抗生素、亚硝基胍处理吸水链霉菌FC904原生质体对雷帕霉素产量的影响
作者：强华 黄捷 陈贻锴 程元荣
单位：强 华 福建医科大学微生物学教研室(福州 350004)；黄 捷 程元荣 福建省微生物研究所(福州 350007)；陈贻锴 福建医科大学基因工程研究室(福州 350004)
关键词：吸水链霉菌；雷帕霉素；原生质体；诱变育种
福建医科大学学报990315 目的 选择抗生素和化学诱变剂处理雷帕霉素产生菌的原生质体，筛选高产菌株。 方法 分别用庆大霉素、丝裂霉素C、红霉素、亚硝基胍处理吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)原生质体，比较它们对雷帕霉素产量的影响，并筛选高产菌株。 结果 庆大霉素的处理效果较好，从庆大霉素处理株中筛选到高产菌株C14、C14-1，其雷帕霉素的摇瓶发酵水平(反相高效液相色谱法测定)分别比原始株提高36%,60%。 结论 用庆大霉素处理吸水链霉菌FC904原生质体是提高雷帕霉素产量的有效手段。
, 百拇医药
Effects on the Production of Rapamycin by the Treatment of Protoplasts of Streptomyces hygroscopicus FC904 with Antibiotics and Nitrous Guanidine
Qiang Hua1, Huang Jie2, Chen Yikai3，et al
(1.Department of Microbiology, Fujian Medical University, Fuzhou,350004
2.Fujian Institute of Microbiology, Fuzhou, 350007
3.Laboratory of Genetic Engineering, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
, 百拇医药
Objective To screen higher-producing strains by the treatment of protoplasts of S. hygroscopicus FC904 with antibiotics and nitrous guanidine(NTG). Methods Protoplasts of S.hygroscopicus FC904 were treated with gentamicin,erythromycin,mitomycin C or NTG respectively. Effects of these agents on rapamycin production were compared and the high yielding strains were screened. Results The treatment with gentamicin had a better effect on improving the production of rapamycin. Higher producing strains C14 and C14-1 were obtained from the gentamicin-treated strains with their RPM titer of broth(assayed by HPLC) increased by 36% and 60% respectively as compared with that of the original strain S.hygroscopicus FC904. Conclusion The treatment of S.hygroscopicus FC904 protoplasts with gentamicin is effective for improving the production of rapamycin.
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Key words Streptomyces hygroscopicus; rapamycin; protoplast; mutation breeding
雷帕霉素(rapamycin,RPM)是具有抗真菌、抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂，其免疫抑制作用比环孢菌素A、FK506等强，但对肾的毒性最低。吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) FC904是福建省微生物研究所从土壤样品中分离的能产生雷帕霉素的吸水链霉菌，其发酵单位的高低直接关系到生产成本。用理化因素(包括抗生素)处理产生菌的孢子或菌丝是诱变育种的常用方法，本文则对产生菌的原生质体进行处理，并通过筛选获得高产菌株。
1 材料与方法
1.1 菌株 福建省微生物研究所保存,吸水链霉菌(S. hygroscopicus) FC904;白色念珠菌(Candida albicans )C90。
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1.2 培养基 菌丝生长培养基：葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、polypeptone等。
再生培养基R2YE 见参考文献[1]。
孢子斜面培养基 麦片、琼脂。
发酵培养基 葡萄糖、麦片、酵母粉、蛋白胨、黄豆粉、甘油、NaCl等。
生物检定培养基 葡萄糖、蛋白胨。
1.3 主要试剂及仪器 硫酸庆大霉素，丝裂霉素C，红霉素乳糖酸盐等抗生素。亚硝基胍(NTG，Fluka Inc.)，原生质体缓冲液(P缓冲液)[1]。岛津LC-3A高效液相色谱仪，Fisher-lilly抑菌圈测量仪，旋转式摇瓶机。
1.4 抗生素的最小抑菌浓度(MIC)测定 采用平板稀释法[2]。
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1.5 原生质体的制备及再生 见参考文献[3]。原生质体适当稀释后涂布于再生培养基上，26℃倒置培养10～15天。
1.6 抗生素、NTG处理链霉菌FC904原生质体 抗生素和NTG溶液(以致死率95%的浓度)分别与原生质体液(1×108/ml)混合，28℃作用2～3 h。NTG处理株需终止反应，离心，弃上清液，原生质体沉淀用P缓冲液洗涤两遍。吸取处理后的原生质体，适当稀释，涂布于再生培养基，26℃培养10～15天。挑取再生菌落接种于孢子斜面培养基，供发酵。
1.7 雷帕霉素F904的发酵及测定 钩取一环诱变菌株的成熟孢子斜面培养物接种于发酵培养基(30 ml/250 ml三角瓶)，26℃振荡培养(200 r/min)72 h。每批发酵50～80株，均设3个摇瓶链霉菌FC904为对照。发酵液用甲醇抽提[4],生物检测参见文献[5]。检定菌为白色念珠菌。同时用反相高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中RPM的真实含量。采用外标法，波长277 nm,色谱柱YWG-C18,柱温40℃,流动相甲醇∶水=75∶25V/V,流速1 ml/min。根据公式计算效价：
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2 结 果
2.1 链霉菌FC904对抗生素的敏感度
链霉菌FC904对庆大霉素等氨基糖甙类抗生素非常敏感(MIC 0.1 μg/ml)，其次为丝裂霉素C(MIC 10 μg/ml)，对利福平、氟哌酸、四环素、氯霉素的MIC为50～100 μg/ml，青霉素为100 U/ml，对磺胺药及红霉素不敏感(MIC分别为1000,1500 μg/ml)。根据药敏实验结果选择庆大霉素、丝裂霉素C、红霉素等作为菌种的处理药物。
2.2 抗生素、NTG的处理效果比较
以处理株的抑菌圈直径比对照株抑菌圈直径>3.0 mm为正变株，<3.0 mm为负变株，其余的为不变株。从抗生素、NTG处理结果(表1)看出,红霉素的处理效果不明显，不变株达91.6%。NTG处理效果较明显，不变株为67.7%。丝裂霉素C、庆大霉素处理后不变株比例分别为71.6%,80.7%。所有变异菌株中负变株均多于正变株，但以NTG处理的负变株比例最高，丝裂霉素C次之，庆大霉素较低。
, 百拇医药
表1 抗生素、NTG处理链霉菌FC904原生质体后正、负变株的比例(%) 处理因素
菌株数
不变株
正变株
负变株
庆大霉素
363
80.7
6.1
13.2
丝裂霉素C
563
, 百拇医药
71.6
7.6
20.8
红霉素
345
91.6
1.2
7.2
亚硝基胍
300
67.7
5.3
27.0
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自然分离
200
100
0
0
2.3 突变株的筛选
从363株庆大霉素处理株中筛选到25株较高产量的菌株，摇瓶发酵水平比对照株链霉菌FC904平均提高20%，其中最低的提高12%，最高的为突变株C14，提高36%。该菌株的菌落特征、孢子堆颜色及吸水时间都与原始菌株链霉菌FC904有很大不同(表2,图1)，继续用庆大霉素处理C14原生质体，获得另一高产突变株C14-1。C14及C14-1的摇瓶发酵水平见表3,图2。从300株NTG处理株中得到81株低效价菌株。平均摇瓶发酵水平为对照株链霉菌FC904的67%，最低的突变株C75产量仅为对照菌株的35%。
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图1a 突变株C14的菌落
图1b 原始株菌S.hygroscopicus的菌落
图2 链霉菌FC904及其突变株发酵液提取物的HPLC峰谱
a:突变株C75; b:原始菌株链霉菌FC904; c:突变株C14;
d:突变株C14-1.
表2 突变株C14主要培养特征
链霉菌FC904
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突变株C14
生长
慢
快
菌落特征
直径较大，5～6 mm，较扁平，放射状皱褶，同心圆状，有光秃型菌落.
直径较小 3～4 mm，中央隆起，周边有皱褶，啤酒瓶盖状，无光秃型菌落.
气生菌丝
薄、雪白色*，孢子银鼠灰，18天吸水.
丰茂，荔肉白色，孢子长石灰或狼烟灰，12天吸水.
, 百拇医药 *:颜色比较参照《色谱》(北京：科学出版社)表3 突变株 C14、C14-1的摇瓶发酵水平(%)* 菌 株
生物检定
HPLC测定
链霉菌FC904
100
100
突变株C14
156
136
突变株C14-1
188
, 百拇医药 160
*:连续5次测定结果平均值.3 讨 论
抗生素的诱变作用虽然较温和，但是已有不少育种工作者应用抗生素处理获得高产菌株[6]。原生质体没有细胞壁，可能对外界的化学信号较完整的细胞更为敏感，有利于诱变。本文采用庆大霉素直接处理链霉菌FC904原生质体，提高雷帕霉素产量，简便有效，对降低生产成本具有实际意义。至于变株C14、C14-1的稳定性还有待进一步研究。在抗生素筛选中常会出现产量低的代谢途径障碍突变株或“零”变株，对这些变株再处理后所得到的回复突变株往往产量比亲株高[6]。低产菌株C75，继续处理后，其产量是否能回复抑或更低，有待于进一步研究。
雷帕霉素具有抗酵母样真菌的作用，其抗菌机制与免疫抑制机制相似[7]，因此在筛选中使用白色念珠菌Candida albicans C90为生物检定菌。由于产生菌发酵液中还含有非雷帕霉素类型抗真菌成分，因此，在采取生物检测的同时，须应用HPLC进一步检测RPM在发酵液中的真实含量。
, 百拇医药
参考文献
1 邓子新,唐纪良. 链霉菌遗传操作手册. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1988:168～173
2 李仲兴，郑家齐，李家宏. 诊断细菌学. 香港:黄河出版社, 1992:570～573
3 强 华，黄 捷. 吸水链霉菌FC904(Streptomyces hygroscopicus FC904)原生质体形成的影响因素. 福建医科大学学报， 1999；33：162
4 Cheng YR, Fang A, Demain AL. Effect of amino acids on rapamycin biosynthesis by Streptomyces hygroscopicus. Appl Microbiol Biotechnol, 1995;43:1096
, 百拇医药
5 Kojima I, Cheng YR, Mohan V,et al. Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. J Ind Microbiol, 1995;14:436
6 陈代杰，朱宝泉. 工业微生物菌种选育与发酵控制技术. 上海：上海科学技术文献出版社, 1995:147～170
7 Sehgal SN. Rapamune(Sinolimus,Rapamycin):An overview and mechanism of action. Ther Drugs Monit, 1995;17:660
(收稿：1998-11-05 修回：1999-03-19), 百拇医药
单位：强 华 福建医科大学微生物学教研室(福州 350004)；黄 捷 程元荣 福建省微生物研究所(福州 350007)；陈贻锴 福建医科大学基因工程研究室(福州 350004)
关键词：吸水链霉菌；雷帕霉素；原生质体；诱变育种
福建医科大学学报990315 目的 选择抗生素和化学诱变剂处理雷帕霉素产生菌的原生质体，筛选高产菌株。 方法 分别用庆大霉素、丝裂霉素C、红霉素、亚硝基胍处理吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)原生质体，比较它们对雷帕霉素产量的影响，并筛选高产菌株。 结果 庆大霉素的处理效果较好，从庆大霉素处理株中筛选到高产菌株C14、C14-1，其雷帕霉素的摇瓶发酵水平(反相高效液相色谱法测定)分别比原始株提高36%,60%。 结论 用庆大霉素处理吸水链霉菌FC904原生质体是提高雷帕霉素产量的有效手段。
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Effects on the Production of Rapamycin by the Treatment of Protoplasts of Streptomyces hygroscopicus FC904 with Antibiotics and Nitrous Guanidine
Qiang Hua1, Huang Jie2, Chen Yikai3，et al
(1.Department of Microbiology, Fujian Medical University, Fuzhou,350004
2.Fujian Institute of Microbiology, Fuzhou, 350007
3.Laboratory of Genetic Engineering, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
, 百拇医药
Objective To screen higher-producing strains by the treatment of protoplasts of S. hygroscopicus FC904 with antibiotics and nitrous guanidine(NTG). Methods Protoplasts of S.hygroscopicus FC904 were treated with gentamicin,erythromycin,mitomycin C or NTG respectively. Effects of these agents on rapamycin production were compared and the high yielding strains were screened. Results The treatment with gentamicin had a better effect on improving the production of rapamycin. Higher producing strains C14 and C14-1 were obtained from the gentamicin-treated strains with their RPM titer of broth(assayed by HPLC) increased by 36% and 60% respectively as compared with that of the original strain S.hygroscopicus FC904. Conclusion The treatment of S.hygroscopicus FC904 protoplasts with gentamicin is effective for improving the production of rapamycin.
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Key words Streptomyces hygroscopicus; rapamycin; protoplast; mutation breeding
雷帕霉素(rapamycin,RPM)是具有抗真菌、抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂，其免疫抑制作用比环孢菌素A、FK506等强，但对肾的毒性最低。吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) FC904是福建省微生物研究所从土壤样品中分离的能产生雷帕霉素的吸水链霉菌，其发酵单位的高低直接关系到生产成本。用理化因素(包括抗生素)处理产生菌的孢子或菌丝是诱变育种的常用方法，本文则对产生菌的原生质体进行处理，并通过筛选获得高产菌株。
1 材料与方法
1.1 菌株 福建省微生物研究所保存,吸水链霉菌(S. hygroscopicus) FC904;白色念珠菌(Candida albicans )C90。
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1.2 培养基 菌丝生长培养基：葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、polypeptone等。
再生培养基R2YE 见参考文献[1]。
孢子斜面培养基 麦片、琼脂。
发酵培养基 葡萄糖、麦片、酵母粉、蛋白胨、黄豆粉、甘油、NaCl等。
生物检定培养基 葡萄糖、蛋白胨。
1.3 主要试剂及仪器 硫酸庆大霉素，丝裂霉素C，红霉素乳糖酸盐等抗生素。亚硝基胍(NTG，Fluka Inc.)，原生质体缓冲液(P缓冲液)[1]。岛津LC-3A高效液相色谱仪，Fisher-lilly抑菌圈测量仪，旋转式摇瓶机。
1.4 抗生素的最小抑菌浓度(MIC)测定 采用平板稀释法[2]。
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1.5 原生质体的制备及再生 见参考文献[3]。原生质体适当稀释后涂布于再生培养基上，26℃倒置培养10～15天。
1.6 抗生素、NTG处理链霉菌FC904原生质体 抗生素和NTG溶液(以致死率95%的浓度)分别与原生质体液(1×108/ml)混合，28℃作用2～3 h。NTG处理株需终止反应，离心，弃上清液，原生质体沉淀用P缓冲液洗涤两遍。吸取处理后的原生质体，适当稀释，涂布于再生培养基，26℃培养10～15天。挑取再生菌落接种于孢子斜面培养基，供发酵。
1.7 雷帕霉素F904的发酵及测定 钩取一环诱变菌株的成熟孢子斜面培养物接种于发酵培养基(30 ml/250 ml三角瓶)，26℃振荡培养(200 r/min)72 h。每批发酵50～80株，均设3个摇瓶链霉菌FC904为对照。发酵液用甲醇抽提[4],生物检测参见文献[5]。检定菌为白色念珠菌。同时用反相高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中RPM的真实含量。采用外标法，波长277 nm,色谱柱YWG-C18,柱温40℃,流动相甲醇∶水=75∶25V/V,流速1 ml/min。根据公式计算效价：
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2 结 果
2.1 链霉菌FC904对抗生素的敏感度
链霉菌FC904对庆大霉素等氨基糖甙类抗生素非常敏感(MIC 0.1 μg/ml)，其次为丝裂霉素C(MIC 10 μg/ml)，对利福平、氟哌酸、四环素、氯霉素的MIC为50～100 μg/ml，青霉素为100 U/ml，对磺胺药及红霉素不敏感(MIC分别为1000,1500 μg/ml)。根据药敏实验结果选择庆大霉素、丝裂霉素C、红霉素等作为菌种的处理药物。
2.2 抗生素、NTG的处理效果比较
以处理株的抑菌圈直径比对照株抑菌圈直径>3.0 mm为正变株，<3.0 mm为负变株，其余的为不变株。从抗生素、NTG处理结果(表1)看出,红霉素的处理效果不明显，不变株达91.6%。NTG处理效果较明显，不变株为67.7%。丝裂霉素C、庆大霉素处理后不变株比例分别为71.6%,80.7%。所有变异菌株中负变株均多于正变株，但以NTG处理的负变株比例最高，丝裂霉素C次之，庆大霉素较低。
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表1 抗生素、NTG处理链霉菌FC904原生质体后正、负变株的比例(%) 处理因素
菌株数
不变株
正变株
负变株
庆大霉素
363
80.7
6.1
13.2
丝裂霉素C
563
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71.6
7.6
20.8
红霉素
345
91.6
1.2
7.2
亚硝基胍
300
67.7
5.3
27.0
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自然分离
200
100
0
0
2.3 突变株的筛选
从363株庆大霉素处理株中筛选到25株较高产量的菌株，摇瓶发酵水平比对照株链霉菌FC904平均提高20%，其中最低的提高12%，最高的为突变株C14，提高36%。该菌株的菌落特征、孢子堆颜色及吸水时间都与原始菌株链霉菌FC904有很大不同(表2,图1)，继续用庆大霉素处理C14原生质体，获得另一高产突变株C14-1。C14及C14-1的摇瓶发酵水平见表3,图2。从300株NTG处理株中得到81株低效价菌株。平均摇瓶发酵水平为对照株链霉菌FC904的67%，最低的突变株C75产量仅为对照菌株的35%。
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图1a 突变株C14的菌落
图1b 原始株菌S.hygroscopicus的菌落
图2 链霉菌FC904及其突变株发酵液提取物的HPLC峰谱
a:突变株C75; b:原始菌株链霉菌FC904; c:突变株C14;
d:突变株C14-1.
表2 突变株C14主要培养特征
链霉菌FC904
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突变株C14
生长
慢
快
菌落特征
直径较大，5～6 mm，较扁平，放射状皱褶，同心圆状，有光秃型菌落.
直径较小 3～4 mm，中央隆起，周边有皱褶，啤酒瓶盖状，无光秃型菌落.
气生菌丝
薄、雪白色*，孢子银鼠灰，18天吸水.
丰茂，荔肉白色，孢子长石灰或狼烟灰，12天吸水.
, 百拇医药 *:颜色比较参照《色谱》(北京：科学出版社)表3 突变株 C14、C14-1的摇瓶发酵水平(%)* 菌 株
生物检定
HPLC测定
链霉菌FC904
100
100
突变株C14
156
136
突变株C14-1
188
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*:连续5次测定结果平均值.3 讨 论
抗生素的诱变作用虽然较温和，但是已有不少育种工作者应用抗生素处理获得高产菌株[6]。原生质体没有细胞壁，可能对外界的化学信号较完整的细胞更为敏感，有利于诱变。本文采用庆大霉素直接处理链霉菌FC904原生质体，提高雷帕霉素产量，简便有效，对降低生产成本具有实际意义。至于变株C14、C14-1的稳定性还有待进一步研究。在抗生素筛选中常会出现产量低的代谢途径障碍突变株或“零”变株，对这些变株再处理后所得到的回复突变株往往产量比亲株高[6]。低产菌株C75，继续处理后，其产量是否能回复抑或更低，有待于进一步研究。
雷帕霉素具有抗酵母样真菌的作用，其抗菌机制与免疫抑制机制相似[7]，因此在筛选中使用白色念珠菌Candida albicans C90为生物检定菌。由于产生菌发酵液中还含有非雷帕霉素类型抗真菌成分，因此，在采取生物检测的同时，须应用HPLC进一步检测RPM在发酵液中的真实含量。
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参考文献
1 邓子新,唐纪良. 链霉菌遗传操作手册. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1988:168～173
2 李仲兴，郑家齐，李家宏. 诊断细菌学. 香港:黄河出版社, 1992:570～573
3 强 华，黄 捷. 吸水链霉菌FC904(Streptomyces hygroscopicus FC904)原生质体形成的影响因素. 福建医科大学学报， 1999；33：162
4 Cheng YR, Fang A, Demain AL. Effect of amino acids on rapamycin biosynthesis by Streptomyces hygroscopicus. Appl Microbiol Biotechnol, 1995;43:1096
, 百拇医药
5 Kojima I, Cheng YR, Mohan V,et al. Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. J Ind Microbiol, 1995;14:436
6 陈代杰，朱宝泉. 工业微生物菌种选育与发酵控制技术. 上海：上海科学技术文献出版社, 1995:147～170
7 Sehgal SN. Rapamune(Sinolimus,Rapamycin):An overview and mechanism of action. Ther Drugs Monit, 1995;17:660
(收稿：1998-11-05 修回：1999-03-19), 百拇医药