contractions of brain intraparenchymal arterioles and responsiveness to nitric oxide.J Cereb Blood Flow Metab.1993，13(suppl)：s151
, 百拇医药
7 Faraci FM，Brain JE.Nitric oxide and cerebral circulation.Stoke.1994，25：692
8 Tanaka K，Fukuuchi Y，Gomi S，et al.Inhibition of nitric oxide synthesis impairs autoregulation of local cerebral blood flow in the rat.Neuroreport.1993，4：267
9 Kasuya H，Weir BAK，Nakane M，et al.Nitric oxide synthase and guanylate cyclase levels in cenine basilar artery after subarachnoid hemorrhage.Neurosurgery.1995，82：250
10 Hatake K，Wabakayashi I，Kakishita E，et al.Impairment of endothelium-derived relaxation in human basilar artery after subarachnoid hemorrchage.Stroke.1992，23：1111
收稿： 1998-03-16 修回： 1998-04-11, 百拇医药
单位：孙保亮 夏作理 杨明峰 271000 山东省泰安市，泰山医学院微循环研究所；张显忠 泰山医学院附院生化室；戴小牛 南京铁道医学院生理教研室
关键词：蛛网膜下腔出血；脑缺血；脑微区血流量；脑血管痉挛；一氧化氮
中国微循环990309
【摘要】 目的 探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后继发性脑缺血损害及其一氧化氮(NO)的作用。方法 应用非开颅性方法建立大鼠SAH模型，检测24h内脑微区血流量和颅内血清NO的动态改变，并测量基底动脉(BA)管径。结果 SAH后脑微区血流量迅速降低，1h达最低值，24h内无明显恢复趋势(P<0.01)。SAH后1h血清NO开始减低，并持续24h(P<0.01)。BA管径于SAH后明显缩小(P<0.01)。结论 SAH时脑灌注压降低、脑血管痉挛及微循环异常均可能与脑血流量降低有关。NO减少是脑血管痉挛和微循环异常发生的重要因素之一。
, 百拇医药
Changes of Microregional Cerebral Blood Flow and Serum Nitric Oxide Content Following Subarachnoid Hemorrhage in Rats
Sun Baoliang，Xia Zuoli，Yang Mingfen，et al.
Institute of Microcirculation，Taishan Medical College，Taian 271000
【Abstract】 Objective To investigate the secondary brain ischemic damage and the role that nitric oxide plays after subarachnoid hemorrhage(SAH).Methods Noncraniotomy models of SAH in Wistar rats were used to determine the dynamic changes of microregional cerebral blood flow and intracranial serum nitric oxide content within 24h.Diameter of basilar artery was also measured.Results Microregional cerebral blood flow reduced immediately after SAH，reaching its nadir at 1h，maintaining at a lower level within 24h(P<0.01).Serum nitric oxide content decreased from 1h to 24hs after SAH(P<0.01).Diameter of basilar artery reduced significantly 0.5h after onset of SAH(P<0.01).Conclusions Reduction of cerebral perfusion pressure，spasm of the cerebral arteries and microcirculatory disturbance may contribute to the decrease of microregional cerebral blood flow following SAH.Reduction of nitric oxide level may be one of the important factors that are responsible for cerebral vasospasm and disturbance of microcirculation.
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【Key words】 Subarachnoid hemorrhage Brain ischemia Microregional cerebral blood flowCerebral vasospasm Nitric oxide
急性和迟发性脑缺血损害是导致蛛网膜下腔出血(SAH)病人死亡和伤残的重要原因[1]。一氧化氮(NO)为一种新型的血管活性物质，又具有自由基特性，在生理和病理情况下发挥着复杂作用[2]。本文利用大鼠非开颅SAH模型，通过对脑微区血流量和血清NO水平检测，以进一步了解SAH继发性脑缺血损害的有关问题。
材料与方法
1 实验动物与模型制作
健康Wistar大鼠66只，雌雄兼有，体重300—350g，分为假手术组(Sham组，n=13)和SAH组(n=53)。两组各用8只行脑微区血流量动态测量，各5只测量手术前后基底动脉(BA)管径。SAH组另于SAH前(对照)、SAH后即刻、1h、6h、24h各8只检测血清NO水平。SAH模型的制作参照1995年Bederson等[1]非开颅方法并略作改良，自一侧颈外动脉插入经浓硝酸处理的玻璃纤维(日本Aatron3号渔线，直径0.285mm)至颈内动脉颅内段，刺破Willis环前部造成SAH。Sham组动物除不刺破Willis环外，余操作过程均相同。行右侧股动脉插管监测血压并定时取血观察血气指标。
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2 脑微区血流量及基底动脉管径测量
于大鼠前囟后、中线左侧各3mm处钻一直径2～3mm小孔，在立体定向仪控制下，将激光多普勒血流仪(LDF—Pf2型，瑞典RERIMED公司)探头(直径1.5mm)垂直置放于颅骨内板。脑血流信号经LDF软件(中国医科院微循环研究所研制)处理，相对数值由计算机打印。经斜坡开骨窗暴露BA，用显微镜测微尺及显微摄影方法测量BA三个部位(椎基底动脉汇合处、BA脑桥中部和分叉处)直径，取其均值。
3 血清一氧化氮测定
将动物快速断头取颅内血液1ml。采用铜离子活化镉还原法[3]测定NO2(NO3还原为NO2)浓度反映NO水平。镉粒系北京57601化工厂产品，纯度99.9%。余试剂均为分析纯。
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4 统计学分析
采用配对或组间t检验，数据以均值±标准差表示。
结 果
Sham组大鼠颅脑解剖无异常发现，SAH模型动物均见有大量血液或血凝块分布于蛛网膜下腔，所有动物均无脑实质损伤。实验过程中各组动物PaO2、PaCO2、血PH值无明显变化。SAH组产生SAH后股动脉平均动脉压(MABP)稍增高，1h后恢复。见表1。
表1 Sham组和SAH组手术前后某些生理指标变化 组 别
PaO2(KPa)
PaCO2(KPa)
, 百拇医药 血PH值
MABP(KPa)
Sham组(n=6)
术前对照
术后0.5h
术后1h
16.44±1.21
16.92±1.09
16.57±0.68
4.48±0.64
4.69±0.47
4.63±0.45
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7.39±0.01
7.39±0.03
7.40±0.02
14.33±1.40
15.62±1.40
14.16±1.27
SAH组(n=6)
术前对照
术后0.5h
术后1h
16.47±1.09
16.37±1.40
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16.24±1.39
4.41±0.49
4.61±0.71
4.33±0.63
7.41±0.03
7.40±0.04
7.38±0.03
14.13±1.25
17.41±1.15*
14.49±1.21
*P<0.05，与术前对照比较
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在实验过程中，Sham组脑微区血流量保持相对恒定。SAH组术前脑微区血流量为821.4±87.3LDF单位，产生SAH后立即开始下降，1h降至最低值(360.6±43.0LDF单位，较术前降低56.12%)，在24h内无恢复趋势。在SAH后各测定时间的数值均较术前对照为低(P<0.01)。见图1。
图1 Sham组和SAH组脑微区血流量变化(n=8)
Sham组假手术前后BA管径未见明显变化。SAH组于术后0.5hBA明显收缩(表2)。
表2 Sham组及SAH组手术前后BA管径(μm) 组 别
n
术前对照
, 百拇医药
术后0.5h
Sham
SAH
5
5
235.5±34.2
245.7±23.9
227.4±34.2
125.2±16.7*
*P<0.01，与术前对照比较
SAH组术前血清NO2/NO3浓度为72.98±15.9μmol/L，于产生SAH后1h开始明显降低，6h降至最低值(34.90±7.88μmol/L，较SAH前减低52.18%)，24h时仍维持于低水平(图2)。
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图2 SAH组颅内血清NO水平改变(n=8)
*P<0.01，与SAH前比较
讨 论
由于缺少一种合适的动物模型，使对SAH及其继发性脑缺血损害的研究受到一定限制。目前多数SAH模型系用犬、猫、猴等大动物经脑池注入自体血而制作，具有以下不足： ① 需广泛性手术，损害重；② 忽略了动脉壁受损这一重要因素；③ 插入的导管影响血管舒缩；④ 颅腔开放，不能造成出血早期颅内压(ICP)急剧升高；⑤ 花费较大[1，4，5]。本文采用的非开颅性大鼠SAH模型则克服了上述缺陷。
脑细胞与血液之间物质、能量交换是在微循环中进行的，因此测量脑微区血流量较之观察大血管血流能更好地反映脑细胞的血供状态。无损伤LDF能客观检测探头下约1mm脑微区血流的相对变化[1]。本实验中，脑微区血流量于SAH后立即下降，0.5h降至最低值，24h内无明显恢复，说明SAH后产生了继发性脑缺血。SAH后0.5hBA明显收缩，表明发生了脑血管痉挛(CVS)。然而CVS并不能完全解释脑微区血流量的降低。本实验采用颅腔闭合的动物模型，SAH早期ICP可升高至正常的30—50倍[5]，因此脑灌注压降低是早期脑血流减低的重要原因。CVS的出现促使脑血流量进一步持续减少而加重脑缺血。
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NO系一种小分子活性物质，脑内NO主要由血管(包括微血管)内皮细胞，其次由含NO合酶的神经纤维和神经元、胶质细胞合成和分泌。NO对脑血流的维持有重要作用，它除可直接扩张血管外，尚具有抗血小板和白细胞聚集与粘附的作用，因而可保护血管内皮细胞，并有助于改善血液流变性和保持微循环的畅通[6～8]。本实验发现，颅内血液NO水平在SAH后1h开始明显降低，24h仍维持于低水平。SAH时血管内皮细胞受损、红细胞释放的氧合血红蛋白及其代谢产生的自由基，可使NO生成、释放减少或过多灭活[9，10]。NO减少既可促使CVS的发生，又能造成血液流变及脑微循环状态异常，从而可导致脑微区血流量减低和脑缺血发生。
根据上述结果，我们认为SAH时反映脑缺血的脑微区血流量减低是脑灌注压降低、CVS和微循环异常的综合作用结果；NO减少是促使CVS和微循环异常发生的重要因素之一。在临床防治SAH脑缺血损害时，应注意提升脑灌注压，缓解CVS和改善微循环状态并举，以取得满意效果；寻找有效NO供体亦有积极意义。
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参考文献
1 Bederson JB，Germano M，Guarino L.Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncranitomy model of subarachnoid hemorrhage in rats.Strok.1995，26(6)：1087
2 Iadecola C，Pellgrino DA，Moskowitz MA，et al.Nitric oxide synthase inhibition and cerebrovascular regulation.J Cereb Blood Flow Metab.1994，14：175
3 王成彬，沈文梅，田亚平，等.铜离子活化镉还原法测定血清中硝酸盐浓度.中华医学检验杂志.1996，19(5)：281
, http://www.100md.com
4 Zuccarello M，Soattin GB，Lwis AI，et al.Prevention of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm by oral administration of endothelin receptor antagonists.J Neurosurg.1996，84：503
5 Veelken JA，Laing RJC，Takubouski J.The sheffield model of subarachnoid hemorrhage in the rat.Strok.1995，26(7)：1279～1283
6 Kim P，Franco L，Sasaki T，et al.Observation of myogenic rhythmic contractions of brain intraparenchymal arterioles and responsiveness to nitric oxide.J Cereb Blood Flow Metab.1993，13(suppl)：s151
, 百拇医药
7 Faraci FM，Brain JE.Nitric oxide and cerebral circulation.Stoke.1994，25：692
8 Tanaka K，Fukuuchi Y，Gomi S，et al.Inhibition of nitric oxide synthesis impairs autoregulation of local cerebral blood flow in the rat.Neuroreport.1993，4：267
9 Kasuya H，Weir BAK，Nakane M，et al.Nitric oxide synthase and guanylate cyclase levels in cenine basilar artery after subarachnoid hemorrhage.Neurosurgery.1995，82：250
10 Hatake K，Wabakayashi I，Kakishita E，et al.Impairment of endothelium-derived relaxation in human basilar artery after subarachnoid hemorrchage.Stroke.1992，23：1111
收稿： 1998-03-16 修回： 1998-04-11, 百拇医药