幽门螺杆菌感染与胃粘膜上皮细胞凋亡、增殖及p53基因表达探讨
作者：李子俊 林秋雄 聂玉强 陈颜芳 王启仪
单位：广东省人民医院消化内科(广州 510080)
关键词：幽门螺杆菌；细胞凋亡；增殖；p53
临床消化病杂志990302 摘 要 目的：研究幽门螺杆菌(Helieobacter pylori,HP)感染后胃粘膜组织p53基因表达改变和细胞凋亡及增殖的变化。方法：采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组织化学方法对HP阳性者根除前后及HP阴性者的胃粘膜上皮组织中的细胞凋亡、增殖及p53蛋白表达状态进行原位观察和比较。结果：慢性活动性胃炎HP感染者细胞凋亡指数和增殖指数显著高于不伴HP感染者(P<0.01)，根除前后比较差异亦显著(P<0.01)。HP阳性组突变型p53阳性率显著高于HP阴性组(P<0.05)。在HP相关性胃炎中，p53阳性者的细胞增殖指数显著高于p53阴性者(P<0.05)。结论：HP可引起胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖改变，突变型p53异常表达可能参与此过程。说明HP与胃癌发生动态过程有关系。
, 百拇医药
Apoptosis and Proliferation in Gastric Epithelinl Cells is Induced by Helicobacter Pylori and Accompanied by Increased Expression of p53
Li Zi-jun， Lin Qu-xong, Nei Yu-qiang, et al
Guangdong Provincial People Hospital
Abstract Purpose: To investigate the expression of p53 protein and its association with apoptosis and proliferation of gastric epithelial cells in helicobacter pylori(HP)-related gastritis. Method: Using immunohistochemical staining and terminal deoxynuclectidyl transferase mediated dUTP nick and labelling(TUNEL) technique. We observed p53 protein expression and the change of gastric epithelial apoptotic index (AI) and proliferative index (PI) in HP positive gastritis before and after anti-HP treatment and in HP negative gastritis. Results: AI and PI in HP postive gastritis were significantly higher than in HP negative gastritis(P<0.01). After the eradication of HP, AI and PI are significantly lower than before (P<0.01). The positive rate of p53 protein expression in HP positive gastritis was higher than in HP negative gastritis (P<0.05). In HP-related gastritis, the PI in p53 positive group also was higher than in p53 negative group(P<0.05). Conclusion: HP could induce cell proliferation and apoptosis in paralle, and accompanied with the increase of mutant p53 protein expression. These illustrated a connection between HP and gastric cancer
, 百拇医药
Key words Helicobacter pylori Cell apoptosis Proliferation p53
幽门螺杆菌(HP)是人胃内常见的慢性感染菌。流行病学研究表明HP与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌发生有关。世界卫生组织已将HP定为首要致癌因子。但究其致癌机制尚不清楚[1]。细胞凋亡是在基因调控下细胞的自主性死亡，与细胞增殖一起，维持生理状态下胃组织细胞数量的动态平衡。当细胞凋亡和增殖不平衡时，则可能导致肿瘤的发生[2]。本研究探讨HP与细胞凋亡和增殖的关系以及突变型p53基因表达的改变。
1 材料和方法
1.1 对象：经胃镜及病理证实为慢性活动性胃炎患者，共43例，其中HP阳性23例，HP阴性20例。活检采取胃粘膜标本行病理切片。HP检测采用快速尿素酶试验和病理WS银染色，两项阳性者为阳性，两项阴性者为阴性，单项阳性退出试验。对HP阳性者给予铋剂(0.24g，2次/d)、羟氨苄青霉素(0.5g，3次/d)、灭滴灵(0.2g，3次/d)三联药物进行治疗，疗程为2周。治疗结束后停药1个月。复查胃镜HP为阴性者视为根除。
, 百拇医药
1.2 细胞凋亡检测：采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记方法(TUNEL)检测凋亡细胞。简要步骤为胃镜活检标本石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K(20mg/L)处理，Tunel反应液37℃下作用1小时，中止和冲洗后用抗地戈辛复合物作用30分钟，DAB显色，甲基绿复染。细胞核为棕褐色颗粒者为阳性。每张切片计数200个细胞以上，每个标本观察4张切片，取平均值。细胞凋亡指数=凋亡细胞数/计数细胞总数×100%。凋亡试剂盒由德国Bochringer nennheim公司生产。
1.3 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色：用PCNA单克隆抗体进行免疫LSAB组化染色。抗体和LSAB试剂盒购自美国DAKO公司。操作按说明书进行，同时设立阳性及阴性对照。阳性结果为细胞核呈棕黄色颗粒状。
1.4 p53蛋白表达的检测：用鼠抗人p53单克隆抗体Do-7进行LSAB免疫组化染色，操作上按说明书进行。p53单抗(即用型)购自美国DAKO公司。阳性结果为细胞核呈棕黄色。
, 百拇医药
1.5 统计方法：计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，采用直线相关分析。
2 结 果
2.1 HP感染与胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的关系见表1。
表1 HP感染与胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖关系 组别
例数
凋亡指数(%x±s)
PCNA指数(%x±s)
HP阴性
20
4.12±1.14
10.21±4.34
, http://www.100md.com
HP阳性
23
17.18±7.02*
21.60±6.05*
*与HP阴性组比较，P<0.01
2.2 根除HP前后胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的变化见表2。表2 HP根除前后胃粘膜上皮细胞凋亡指数及PCNA指数的变化 组 别
例数
凋亡指数(%x±s)
PCNA指数(%x±s)
HP根除组
, 百拇医药
15
治疗前
16.33±4.45
20.26±7.16
治疗后
4.16±1.38*
9.47±6.20*
HP未根除组
8
治疗前
14.57±6.14
23.29±11.30
, 百拇医药
治疗后
15.45±5.72* *
19.89±9.32**
*治疗前后比较，P<0.01 **治疗前后比较，P>0.05
2.3 HP感染胃粘膜组织中p53蛋白表达与细胞凋亡、增殖的关系，见表3。HP阳性者的p53阳性率为52.17%，明显高于HP阴性组(25%)，两组比较差异显著(P<0.05)。表3 HP感染胃粘膜组织中p53蛋白表达与细胞凋亡和增殖的关系 组 别
例数
凋亡指数(%x±s)
PCNA指数(%x±s)
, 百拇医药
HP阳性
p53+
12
14.78±7.15
20.57±7.21
p53-
11
17.17±6.32*
13.14±8.64**
HP阴性
p53+
5
, http://www.100md.com
2.50±1.40
10.40±4.20
p53-
15
5.84±1.77**
9.78±4.99*
*p53+与p53-者比较，P>0.05
**p53+与p53-者比较，P<0.05
3 讨 论
细胞凋亡是指细胞在基因调控下，自主的按照一定程序发生的死亡，是不同于细胞坏死的死亡方式[3]。正常生理状态下，细胞凋亡用来清除机体衰老和受损的细胞，并与细胞增殖维持着组织中细胞总数的动态平衡。倘若细胞凋亡受到一些异常信号作用时，导致本应凋亡的细胞“非法”存活，结果细胞凋亡与增殖之间的平衡被破坏，此是肿瘤发生的细胞学基础[4]。
, http://www.100md.com
本研究采用TUNEL技术和PCNA免疫组化染色方法检测HP相关性胃炎的胃粘膜组织细胞的凋亡和增殖的改变，结果显示：HP感染患者的胃粘膜中，细胞凋亡指数和增殖指数显著高于无HP感染者(P<0.01)。原位观察HP阴性者胃粘膜组织切片，发现仅少量凋亡细胞和增殖细胞散在分布于粘膜表层，而在HP阳性者胃粘膜中，见凋亡细胞和增殖细胞分布于粘膜全层，并深入腺体的底部和固有膜中。根除HP后，细胞凋亡和增殖变化与治疗前比较差异显著(P<0.01)，与无HP感染组比较差异不显著(P>0.05)。而未根除HP者治疗前后比较差异不显著(P>0.05)。由此说明，HP感染是引起胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖改变的重要机制之一。细胞凋亡与细胞增殖间呈明显正相关，但何者为先，还是HP感染同时诱发了细胞增殖和凋亡，尚不清楚。
关于HP感染如何引起细胞凋亡和增殖，推测可能与HP产生毒素(CagA,VacA等)，HP尿素酶分解尿素产氨，HP感染后炎症反应中释放细胞因子、氧自由基及产生NO，胃腔中Vit C含量减少等有关。另外，在基因表达方面发现癌基因(bcl-2,ras)和肿瘤抑制基因(p53)等亦参与这一过程[4]。本研究同时采用LASB法检测HP感染同一胃粘膜组织中突变型p53蛋白表达，结果发现HP阳性组p53阳性率明显高于HP阴性组(P<0.05)；p53阳性者细胞增殖指数显著高于p53阴性者(P<0.05),细胞凋亡指数略低于p53阴性者(P>0.05)。正常情况下，野生型p53具有促进细胞凋亡的作用，而突变型p53具有抑制细胞凋亡的作用。当突变p53蛋白表达增加时，则可导致细胞凋亡停滞，进入细胞高增殖状态[5]。这与本研究p53阳性组细胞增殖指数增加结果相一致；但凋亡指数下降不明显。说明p53基因过表达可能参与HP感染引起胃粘膜上皮细胞动力学过程变化的调节。当细胞过度增殖时，DNA合成旺盛，则易受体内、外源致癌因子作用而发生基因突变，缺失，最后导致细胞癌变[5]。
, 百拇医药
总之，老虑到HP感染的长期持续性，不断地诱导细胞凋亡和刺激细胞过度增殖，或引起抑癌基因突变，均有增加细胞癌变的易感性作用，这在胃癌的发生动态过程中具有重要的意义。因此，深入研究HP感染诱导胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的作用机制，将有助于进一步认识HP感染与胃癌发生的关系。
参考文献
1 胡伏莲.重视幽螺杆菌与上胃肠道疾病关系的研究.中华医学杂志，1998，78∶483.
2 Chen G, Sordillo EM, Ramey MG, et al. Apoptosis in gastric eithelial cells is induced by helicobacter pylori and accompanied by increased expression of BAK. Biohemical and Biophysical Research Communications,1997,239∶626-632.
, 百拇医药
3 Que FG, Gores GJ. Cell death by apoptosis: basic concepts and disease relevance for the gastroenterologist, Gastroenterology,1996,110∶1238.
4 萧树东，刘文愈.幽门螺杆菌感染与胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡.中华内科杂志，1997，36∶219.
5 Jones NL, Shannon PT, Cutz E, et al. Increase in proliferation and apoptosis of gastric epithelinl cells early in the natural history of helicobacter pylori infection. American Journal of Pathology，1997,15∶1695-1702.
(1998 10 08收稿), 百拇医药
单位：广东省人民医院消化内科(广州 510080)
关键词：幽门螺杆菌；细胞凋亡；增殖；p53
临床消化病杂志990302 摘 要 目的：研究幽门螺杆菌(Helieobacter pylori,HP)感染后胃粘膜组织p53基因表达改变和细胞凋亡及增殖的变化。方法：采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组织化学方法对HP阳性者根除前后及HP阴性者的胃粘膜上皮组织中的细胞凋亡、增殖及p53蛋白表达状态进行原位观察和比较。结果：慢性活动性胃炎HP感染者细胞凋亡指数和增殖指数显著高于不伴HP感染者(P<0.01)，根除前后比较差异亦显著(P<0.01)。HP阳性组突变型p53阳性率显著高于HP阴性组(P<0.05)。在HP相关性胃炎中，p53阳性者的细胞增殖指数显著高于p53阴性者(P<0.05)。结论：HP可引起胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖改变，突变型p53异常表达可能参与此过程。说明HP与胃癌发生动态过程有关系。
, 百拇医药
Apoptosis and Proliferation in Gastric Epithelinl Cells is Induced by Helicobacter Pylori and Accompanied by Increased Expression of p53
Li Zi-jun， Lin Qu-xong, Nei Yu-qiang, et al
Guangdong Provincial People Hospital
Abstract Purpose: To investigate the expression of p53 protein and its association with apoptosis and proliferation of gastric epithelial cells in helicobacter pylori(HP)-related gastritis. Method: Using immunohistochemical staining and terminal deoxynuclectidyl transferase mediated dUTP nick and labelling(TUNEL) technique. We observed p53 protein expression and the change of gastric epithelial apoptotic index (AI) and proliferative index (PI) in HP positive gastritis before and after anti-HP treatment and in HP negative gastritis. Results: AI and PI in HP postive gastritis were significantly higher than in HP negative gastritis(P<0.01). After the eradication of HP, AI and PI are significantly lower than before (P<0.01). The positive rate of p53 protein expression in HP positive gastritis was higher than in HP negative gastritis (P<0.05). In HP-related gastritis, the PI in p53 positive group also was higher than in p53 negative group(P<0.05). Conclusion: HP could induce cell proliferation and apoptosis in paralle, and accompanied with the increase of mutant p53 protein expression. These illustrated a connection between HP and gastric cancer
, 百拇医药
Key words Helicobacter pylori Cell apoptosis Proliferation p53
幽门螺杆菌(HP)是人胃内常见的慢性感染菌。流行病学研究表明HP与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌发生有关。世界卫生组织已将HP定为首要致癌因子。但究其致癌机制尚不清楚[1]。细胞凋亡是在基因调控下细胞的自主性死亡，与细胞增殖一起，维持生理状态下胃组织细胞数量的动态平衡。当细胞凋亡和增殖不平衡时，则可能导致肿瘤的发生[2]。本研究探讨HP与细胞凋亡和增殖的关系以及突变型p53基因表达的改变。
1 材料和方法
1.1 对象：经胃镜及病理证实为慢性活动性胃炎患者，共43例，其中HP阳性23例，HP阴性20例。活检采取胃粘膜标本行病理切片。HP检测采用快速尿素酶试验和病理WS银染色，两项阳性者为阳性，两项阴性者为阴性，单项阳性退出试验。对HP阳性者给予铋剂(0.24g，2次/d)、羟氨苄青霉素(0.5g，3次/d)、灭滴灵(0.2g，3次/d)三联药物进行治疗，疗程为2周。治疗结束后停药1个月。复查胃镜HP为阴性者视为根除。
, 百拇医药
1.2 细胞凋亡检测：采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记方法(TUNEL)检测凋亡细胞。简要步骤为胃镜活检标本石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K(20mg/L)处理，Tunel反应液37℃下作用1小时，中止和冲洗后用抗地戈辛复合物作用30分钟，DAB显色，甲基绿复染。细胞核为棕褐色颗粒者为阳性。每张切片计数200个细胞以上，每个标本观察4张切片，取平均值。细胞凋亡指数=凋亡细胞数/计数细胞总数×100%。凋亡试剂盒由德国Bochringer nennheim公司生产。
1.3 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色：用PCNA单克隆抗体进行免疫LSAB组化染色。抗体和LSAB试剂盒购自美国DAKO公司。操作按说明书进行，同时设立阳性及阴性对照。阳性结果为细胞核呈棕黄色颗粒状。
1.4 p53蛋白表达的检测：用鼠抗人p53单克隆抗体Do-7进行LSAB免疫组化染色，操作上按说明书进行。p53单抗(即用型)购自美国DAKO公司。阳性结果为细胞核呈棕黄色。
, 百拇医药
1.5 统计方法：计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，采用直线相关分析。
2 结 果
2.1 HP感染与胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的关系见表1。
表1 HP感染与胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖关系 组别
例数
凋亡指数(%x±s)
PCNA指数(%x±s)
HP阴性
20
4.12±1.14
10.21±4.34
, http://www.100md.com
HP阳性
23
17.18±7.02*
21.60±6.05*
*与HP阴性组比较，P<0.01
2.2 根除HP前后胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的变化见表2。表2 HP根除前后胃粘膜上皮细胞凋亡指数及PCNA指数的变化 组 别
例数
凋亡指数(%x±s)
PCNA指数(%x±s)
HP根除组
, 百拇医药
15
治疗前
16.33±4.45
20.26±7.16
治疗后
4.16±1.38*
9.47±6.20*
HP未根除组
8
治疗前
14.57±6.14
23.29±11.30
, 百拇医药
治疗后
15.45±5.72* *
19.89±9.32**
*治疗前后比较，P<0.01 **治疗前后比较，P>0.05
2.3 HP感染胃粘膜组织中p53蛋白表达与细胞凋亡、增殖的关系，见表3。HP阳性者的p53阳性率为52.17%，明显高于HP阴性组(25%)，两组比较差异显著(P<0.05)。表3 HP感染胃粘膜组织中p53蛋白表达与细胞凋亡和增殖的关系 组 别
例数
凋亡指数(%x±s)
PCNA指数(%x±s)
, 百拇医药
HP阳性
p53+
12
14.78±7.15
20.57±7.21
p53-
11
17.17±6.32*
13.14±8.64**
HP阴性
p53+
5
, http://www.100md.com
2.50±1.40
10.40±4.20
p53-
15
5.84±1.77**
9.78±4.99*
*p53+与p53-者比较，P>0.05
**p53+与p53-者比较，P<0.05
3 讨 论
细胞凋亡是指细胞在基因调控下，自主的按照一定程序发生的死亡，是不同于细胞坏死的死亡方式[3]。正常生理状态下，细胞凋亡用来清除机体衰老和受损的细胞，并与细胞增殖维持着组织中细胞总数的动态平衡。倘若细胞凋亡受到一些异常信号作用时，导致本应凋亡的细胞“非法”存活，结果细胞凋亡与增殖之间的平衡被破坏，此是肿瘤发生的细胞学基础[4]。
, http://www.100md.com
本研究采用TUNEL技术和PCNA免疫组化染色方法检测HP相关性胃炎的胃粘膜组织细胞的凋亡和增殖的改变，结果显示：HP感染患者的胃粘膜中，细胞凋亡指数和增殖指数显著高于无HP感染者(P<0.01)。原位观察HP阴性者胃粘膜组织切片，发现仅少量凋亡细胞和增殖细胞散在分布于粘膜表层，而在HP阳性者胃粘膜中，见凋亡细胞和增殖细胞分布于粘膜全层，并深入腺体的底部和固有膜中。根除HP后，细胞凋亡和增殖变化与治疗前比较差异显著(P<0.01)，与无HP感染组比较差异不显著(P>0.05)。而未根除HP者治疗前后比较差异不显著(P>0.05)。由此说明，HP感染是引起胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖改变的重要机制之一。细胞凋亡与细胞增殖间呈明显正相关，但何者为先，还是HP感染同时诱发了细胞增殖和凋亡，尚不清楚。
关于HP感染如何引起细胞凋亡和增殖，推测可能与HP产生毒素(CagA,VacA等)，HP尿素酶分解尿素产氨，HP感染后炎症反应中释放细胞因子、氧自由基及产生NO，胃腔中Vit C含量减少等有关。另外，在基因表达方面发现癌基因(bcl-2,ras)和肿瘤抑制基因(p53)等亦参与这一过程[4]。本研究同时采用LASB法检测HP感染同一胃粘膜组织中突变型p53蛋白表达，结果发现HP阳性组p53阳性率明显高于HP阴性组(P<0.05)；p53阳性者细胞增殖指数显著高于p53阴性者(P<0.05),细胞凋亡指数略低于p53阴性者(P>0.05)。正常情况下，野生型p53具有促进细胞凋亡的作用，而突变型p53具有抑制细胞凋亡的作用。当突变p53蛋白表达增加时，则可导致细胞凋亡停滞，进入细胞高增殖状态[5]。这与本研究p53阳性组细胞增殖指数增加结果相一致；但凋亡指数下降不明显。说明p53基因过表达可能参与HP感染引起胃粘膜上皮细胞动力学过程变化的调节。当细胞过度增殖时，DNA合成旺盛，则易受体内、外源致癌因子作用而发生基因突变，缺失，最后导致细胞癌变[5]。
, 百拇医药
总之，老虑到HP感染的长期持续性，不断地诱导细胞凋亡和刺激细胞过度增殖，或引起抑癌基因突变，均有增加细胞癌变的易感性作用，这在胃癌的发生动态过程中具有重要的意义。因此，深入研究HP感染诱导胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖的作用机制，将有助于进一步认识HP感染与胃癌发生的关系。
参考文献
1 胡伏莲.重视幽螺杆菌与上胃肠道疾病关系的研究.中华医学杂志，1998，78∶483.
2 Chen G, Sordillo EM, Ramey MG, et al. Apoptosis in gastric eithelial cells is induced by helicobacter pylori and accompanied by increased expression of BAK. Biohemical and Biophysical Research Communications,1997,239∶626-632.
, 百拇医药
3 Que FG, Gores GJ. Cell death by apoptosis: basic concepts and disease relevance for the gastroenterologist, Gastroenterology,1996,110∶1238.
4 萧树东，刘文愈.幽门螺杆菌感染与胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡.中华内科杂志，1997，36∶219.
5 Jones NL, Shannon PT, Cutz E, et al. Increase in proliferation and apoptosis of gastric epithelinl cells early in the natural history of helicobacter pylori infection. American Journal of Pathology，1997,15∶1695-1702.
(1998 10 08收稿), 百拇医药