人工肝生物材料人肝细胞系CL-1的微载体培养*
作者：徐小平1 高 毅2 杨继震2
单位：第一军医大学珠江医院 1急诊科 2普外科 广东省广州市 510282
关键词：肝/细胞学；人工肝；细胞株；细胞，培养的；微载体；生物材料
世界化人消化杂志990305
中国图书资料分类号 R318.14
摘 要
目的 使用微载体培养人肝细胞系CL-1，并观察细胞的转化及合成功能.
方法 使用Cyotdex-3微载体进行人肝细胞系CL-1的高密度培养，应用光镜及扫描电镜于培养1，3，5，7，9d动态观察细胞的生长情况，并同时检测培养系统的安定转化及清蛋白合成量.
, 百拇医药
结果 培养7d CL-1细胞密度达到最高，为2.16×109/L；安定转化量最高为619μg；清蛋白合成量最高为78μg.
结论 使用微载体培养高分化人肝细胞系可达到较高的密度，且具有较好的生物转化及合成功能，可望作为组合性人工肝的生物材料.
Human liver cell line CL-1 culture on
microcarriers acting as biomaterial
of bioartificial liver*
XU Xiao-Ping1, GAO Yi2 and YANG Ji-Zhen2
, 百拇医药
1Department of Emergency and 2General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Subject headings liver/cytology; artificial liver; cell line; cell, ultured; microcarries; biomaterials
Abstract
AIM To cultivate human Liver cell line CL-1 on microcarriers and study the synthetic and transformational functions of this culture system.
, http://www.100md.com
METHODS Human liver cell line CL-1 were cultivated on Cytodex-3 microcarriers. The cell growth was dynamically observed with light microscope and scanning electronic microscope on the 1st, 3 rd, 5th, 7th and 9th day, and the amounts of diazepam transformed and albumin synthesized were determined at the same time.
RESULTS On 7th day after inoculation, the CL-1 cell density could reach 2.16×109/L; the amount of diazepam transformed was 619μg and albumin synthesized 78μg.
, 百拇医药
CONCLUSION CL-1 can be cultivated to a high density on microcarriers and has liver specific biotransformation and biosynthesis functions. So the culture system may act as the biomaterial of bioartificial liver.
0 引言
体外组合性人工肝动物实验显示可提供良好的肝特异功能支持作用，初步临床应用令人振奋[1]. 人肝细胞系作为组合性人工肝生物材料的成功报道虽然有限，但非常引人注目[2]. 为国内人工肝的研究开辟了新的途径. 我们使用微载体培养技术进行人肝细胞系CL-1的高密度培养，观察细胞在微载体生长情况，并检测CL-1清蛋白合成安定转化等指标，探讨微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料在人工肝研究中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人肝细胞系CL-1，组织学来源于正常成人肝脏. Cytodex-3微载体(Pharmacia, Sweden). Bellco磁力搅拌器(0r/min～200r/min)及250mL搅拌培养瓶(Bellco Biotechnology, USA). 培养基DMEM，100mL/L NCS(newborn calf serum)， 3g/L谷胺酰胺(Gibco).
1.2 方法 ①Bellco搅拌培养瓶培养：将100mL浓度为2×108/L的细胞悬液，接种入含500mg微载体的搅拌培养瓶中间歇搅拌培养8h(每隔1h搅拌2min)，此后以30r/min搅拌速度，持续搅拌培养. 搅拌培养系统置于37℃恒温培养箱中. d2视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量. ②微载体培养CL-1清蛋白合成的检测：培养1，3，5，7，9d换液时，留取培养上清样品. 采用放射免疫抗原竞争法检测培养上清人清蛋白分泌. 先以人清蛋白标准品进行标准曲线制作. 再根据标准曲线得出每一样品的清蛋白含量. ③微载体培养CL-1安定转化功能的检测：先采用安定标准品制作安定转化的标准曲线. 原理：安定的硫酸溶液在处有最大的吸收峰，因此可用紫外分光光度仪测定. 在培养瓶中加入的安定标准品，于培养费的天取培养上清，按薛国柱et al[3]的方法测定培养上清的安定含量，并计算安定转化量. ④微载体培养细胞生长形态观察及计数：于细胞培养1，5，7，9d，在搅拌的状态下均匀取样于倒置显微镜下观察细胞生长情况并摄影. 每隔1d取样以结晶紫法计数细胞密度. 绘制生长曲线. ⑤微载体培养细胞扫描电镜观察：于培养7d在均匀的状态下取细胞培养样品，尽量去除培养基，PBS清洗3次，加20g/L的戊二醛固定30min，PBS清洗3次，10g/L锇酸固定30min，接着用500mL/L，700mL/L，800mL/L，900mL/L，1000mL/L，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ液的丙酮进行梯度脱水各10min，再用乙酸异戊酯置换4h以上，用日本的Hitachi HCP-2CO2临界干燥器干燥后，真空喷溅铂金离子，用日本的S450扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影.
, 百拇医药
2 结果
2.1 CL-1微载体培养的生长曲线 见(图1). 微载体培养时，细胞生长3d后加快，7d达最高峰，为2.16×109/L，9d后细胞密度有所下降，为1.92×109/L.
图1 微载体培养CL-1生长曲线
2.2 细胞生长形态 ①倒置显微镜下观察结果：d1可见50%以上的微载体都附着有细胞，并开始铺展(图2)，d5 80%以上的微载体上基本上长满了细胞，高倍镜下可见肝细胞呈多形性生长，并可见细胞分裂相(图3)，d7可见微载体间形成“桥联”生长现象，即微载体与微载体间借细胞联接在一起(图4). ②电子显微镜观察结果：扫描电镜下观察d7细胞呈半球状紧密贴附于微载体上(图5)，有如“仙人球状”，细胞表面的微绒毛清晰可见.
, 百拇医药
图2 微载体培养CL-1 24h光镜观察 ×120
图3 微载体培养CL-1 5d光镜观察 ×100
图4 微载体培养CL-1 7d光镜观察 ×200
图5 微载体培养CL-1 7d电镜观察 ×950
2.3 培养细胞功能 ①微载体培养CL-1上清的清蛋白合成量随时间变化的曲线见图6. 微载体培养时，CL-1的清蛋白分泌量于d7最高可达78μg. ②微载体培养CL-1上清安定转化的量随时间变化的曲线见图7. 安定转化量d7最高，可达619μg.
, 百拇医药
图6 微载体培养CL-1人清蛋白合成量.
图7 微载体培养CL-1安定转化量.
3 讨论
目前，体外人工肝的研究趋势是进行组合性生物人工肝的研究. 而组合性人工肝中用以提供体外肝功能的生物材料——高密度培养的具有高分化肝特异性功能的肝细胞的研究是当前人工肝研究中的热点之一. 由于在体外培养时，原代正常肝细胞难以维持其生长及功能[5]，而人肝细胞系是有肝功能活性生物材料的来源之一. 国内的人肝细胞系较多，部分肝细胞系保留了原代肝细胞的部分功能. 国外已有使用确立的人肝细胞系作为组合性人工肝生物材料的报道. Sussman et al[2]建立的人肝细胞系C3A，组织学来源于人肝母细胞瘤，具有稳定的高分化肝功能. 他使用C3A细胞在中空纤维中高密度培养，总量达到200g，成功地进行了肝衰动物模型和一例肝衰患者的救治.
, 百拇医药
作为组合性人工肝的生物材料，培养肝细胞不但要具有一定的肝特异性功能而且要达到一定的数量(即109水平)[4]. 普通的培养技术难以达到此要求. 鉴于微载体细胞培养技术具有表面积/体积比值大的特点，在较低小的培养体积中为细胞生长提供了巨大的表面积. 由于微载体培养大大增加了培养系统中细胞生长的表面积(每克Cytodex-3微载体的表面积是4600cm2)，而随着培养面积的增加，细胞数量也相应增加. 我们采用100mL Bellco搅拌培养瓶以5g/L的微载体浓度，当接种100mL浓度为2×108/L的细胞悬液进行培养7d时获得的最大细胞产量为2×108个，清蛋白合成量达78μg，安定转化量约619μg. 我们首次采用微载体培养具有高分化功能的人肝细胞系，大大提高了细胞培养密度，有望作为体外组合性人工肝的生物材料.
作者简介：
徐小平，男，1971-09-03生，江苏省高淳县人，汉族. 1994年第一军医大学临床医疗系本科毕业，1997年第一军医大学外科学硕士，主要从事人工肝基础与临床应用研究，发表论文4篇.
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，No.39570212.
通讯作者 徐小平，510282，第一军医大学珠江医院急诊科，广东省广州市工业大道中253号.
*Project supported by the National Natural Science foundation of China, No.39570212.
Correspondence to:XU Xiao-Ping, Department of Emergency, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
4 参考文献
, http://www.100md.com
[1] Sussman NL, Finegold MJ, Kelly JH. Recovery from syncytial giant cell (SGCH) hepatitis following treatment with an extracorporeal liver assist device (ELAD). Hepatology, 1992;15:51A
[2] Sussman NL, Chong MG, Koussayer T. Reversal of fulminant hepatic failure using extracorporeal liver assist device. Hepatology, 1992;16:60-65
[3] 薛国柱，刘冰艳，高毅，杨继震. 体外培养肝细胞微量合成人白蛋白的测定方法. 第一军医大学学报，1998；18：122
[4] Nyberg SL,. Peshwa MV, Payne WD. Evolution of the bioartificial liver: the need for randomized clinical trials. J Am Surg, 1993;166:512-521
[5] Kasai S, Sawa M, Mito M. Is the biological artificial liver clinically applicable A historic review of biological artificial liver support systems. Artif Organs, 1994;18:348-354
收稿日期 1998-05-05, 百拇医药(徐小平1 高 毅2 杨继震2)
单位：第一军医大学珠江医院 1急诊科 2普外科 广东省广州市 510282
关键词：肝/细胞学；人工肝；细胞株；细胞，培养的；微载体；生物材料
世界化人消化杂志990305
中国图书资料分类号 R318.14
摘 要
目的 使用微载体培养人肝细胞系CL-1，并观察细胞的转化及合成功能.
方法 使用Cyotdex-3微载体进行人肝细胞系CL-1的高密度培养，应用光镜及扫描电镜于培养1，3，5，7，9d动态观察细胞的生长情况，并同时检测培养系统的安定转化及清蛋白合成量.
, 百拇医药
结果 培养7d CL-1细胞密度达到最高，为2.16×109/L；安定转化量最高为619μg；清蛋白合成量最高为78μg.
结论 使用微载体培养高分化人肝细胞系可达到较高的密度，且具有较好的生物转化及合成功能，可望作为组合性人工肝的生物材料.
Human liver cell line CL-1 culture on
microcarriers acting as biomaterial
of bioartificial liver*
XU Xiao-Ping1, GAO Yi2 and YANG Ji-Zhen2
, 百拇医药
1Department of Emergency and 2General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Subject headings liver/cytology; artificial liver; cell line; cell, ultured; microcarries; biomaterials
Abstract
AIM To cultivate human Liver cell line CL-1 on microcarriers and study the synthetic and transformational functions of this culture system.
, http://www.100md.com
METHODS Human liver cell line CL-1 were cultivated on Cytodex-3 microcarriers. The cell growth was dynamically observed with light microscope and scanning electronic microscope on the 1st, 3 rd, 5th, 7th and 9th day, and the amounts of diazepam transformed and albumin synthesized were determined at the same time.
RESULTS On 7th day after inoculation, the CL-1 cell density could reach 2.16×109/L; the amount of diazepam transformed was 619μg and albumin synthesized 78μg.
, 百拇医药
CONCLUSION CL-1 can be cultivated to a high density on microcarriers and has liver specific biotransformation and biosynthesis functions. So the culture system may act as the biomaterial of bioartificial liver.
0 引言
体外组合性人工肝动物实验显示可提供良好的肝特异功能支持作用，初步临床应用令人振奋[1]. 人肝细胞系作为组合性人工肝生物材料的成功报道虽然有限，但非常引人注目[2]. 为国内人工肝的研究开辟了新的途径. 我们使用微载体培养技术进行人肝细胞系CL-1的高密度培养，观察细胞在微载体生长情况，并检测CL-1清蛋白合成安定转化等指标，探讨微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料在人工肝研究中的作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人肝细胞系CL-1，组织学来源于正常成人肝脏. Cytodex-3微载体(Pharmacia, Sweden). Bellco磁力搅拌器(0r/min～200r/min)及250mL搅拌培养瓶(Bellco Biotechnology, USA). 培养基DMEM，100mL/L NCS(newborn calf serum)， 3g/L谷胺酰胺(Gibco).
1.2 方法 ①Bellco搅拌培养瓶培养：将100mL浓度为2×108/L的细胞悬液，接种入含500mg微载体的搅拌培养瓶中间歇搅拌培养8h(每隔1h搅拌2min)，此后以30r/min搅拌速度，持续搅拌培养. 搅拌培养系统置于37℃恒温培养箱中. d2视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量. ②微载体培养CL-1清蛋白合成的检测：培养1，3，5，7，9d换液时，留取培养上清样品. 采用放射免疫抗原竞争法检测培养上清人清蛋白分泌. 先以人清蛋白标准品进行标准曲线制作. 再根据标准曲线得出每一样品的清蛋白含量. ③微载体培养CL-1安定转化功能的检测：先采用安定标准品制作安定转化的标准曲线. 原理：安定的硫酸溶液在处有最大的吸收峰，因此可用紫外分光光度仪测定. 在培养瓶中加入的安定标准品，于培养费的天取培养上清，按薛国柱et al[3]的方法测定培养上清的安定含量，并计算安定转化量. ④微载体培养细胞生长形态观察及计数：于细胞培养1，5，7，9d，在搅拌的状态下均匀取样于倒置显微镜下观察细胞生长情况并摄影. 每隔1d取样以结晶紫法计数细胞密度. 绘制生长曲线. ⑤微载体培养细胞扫描电镜观察：于培养7d在均匀的状态下取细胞培养样品，尽量去除培养基，PBS清洗3次，加20g/L的戊二醛固定30min，PBS清洗3次，10g/L锇酸固定30min，接着用500mL/L，700mL/L，800mL/L，900mL/L，1000mL/L，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ液的丙酮进行梯度脱水各10min，再用乙酸异戊酯置换4h以上，用日本的Hitachi HCP-2CO2临界干燥器干燥后，真空喷溅铂金离子，用日本的S450扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影.
, 百拇医药
2 结果
2.1 CL-1微载体培养的生长曲线 见(图1). 微载体培养时，细胞生长3d后加快，7d达最高峰，为2.16×109/L，9d后细胞密度有所下降，为1.92×109/L.
图1 微载体培养CL-1生长曲线
2.2 细胞生长形态 ①倒置显微镜下观察结果：d1可见50%以上的微载体都附着有细胞，并开始铺展(图2)，d5 80%以上的微载体上基本上长满了细胞，高倍镜下可见肝细胞呈多形性生长，并可见细胞分裂相(图3)，d7可见微载体间形成“桥联”生长现象，即微载体与微载体间借细胞联接在一起(图4). ②电子显微镜观察结果：扫描电镜下观察d7细胞呈半球状紧密贴附于微载体上(图5)，有如“仙人球状”，细胞表面的微绒毛清晰可见.
, 百拇医药
图2 微载体培养CL-1 24h光镜观察 ×120
图3 微载体培养CL-1 5d光镜观察 ×100
图4 微载体培养CL-1 7d光镜观察 ×200
图5 微载体培养CL-1 7d电镜观察 ×950
2.3 培养细胞功能 ①微载体培养CL-1上清的清蛋白合成量随时间变化的曲线见图6. 微载体培养时，CL-1的清蛋白分泌量于d7最高可达78μg. ②微载体培养CL-1上清安定转化的量随时间变化的曲线见图7. 安定转化量d7最高，可达619μg.
, 百拇医药
图6 微载体培养CL-1人清蛋白合成量.
图7 微载体培养CL-1安定转化量.
3 讨论
目前，体外人工肝的研究趋势是进行组合性生物人工肝的研究. 而组合性人工肝中用以提供体外肝功能的生物材料——高密度培养的具有高分化肝特异性功能的肝细胞的研究是当前人工肝研究中的热点之一. 由于在体外培养时，原代正常肝细胞难以维持其生长及功能[5]，而人肝细胞系是有肝功能活性生物材料的来源之一. 国内的人肝细胞系较多，部分肝细胞系保留了原代肝细胞的部分功能. 国外已有使用确立的人肝细胞系作为组合性人工肝生物材料的报道. Sussman et al[2]建立的人肝细胞系C3A，组织学来源于人肝母细胞瘤，具有稳定的高分化肝功能. 他使用C3A细胞在中空纤维中高密度培养，总量达到200g，成功地进行了肝衰动物模型和一例肝衰患者的救治.
, 百拇医药
作为组合性人工肝的生物材料，培养肝细胞不但要具有一定的肝特异性功能而且要达到一定的数量(即109水平)[4]. 普通的培养技术难以达到此要求. 鉴于微载体细胞培养技术具有表面积/体积比值大的特点，在较低小的培养体积中为细胞生长提供了巨大的表面积. 由于微载体培养大大增加了培养系统中细胞生长的表面积(每克Cytodex-3微载体的表面积是4600cm2)，而随着培养面积的增加，细胞数量也相应增加. 我们采用100mL Bellco搅拌培养瓶以5g/L的微载体浓度，当接种100mL浓度为2×108/L的细胞悬液进行培养7d时获得的最大细胞产量为2×108个，清蛋白合成量达78μg，安定转化量约619μg. 我们首次采用微载体培养具有高分化功能的人肝细胞系，大大提高了细胞培养密度，有望作为体外组合性人工肝的生物材料.
作者简介：
徐小平，男，1971-09-03生，江苏省高淳县人，汉族. 1994年第一军医大学临床医疗系本科毕业，1997年第一军医大学外科学硕士，主要从事人工肝基础与临床应用研究，发表论文4篇.
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，No.39570212.
通讯作者 徐小平，510282，第一军医大学珠江医院急诊科，广东省广州市工业大道中253号.
*Project supported by the National Natural Science foundation of China, No.39570212.
Correspondence to:XU Xiao-Ping, Department of Emergency, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
4 参考文献
, http://www.100md.com
[1] Sussman NL, Finegold MJ, Kelly JH. Recovery from syncytial giant cell (SGCH) hepatitis following treatment with an extracorporeal liver assist device (ELAD). Hepatology, 1992;15:51A
[2] Sussman NL, Chong MG, Koussayer T. Reversal of fulminant hepatic failure using extracorporeal liver assist device. Hepatology, 1992;16:60-65
[3] 薛国柱，刘冰艳，高毅，杨继震. 体外培养肝细胞微量合成人白蛋白的测定方法. 第一军医大学学报，1998；18：122
[4] Nyberg SL,. Peshwa MV, Payne WD. Evolution of the bioartificial liver: the need for randomized clinical trials. J Am Surg, 1993;166:512-521
[5] Kasai S, Sawa M, Mito M. Is the biological artificial liver clinically applicable A historic review of biological artificial liver support systems. Artif Organs, 1994;18:348-354
收稿日期 1998-05-05, 百拇医药(徐小平1 高 毅2 杨继震2)