慢性肝炎及肝硬化患者血浆一氧化氮与内皮素和丙氨酸转氨酶相互关系的研究
作者：曾令兰 郑曲波 罗端德 李淑莉
单位：同济医科大学附属协和医院传染病教研室(武汉 430022)
关键词：慢性乙型肝炎；活动性肝硬化；一氧化氮；内皮素；丙氨酸转氨酶
临床消化病杂志990305 摘 要 目的：为观察慢性肝炎及肝硬化患者血浆一氧化氮(NO)与内皮素1(ET-1)和丙氨酸转氨酶(ALT)的水平，并分析其相关性。方法：取慢性乙型肝炎及活动性肝硬化患者血浆，用镉柱法还原NO-3，重氮法测NO-2，计算血浆中原有及NO-3还原后NO-2总和(NO-2/NO-3)，放免法测ET-1和赖氏法测定ALT。结果：慢性肝炎轻度(原慢迁肝)、慢性肝炎中度(原慢活肝)及活活动性肝硬化患者血浆NO-2/NO-3分别为21.92±11.65μmol/L、33.16±11.89μmol/L和58.45±27.34μmol/L。ET-1分别为：56.85±23.43ng/L、98.45±44.67ng/L和109.83±49.28ng/L，ALT各自为87.60±32.50u、216.50±98.50u、228.40±156.20iu。与正常对照组比较，慢肝中度及活动性肝硬化患者NO-2/NO-3及ET-1水平升高较显著(P<0.05-0.01)，且呈正相关，慢肝中度与活动性肝硬化患者NO与ALT水平亦呈正相关。结论：慢性乙型肝炎及活动性肝硬化患者内源性NO水平随病情进展而升高，并与ET和ALT水平有一定的相关性。
, 百拇医药
Study on the Correlation of Plasma NO, ET-1 and ALT in Patients with Chronic Hepatitis and Cirrosis
Zeng Ling-lan, Zheng Qu-bo, Luo Duan-de, et al
Department of Infectious Disease, Union Hospital, Tongji Medical University
Abstract Purpose: To observe the leveis of plasma NO, ET-1 and ALT in chronic hepatitis B and active cirrhotic patients and analyse their correlation. Methods: NO-3 was restored with cadmium column assay and NO-2 was detected with leavy nitrogen assay. The primitive NO-3 and total restored NO-2(NO-3/NO-2) in plasma of patients with chronic hepatitis and cirrhosis as well as ET-1 with radioimmunology, ALT with Lai's assay were determinated. Results: The leveis of plasma NO-2/NO-3 in chronic persistent hepatitis, chronic active hepatitis and active cirrhosis were 21.92±11.65 μmol/L、33.16±11.89 μmol/L and 58.45±27.34 μmol/L respectively. The level of ET-1 were corresponding 56.85±23.43 ng/L、98.45±44.67 ng/L and 109.83±49.28 ng/L， and the leveis of ALT were 87.60±32.50 u,216.50±98.50 u,228.40±156.20 u respectively. Comparing with normal control group, the leveis of NO-2/NO-3 and ET-1 in chronic active hepatitis and active cirrhosis were significantly increased (P<0.05-0.01). There were positive correiation between NO and ALT, ET-1 and ALT in patients with chronic active hepatitis and active cirrhosis, respectively. Conclusion: It was suggested that both level elevation of NO and ET-1 are close reated with injury degree of liver function.
, 百拇医药
Key words Chronic hepatitis B Active hepatic cirrhosis Nitric oxide Endothelin ALT
一氧化氮(Nitric oxide,ON)是近年来才逐渐被认识有多种生物学作用的小分子物质。它是具有一种自由基结构的不稳定分子，在体内的半衰期约1～5秒，迅速还原为稳定的终产物硝酸盐及亚硝酸盐(NO-2/NO-3)，故一般通过研究NO-2/NO-3来了解体内NO水平。目前，不少学者认为NO水平与肝脏疾病程度有关。我们对本院收治的慢性乙肝及活动性肝硬化患者进行了NO、ET及ALT水平的检测，并分析其相关性。
1 材料与方法
1.1 一般资料
, http://www.100md.com
全部病例为本院1994年11月～1996年2月收治的住院患者，乙肝病毒标志物(HBVM)阳性共116例，年龄16～58岁，平均34岁；男85例，女31例；其中慢性肝炎轻度(原慢迁肝)35例，慢性肝炎中度(原慢活肝)43例，活动性肝硬化38例。诊断及分度标准符合1995年北京全国肝炎防治会议制订的标准。
1.2 方法
1.2.1 病例选择：选择新入院符合上述诊断标准的病例，并排除肝外疾患，且1周内未用过含硝酸盐及亚硝酸盐的食物及药物。
1.2.2 标本收集：NO标本采集，采清晨空腹静脉血(与ET-1同时)2ml，立即离心取血浆0.5ml-20℃冻存待检。ET-1血样采集，采静脉血2ml置于含10%EDTA2 Na 30μl和400u抑肽酶的试管中，混匀，4℃，3000r/min离心10分钟，分离血浆，-20℃保存待测。
, http://www.100md.com
1.2.3 检测方法：NO-2/NO-3(间接反应NO水平)测定采用镉柱法还原NO-3，重氮法测定NO-2[1]，计算本身所含的NO-2及NO-3过柱还原后产生的NO-2/NO-3。脱蛋白采用0.5mmol/L NaOH及10% ZnSO4，过柱后分别加入1%对氨基苯磺酰胺、0.1%萘基乙二胺、2.5%磷酸，定容量至5ml，于波长540nm处比色，与标准曲线对照，读取NO-2/NO-3的μmol值。ET-1检测，采用放免法直接测定血浆ET-1浓度。ET-1放免药盒购自中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所。按说明书操作。
, 百拇医药
1.2.4： 以20例健康人血液作对照。
1.2.5 对结果进行t检验及相关回归分析。
2 结 果
2.1 与对照组比较，慢肝轻度NO-2/NO-3及ET-1水平均无显著变化(P>0.05)，而慢肝中度及活动性肝硬化的NO及ET-1水平与对照组相比均显著升高(P<0.01)，且活动性肝硬化较慢肝中度升高更为显著(P<0.01)(附表)
附表 各组NO-2/NO-3及ET-1、ALT结果 组 别
n
NO-2/NO-3(μmol/L)
, http://www.100md.com
ET-1(ng/L))
ALT(u/L)
慢肝轻度组
35
21.92±11.65
56.85±23.43
87.60±32.50*
慢肝中度组
43
33.16±11.89*
98.45±44.67*
, http://www.100md.com
216.50±98.50**
肝硬化组
38
58.45±27.34**
109.83±49.28**
228.40±156.20**
对照组
20
18.94±8.27
48.94±16.76
25.10±10.20
, http://www.100md.com
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01
2.2 慢性肝炎和肝硬化各组之间比较，慢肝轻度组NO-2/NO-3和ET-1与慢肝中度组比较P均<0.05，ALT P<0.01，慢肝轻度组与肝硬化组比较NO-2/NO-3，ET-1 P均<0.01，ALT P<0.05。慢肝中度组与肝硬化组比较NO-2/NO-3，ET-1 P均<0.05，ALT>0.05。
2.3 慢肝中度组及活动性肝硬化组NO与ET-1水平呈正相关，相关系数分别为0.79和0.84(P均<0.05)。慢肝中度组及活动性肝硬化组NO与ALT水平亦呈正相关，相关系数分别为0.89和0.78(P均<0.05)。
, 百拇医药
3 讨 论
近年来已证实，所谓血管内皮舒张因子(EDRF)，其本质就是NO[2]。许多细胞均能通过左旋精氨酸(LArg)途径合成NO。合成NO的酶有两种，即原生酶和诱生酶。原生酶合成的NO有舒张血管、传递信息、抑制血小板聚积等作用，而诱生酶合成的NO与免疫及细胞毒有关。肝细胞内主要含诱生酶。干扰素(IFN)、白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)和内毒素(LPS)等可诱导肝细胞产生大量的NO[3，4]。ET是迄今为止发现的一种最强的血管收缩的生物活性肽，主要由血管内皮细胞合成。有研究表明，ET-1作用于肝窦前平滑肌细胞和储脂细胞而引起门脉高压，肝血窦收缩，肝脏体积缩小[5]。
本研究显示，尽管NO与ET二者针对血管内皮的作用是相反的，但随着肝炎的病情进展，NO、ET水平均呈逐渐升高。慢肝轻度患者二者升高不显著，中度患者则有明显升高，而到活动性肝硬化时升高更为显著。NO的升高与ET水平呈正相关，说明NO和ET二者水平的升高均与肝脏功能的损伤程度有关。此外NO的升高还与ALT水平呈正相关，无论NO的诱生机制如何，从其与ALT的关系来看，似乎NO能够或者说是更能早期准确地反映慢性肝炎的病变程度。在慢活肝时免疫功能紊乱，可能因此而导致IL-1、TNF等细胞因子的升高，从而刺激肝脏产生NO。对于活动性肝硬化，除上述免疫因素外，还能从门静脉吸收大量LPS诱导肝细胞产生大量NO。而上述各种因素同时刺激血管内皮分泌大量的ET。
, http://www.100md.com
NO本身对肝细胞是起损伤还是保护作用，仍是一个有争论的问题。有人认为，NO通过抑制细胞代谢[6]或通过免疫损伤等[7]途径损伤肝细胞。也有人认为[8，9]，肝炎发展过程中，首先是LPS、TNF、IL-1等升高，然后才在这些因素的诱导下产生NO，发挥其舒张血管、抑制血小板聚积、灭活氧自由基等功能，从而起到改善微循环，减少肝脏缺血坏死，保护肝细胞等作用，所以认为NO产生是机体一种保护性反应。关于慢性肝炎时NO升高的因果关系，尚有待进一步研究。
参考文献
1 Green LC, Wagner DA, Glogowski J, et al. Analysis of nitrate, and [15 N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem,1982,126∶131.
, http://www.100md.com
2 Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. A pathway for the regulation of cell function and communication. Biochem Pharmacol,1989,38∶1709.
3 Curran RD, Billiar TR, MStuehr DJ, et al. Multiple cytokines are required to induce hepatocyte nitric oxide production and inhibit total protien synthesis. Ann Surg,1990,212∶462.
4 Stadler J, Billiar TR, Curran RD, et al. Effects of exogenous and endogenous nitric oxide on mitochondrial of rat hepatocytes. Am J Physiol,1991,260∶910.
, http://www.100md.com
5 唐世刚，万克清，欧敏生.重型肝炎患者血浆内皮素的水平及其临床意义.中华传染病杂志，1996，8(14)∶177.
6 Billiar TR, Curran RD, Stuehr DJ, et al. An L-arginine-dependent mechanism mediates kupffer cell inhibition of hepatocyte protien synthesis in vitro. J Exp Med,1989,169∶1467.
7 Hibbs JB, Taintor RR, Vavrin Z, et al. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochem Boiphys Res Commun,1988,157∶87.
8 Harbrecht BG, Billiar TR, Stadler J, et al. Nitric oxide synthesis serves to reduce hepatic damage during acute murine endotoxemia. Crit Care Med,1992,20∶1568.
9 Smith SR, Calzetta A, Bankowski J, et al. Lipopolysaccharide-induced cytokine production and mortality in mice treated with corynebactrium parvum. J Leuk Biol,1993,51∶23.
(1999 03 06收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院传染病教研室(武汉 430022)
关键词：慢性乙型肝炎；活动性肝硬化；一氧化氮；内皮素；丙氨酸转氨酶
临床消化病杂志990305 摘 要 目的：为观察慢性肝炎及肝硬化患者血浆一氧化氮(NO)与内皮素1(ET-1)和丙氨酸转氨酶(ALT)的水平，并分析其相关性。方法：取慢性乙型肝炎及活动性肝硬化患者血浆，用镉柱法还原NO-3，重氮法测NO-2，计算血浆中原有及NO-3还原后NO-2总和(NO-2/NO-3)，放免法测ET-1和赖氏法测定ALT。结果：慢性肝炎轻度(原慢迁肝)、慢性肝炎中度(原慢活肝)及活活动性肝硬化患者血浆NO-2/NO-3分别为21.92±11.65μmol/L、33.16±11.89μmol/L和58.45±27.34μmol/L。ET-1分别为：56.85±23.43ng/L、98.45±44.67ng/L和109.83±49.28ng/L，ALT各自为87.60±32.50u、216.50±98.50u、228.40±156.20iu。与正常对照组比较，慢肝中度及活动性肝硬化患者NO-2/NO-3及ET-1水平升高较显著(P<0.05-0.01)，且呈正相关，慢肝中度与活动性肝硬化患者NO与ALT水平亦呈正相关。结论：慢性乙型肝炎及活动性肝硬化患者内源性NO水平随病情进展而升高，并与ET和ALT水平有一定的相关性。
, 百拇医药
Study on the Correlation of Plasma NO, ET-1 and ALT in Patients with Chronic Hepatitis and Cirrosis
Zeng Ling-lan, Zheng Qu-bo, Luo Duan-de, et al
Department of Infectious Disease, Union Hospital, Tongji Medical University
Abstract Purpose: To observe the leveis of plasma NO, ET-1 and ALT in chronic hepatitis B and active cirrhotic patients and analyse their correlation. Methods: NO-3 was restored with cadmium column assay and NO-2 was detected with leavy nitrogen assay. The primitive NO-3 and total restored NO-2(NO-3/NO-2) in plasma of patients with chronic hepatitis and cirrhosis as well as ET-1 with radioimmunology, ALT with Lai's assay were determinated. Results: The leveis of plasma NO-2/NO-3 in chronic persistent hepatitis, chronic active hepatitis and active cirrhosis were 21.92±11.65 μmol/L、33.16±11.89 μmol/L and 58.45±27.34 μmol/L respectively. The level of ET-1 were corresponding 56.85±23.43 ng/L、98.45±44.67 ng/L and 109.83±49.28 ng/L， and the leveis of ALT were 87.60±32.50 u,216.50±98.50 u,228.40±156.20 u respectively. Comparing with normal control group, the leveis of NO-2/NO-3 and ET-1 in chronic active hepatitis and active cirrhosis were significantly increased (P<0.05-0.01). There were positive correiation between NO and ALT, ET-1 and ALT in patients with chronic active hepatitis and active cirrhosis, respectively. Conclusion: It was suggested that both level elevation of NO and ET-1 are close reated with injury degree of liver function.
, 百拇医药
Key words Chronic hepatitis B Active hepatic cirrhosis Nitric oxide Endothelin ALT
一氧化氮(Nitric oxide,ON)是近年来才逐渐被认识有多种生物学作用的小分子物质。它是具有一种自由基结构的不稳定分子，在体内的半衰期约1～5秒，迅速还原为稳定的终产物硝酸盐及亚硝酸盐(NO-2/NO-3)，故一般通过研究NO-2/NO-3来了解体内NO水平。目前，不少学者认为NO水平与肝脏疾病程度有关。我们对本院收治的慢性乙肝及活动性肝硬化患者进行了NO、ET及ALT水平的检测，并分析其相关性。
1 材料与方法
1.1 一般资料
, http://www.100md.com
全部病例为本院1994年11月～1996年2月收治的住院患者，乙肝病毒标志物(HBVM)阳性共116例，年龄16～58岁，平均34岁；男85例，女31例；其中慢性肝炎轻度(原慢迁肝)35例，慢性肝炎中度(原慢活肝)43例，活动性肝硬化38例。诊断及分度标准符合1995年北京全国肝炎防治会议制订的标准。
1.2 方法
1.2.1 病例选择：选择新入院符合上述诊断标准的病例，并排除肝外疾患，且1周内未用过含硝酸盐及亚硝酸盐的食物及药物。
1.2.2 标本收集：NO标本采集，采清晨空腹静脉血(与ET-1同时)2ml，立即离心取血浆0.5ml-20℃冻存待检。ET-1血样采集，采静脉血2ml置于含10%EDTA2 Na 30μl和400u抑肽酶的试管中，混匀，4℃，3000r/min离心10分钟，分离血浆，-20℃保存待测。
, http://www.100md.com
1.2.3 检测方法：NO-2/NO-3(间接反应NO水平)测定采用镉柱法还原NO-3，重氮法测定NO-2[1]，计算本身所含的NO-2及NO-3过柱还原后产生的NO-2/NO-3。脱蛋白采用0.5mmol/L NaOH及10% ZnSO4，过柱后分别加入1%对氨基苯磺酰胺、0.1%萘基乙二胺、2.5%磷酸，定容量至5ml，于波长540nm处比色，与标准曲线对照，读取NO-2/NO-3的μmol值。ET-1检测，采用放免法直接测定血浆ET-1浓度。ET-1放免药盒购自中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所。按说明书操作。
, 百拇医药
1.2.4： 以20例健康人血液作对照。
1.2.5 对结果进行t检验及相关回归分析。
2 结 果
2.1 与对照组比较，慢肝轻度NO-2/NO-3及ET-1水平均无显著变化(P>0.05)，而慢肝中度及活动性肝硬化的NO及ET-1水平与对照组相比均显著升高(P<0.01)，且活动性肝硬化较慢肝中度升高更为显著(P<0.01)(附表)
附表 各组NO-2/NO-3及ET-1、ALT结果 组 别
n
NO-2/NO-3(μmol/L)
, http://www.100md.com
ET-1(ng/L))
ALT(u/L)
慢肝轻度组
35
21.92±11.65
56.85±23.43
87.60±32.50*
慢肝中度组
43
33.16±11.89*
98.45±44.67*
, http://www.100md.com
216.50±98.50**
肝硬化组
38
58.45±27.34**
109.83±49.28**
228.40±156.20**
对照组
20
18.94±8.27
48.94±16.76
25.10±10.20
, http://www.100md.com
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01
2.2 慢性肝炎和肝硬化各组之间比较，慢肝轻度组NO-2/NO-3和ET-1与慢肝中度组比较P均<0.05，ALT P<0.01，慢肝轻度组与肝硬化组比较NO-2/NO-3，ET-1 P均<0.01，ALT P<0.05。慢肝中度组与肝硬化组比较NO-2/NO-3，ET-1 P均<0.05，ALT>0.05。
2.3 慢肝中度组及活动性肝硬化组NO与ET-1水平呈正相关，相关系数分别为0.79和0.84(P均<0.05)。慢肝中度组及活动性肝硬化组NO与ALT水平亦呈正相关，相关系数分别为0.89和0.78(P均<0.05)。
, 百拇医药
3 讨 论
近年来已证实，所谓血管内皮舒张因子(EDRF)，其本质就是NO[2]。许多细胞均能通过左旋精氨酸(LArg)途径合成NO。合成NO的酶有两种，即原生酶和诱生酶。原生酶合成的NO有舒张血管、传递信息、抑制血小板聚积等作用，而诱生酶合成的NO与免疫及细胞毒有关。肝细胞内主要含诱生酶。干扰素(IFN)、白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)和内毒素(LPS)等可诱导肝细胞产生大量的NO[3，4]。ET是迄今为止发现的一种最强的血管收缩的生物活性肽，主要由血管内皮细胞合成。有研究表明，ET-1作用于肝窦前平滑肌细胞和储脂细胞而引起门脉高压，肝血窦收缩，肝脏体积缩小[5]。
本研究显示，尽管NO与ET二者针对血管内皮的作用是相反的，但随着肝炎的病情进展，NO、ET水平均呈逐渐升高。慢肝轻度患者二者升高不显著，中度患者则有明显升高，而到活动性肝硬化时升高更为显著。NO的升高与ET水平呈正相关，说明NO和ET二者水平的升高均与肝脏功能的损伤程度有关。此外NO的升高还与ALT水平呈正相关，无论NO的诱生机制如何，从其与ALT的关系来看，似乎NO能够或者说是更能早期准确地反映慢性肝炎的病变程度。在慢活肝时免疫功能紊乱，可能因此而导致IL-1、TNF等细胞因子的升高，从而刺激肝脏产生NO。对于活动性肝硬化，除上述免疫因素外，还能从门静脉吸收大量LPS诱导肝细胞产生大量NO。而上述各种因素同时刺激血管内皮分泌大量的ET。
, http://www.100md.com
NO本身对肝细胞是起损伤还是保护作用，仍是一个有争论的问题。有人认为，NO通过抑制细胞代谢[6]或通过免疫损伤等[7]途径损伤肝细胞。也有人认为[8，9]，肝炎发展过程中，首先是LPS、TNF、IL-1等升高，然后才在这些因素的诱导下产生NO，发挥其舒张血管、抑制血小板聚积、灭活氧自由基等功能，从而起到改善微循环，减少肝脏缺血坏死，保护肝细胞等作用，所以认为NO产生是机体一种保护性反应。关于慢性肝炎时NO升高的因果关系，尚有待进一步研究。
参考文献
1 Green LC, Wagner DA, Glogowski J, et al. Analysis of nitrate, and [15 N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem,1982,126∶131.
, http://www.100md.com
2 Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. A pathway for the regulation of cell function and communication. Biochem Pharmacol,1989,38∶1709.
3 Curran RD, Billiar TR, MStuehr DJ, et al. Multiple cytokines are required to induce hepatocyte nitric oxide production and inhibit total protien synthesis. Ann Surg,1990,212∶462.
4 Stadler J, Billiar TR, Curran RD, et al. Effects of exogenous and endogenous nitric oxide on mitochondrial of rat hepatocytes. Am J Physiol,1991,260∶910.
, http://www.100md.com
5 唐世刚，万克清，欧敏生.重型肝炎患者血浆内皮素的水平及其临床意义.中华传染病杂志，1996，8(14)∶177.
6 Billiar TR, Curran RD, Stuehr DJ, et al. An L-arginine-dependent mechanism mediates kupffer cell inhibition of hepatocyte protien synthesis in vitro. J Exp Med,1989,169∶1467.
7 Hibbs JB, Taintor RR, Vavrin Z, et al. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochem Boiphys Res Commun,1988,157∶87.
8 Harbrecht BG, Billiar TR, Stadler J, et al. Nitric oxide synthesis serves to reduce hepatic damage during acute murine endotoxemia. Crit Care Med,1992,20∶1568.
9 Smith SR, Calzetta A, Bankowski J, et al. Lipopolysaccharide-induced cytokine production and mortality in mice treated with corynebactrium parvum. J Leuk Biol,1993,51∶23.
(1999 03 06收稿), 百拇医药