BCG细胞壁骨架加IL－2膀胱灌注对肿瘤组织端粒酶活性的影响
作者：秦自科 梅骅 戴宇平 陈小君 陈巧伦 邓春华 黄奕俊 万德森
单位：秦自科 梅骅 戴宇平 邓春华(中山医科大学附属一院泌尿外科 广州，510080)；陈小君 陈巧伦 万德森(中山医科大学肿瘤防治中心 广州，510060)；黄奕俊(中山医科大学生理教研室 广州，510089)
关键词：卡介苗；白细胞介素2；膀胱肿瘤；端粒酶
癌症990313
【摘要】目的：研究卡介苗细胞壁骨架(BCG-CWS)加白细胞介素2(IL-2)膀胱灌注对肿瘤组织端粒酶活性的影响，从而探讨该治疗的作用机理。方法：采用端粒重复序列扩增法(TRAP)分别检测20例膀胱肿瘤用药前后端粒酶活性的表达。结果：经分别测定端粒酶提取原液以及10倍、100倍稀释液中端粒酶活性的表达，表明用药后肿瘤组织中端粒酶的活性明显降低(P<0.01)。结论：BCG-CWS联合IL-2膀胱灌注能有效地抑制肿瘤细胞端粒酶的活性，提示该治疗的作用机理之一可能是肿瘤端粒酶活性的改变。
, http://www.100md.com
中图号：R737.14 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0279-02
Changes of telomerase activity in bladder cancers after
intravesical instillations with BCG-CWS and IL-2
QIN Zi-ke, MEI Hua, DAI Yu-ping,et al
Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of
Medical Sciences, Guangzhou 510080,China
, 百拇医药
【Abstract】Objective：To explore the influence on telomerase activity of bladder cancers after the treatment of intravesical instillation with cell wall skeleton of bacillus Calmett-Guerin(BCG-CWS) and interleukin-2(IL-2). Methods：the telomerase activity of tissues of 20 cases of bladder cancers before and after the treatments with BCG-CWS and IL-2 was detected by telomeric repeat amplification protocol(TRAP) respectively. Results：The telomerase activity in bladder cancer was obviously reduced after the treatment of intravesical instillatios with BCG-CWS and IL-2. Conclusions：the telomerase activity of bladder cancers can be inhibited effectively by the use of intravesical instillatios with BCG-CWS and IL-2, and the telomerase maybe a very important signal in the treatments of bladder cancers.
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Key words：BCG-CWS;Interleukin-2;Telomerase;Bladder neoplasms
卡介苗细胞壁骨架(BCG-CWS)及白细胞介素2(IL-2)用于预防膀胱癌局部手术后复发的历史很短〔1〕，其效果及实用价值尚有待进一步研究和证实。本文就20例膀胱肿瘤病人使用BCG-CWS加IL-2膀胱灌注后肿瘤组织中端粒酶(Telomerase,简称TLMA)活性的表达变化，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源
本组20例膀胱肿瘤病人，全部标本经病理证实为膀胱移行细胞癌。其中Ⅰ级5例，Ⅱ级9例，Ⅲ级6例。入院前门诊行膀胱镜检查时留取肿瘤标本。入院后于术前6～8天用BCG-CWS5mg加IL-250万单位溶于50ml生理盐水行膀胱灌注，隔天1次，共2次。BCG-CWS由广东省生物制品研究所提供，IL-2由第一军医大学生物技术研究中心提供。手术时再次留取肿瘤标本(经尿道肿瘤电切者，先经膀胱镜留取肿瘤标本)。所有标本的采集均于离体后半小时内完成并放至-80℃低温冰箱保存。
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1.2 端粒酶提取
每例肿瘤标本取50mg左右的组织，进行液氮研磨，然后加入200μl的冷冻洗脱缓冲液，4℃，10000rpm离心2分钟，去上清液后重复洗脱离心1次。沉淀物用100μl裂解缓冲液重新悬浮，并于4℃下孵育裂解1小时，每20分钟震荡混匀1次。而后于4℃、15000rpm离心30分钟，将上清液移出分装即为提取液，放于-80℃低温冰箱中保存待用。每例提取液经考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，以1mg/ml蛋白为标准反应浓度。
1.3 端粒酶活性测定
用TRAP-eze(TM)kit端粒酶活性试剂盒(Gene公司)方法进行检测。每例标本检测体积为50μl反应液，其中包含2μl提取液、2μCi(α-32P)(47kBq)dCTP(杜邦公司)和2unitsTaqDNA多聚酶(Promega公司)；反应液于30℃下延长30分钟，然后按94℃30秒，50℃30秒，72℃1分30秒进行32个PCR循环，所得PCR反应产物在15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳、分离，电泳后凝胶与X光胶片置于-80℃低温冰箱中作放射自显影24小时，观察X光胶片以出现6bp或6bp整数倍为间隔的“梯形”条带为阳性结果。
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为了对端粒酶活性的表达进行半定量分析，实验参照Kamata〔2〕所述方法将原端粒酶提取液分别稀释10倍和100倍，再用同样方法分别进行端粒酶活性的检测。将原液中端粒酶活性表达阴性者定为(-)，其余阳性者经稀释10倍后为阴性定为(+)，稀释100倍后为阴性者定为(++)，为阳性者定为(+++)。
1.4 统计分析
用x2检验及Wilcoxon秩和检验进行统计分析。
2 结果
在端粒酶提取原液中测得本组膀胱癌标本于用药膀胱灌注前后端粒酶活性的表达阳性率分别为85%和50%，其差别具有统计学意义(P<0.01)。
端粒酶提取原液通过10倍及100倍稀释后，检测结果按“-”、“+”、“++”、“+++”用药前分别为3例、4例、9例和4例；用药后则分别为10例、5例、4例和1例(图1)，用药后肿瘤组织的端粒酶活性明显降低(P<0.01)。
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图1 端粒酶活性检测
1.阳性对照；2.Marker；3，5.分别为同一肿
瘤膀胱灌注前后；4.为标本3经10倍稀释后。
3 讨论
卡介苗用于预防浅表性膀胱癌术后复发，使膀胱癌的治疗效果得到了明显提高。但由于卡介苗的一些严重副反应及保存时间短等缺点，以致它的应用不能得到广泛推广。国外学者于70年代开始研究用卡介苗的提取成分细胞壁骨架代替活卡介苗，即保留其免疫活性成分而清除其余组分，用于临床已初见成效〔3〕。本研究根据膀胱肿瘤免疫治疗的最新进展〔4〕，采用BCG-CWS加IL-2联合膀胱灌注，通过检测灌注前后膀胱肿瘤组织中端粒酶活性表达的改变，进一步探讨该治疗的作用机理。
最新的研究表明，端粒酶活性的改变与肿瘤细胞的无限增殖密切相关〔5〕。端粒酶活性的增高在人体许多恶性肿瘤组织中已得到证实，如神经母细胞瘤(94%)、乳腺癌(93%)、大肠癌(93%)、肝癌(85%)、胃癌(85%)、前列腺癌(84%)、肺癌(80%)、非小细胞癌(76%)等〔6〕，膀胱癌组织中端粒酶阳性表达为76.2%～91.7%〔7，8〕，而肿瘤邻近的正常组织以及良性肿瘤中端粒酶活性均为阴性表达或仅为弱阳性表达。因此，端粒酶是目前最具特异性和普遍性的肿瘤标志物，它在肿瘤的诊断和治疗方面有广阔的发展前途。
, 百拇医药
本研究结果显示膀胱癌组织端粒酶活性表达的阳性率为85%，与文献报告的相似[7，8]。用BCG-CWS加IL-2膀胱灌注后肿瘤组织中端粒酶的活性明显下降。有研究表明，肿瘤组织端粒酶活性的改变与肿瘤的临床生物学行为密切相关。Monika等通过端粒酶的半定量研究发现，端粒酶的活性在晚期大肠癌中表达水平明显高于早期肿瘤，而且端粒酶表达水平的增高与肿瘤细胞的浸润，肿瘤进展及转移有关〔9〕。彭均铮等研究表明，浸润性膀胱癌的端粒酶活性较表浅性膀胱癌高，肿瘤越大端粒酶活性越高，肿瘤分化差者其端粒酶的活性也提高〔7〕。本研究采用最新研制开发的BCG-CWS，加上生物制剂IL-2联合膀胱灌注，1周后肿瘤组织的端粒酶活性明显降低，说明该治疗能有效地抑制肿瘤细胞端粒酶的活性，提示该治疗能抑制肿瘤细胞的生长或杀灭肿瘤细胞，阻止肿瘤的发展。其机理可能是通过机体的免疫反应而使肿瘤细胞端粒酶数量减少或原有的端粒酶不表现出活性功能，因此肿瘤细胞失去永生化，逐渐发生变性、环死或凋亡。Morales等研究表明，BCG膀胱灌注可直接引起肿瘤的坏死和消退，其中很可能就包括着一系列端粒酶的改变〔10〕。
, 百拇医药
由于端粒酶在恶性肿瘤中的特异表达，对它的抑制或灭活在肿瘤治疗方面将带来一个新的希望。BCG-CWS加IL-2联合膀胱灌注能有效地抑制肿瘤组织端粒酶的活性，表明它对膀胱肿瘤具有确实可靠的防治效果。卡介苗细胞壁骨架(BCG-CWS)与卡介苗(BCG)比具有副反应小、保存时间长等优点，因而其实际应用价值较高，适合在基层医院推广使用。加用抗肿瘤作用确切的白细胞介素2(IL-2)，这给膀胱肿瘤的防治提供了一条崭新的途径。
基金项目：吴阶平泌尿外科基金资助
参考文献
1 戴宇平，梅骅，欧阳颖敏.BCG细胞壁骨架膀胱灌注防治浅表膀胱癌复发的研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，1998，19：721.
2 Kamata S, Kageyama Y, Yonese J, et al. Significant telomere reduction in human superficial transitional cell carcinoma〔J〕.Br J Urol, 1996,78：704.
, 百拇医药
3 Yanamura Y. Adjuvant immunotherapy of lung cancer with BCG cell wall skeleton(BCG-CWS)〔J〕.Cancer,1979,43：1343.
4 Riggs DR,Tarry WF, Dehaven JI,et al. Immunotherapy of murine transitional cell carcinoma of the bladder using alpha and gamma interferon in combination with other forms of immunotherapy〔J〕.J Urol, 1992,347： 212.
5 Blackburn EH.Telomerase：no end in sight〔J〕.Cell,1994,77：621.
6 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer〔J〕. Eur J Cancer, 1997,33： 787.
, 百拇医药
7 彭钧静，张元芳，丁强，等.膀胱癌组织中端粒酶活性研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，1997，18：601.
8 Linn JF, Lango M, Halachmi S, et al. Microsatellite analysis and telomerase activity in archived tissue and urine samples of bladder cancer patients〔J〕. Int J Cancer, 1997,74：625.
9 Engelhardt M, Drullinsky P, Guillem J, et al. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res,1997,3：1931.
10 Morales A, Eidinger D, Bruce AW, et al. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors〔J〕. J Urol, 1976,116：180.
收稿日期：1998-11-13；修回日期：1998-12-24, http://www.100md.com
单位：秦自科 梅骅 戴宇平 邓春华(中山医科大学附属一院泌尿外科 广州，510080)；陈小君 陈巧伦 万德森(中山医科大学肿瘤防治中心 广州，510060)；黄奕俊(中山医科大学生理教研室 广州，510089)
关键词：卡介苗；白细胞介素2；膀胱肿瘤；端粒酶
癌症990313
【摘要】目的：研究卡介苗细胞壁骨架(BCG-CWS)加白细胞介素2(IL-2)膀胱灌注对肿瘤组织端粒酶活性的影响，从而探讨该治疗的作用机理。方法：采用端粒重复序列扩增法(TRAP)分别检测20例膀胱肿瘤用药前后端粒酶活性的表达。结果：经分别测定端粒酶提取原液以及10倍、100倍稀释液中端粒酶活性的表达，表明用药后肿瘤组织中端粒酶的活性明显降低(P<0.01)。结论：BCG-CWS联合IL-2膀胱灌注能有效地抑制肿瘤细胞端粒酶的活性，提示该治疗的作用机理之一可能是肿瘤端粒酶活性的改变。
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中图号：R737.14 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0279-02
Changes of telomerase activity in bladder cancers after
intravesical instillations with BCG-CWS and IL-2
QIN Zi-ke, MEI Hua, DAI Yu-ping,et al
Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of
Medical Sciences, Guangzhou 510080,China
, 百拇医药
【Abstract】Objective：To explore the influence on telomerase activity of bladder cancers after the treatment of intravesical instillation with cell wall skeleton of bacillus Calmett-Guerin(BCG-CWS) and interleukin-2(IL-2). Methods：the telomerase activity of tissues of 20 cases of bladder cancers before and after the treatments with BCG-CWS and IL-2 was detected by telomeric repeat amplification protocol(TRAP) respectively. Results：The telomerase activity in bladder cancer was obviously reduced after the treatment of intravesical instillatios with BCG-CWS and IL-2. Conclusions：the telomerase activity of bladder cancers can be inhibited effectively by the use of intravesical instillatios with BCG-CWS and IL-2, and the telomerase maybe a very important signal in the treatments of bladder cancers.
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Key words：BCG-CWS;Interleukin-2;Telomerase;Bladder neoplasms
卡介苗细胞壁骨架(BCG-CWS)及白细胞介素2(IL-2)用于预防膀胱癌局部手术后复发的历史很短〔1〕，其效果及实用价值尚有待进一步研究和证实。本文就20例膀胱肿瘤病人使用BCG-CWS加IL-2膀胱灌注后肿瘤组织中端粒酶(Telomerase,简称TLMA)活性的表达变化，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源
本组20例膀胱肿瘤病人，全部标本经病理证实为膀胱移行细胞癌。其中Ⅰ级5例，Ⅱ级9例，Ⅲ级6例。入院前门诊行膀胱镜检查时留取肿瘤标本。入院后于术前6～8天用BCG-CWS5mg加IL-250万单位溶于50ml生理盐水行膀胱灌注，隔天1次，共2次。BCG-CWS由广东省生物制品研究所提供，IL-2由第一军医大学生物技术研究中心提供。手术时再次留取肿瘤标本(经尿道肿瘤电切者，先经膀胱镜留取肿瘤标本)。所有标本的采集均于离体后半小时内完成并放至-80℃低温冰箱保存。
, 百拇医药
1.2 端粒酶提取
每例肿瘤标本取50mg左右的组织，进行液氮研磨，然后加入200μl的冷冻洗脱缓冲液，4℃，10000rpm离心2分钟，去上清液后重复洗脱离心1次。沉淀物用100μl裂解缓冲液重新悬浮，并于4℃下孵育裂解1小时，每20分钟震荡混匀1次。而后于4℃、15000rpm离心30分钟，将上清液移出分装即为提取液，放于-80℃低温冰箱中保存待用。每例提取液经考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，以1mg/ml蛋白为标准反应浓度。
1.3 端粒酶活性测定
用TRAP-eze(TM)kit端粒酶活性试剂盒(Gene公司)方法进行检测。每例标本检测体积为50μl反应液，其中包含2μl提取液、2μCi(α-32P)(47kBq)dCTP(杜邦公司)和2unitsTaqDNA多聚酶(Promega公司)；反应液于30℃下延长30分钟，然后按94℃30秒，50℃30秒，72℃1分30秒进行32个PCR循环，所得PCR反应产物在15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳、分离，电泳后凝胶与X光胶片置于-80℃低温冰箱中作放射自显影24小时，观察X光胶片以出现6bp或6bp整数倍为间隔的“梯形”条带为阳性结果。
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为了对端粒酶活性的表达进行半定量分析，实验参照Kamata〔2〕所述方法将原端粒酶提取液分别稀释10倍和100倍，再用同样方法分别进行端粒酶活性的检测。将原液中端粒酶活性表达阴性者定为(-)，其余阳性者经稀释10倍后为阴性定为(+)，稀释100倍后为阴性者定为(++)，为阳性者定为(+++)。
1.4 统计分析
用x2检验及Wilcoxon秩和检验进行统计分析。
2 结果
在端粒酶提取原液中测得本组膀胱癌标本于用药膀胱灌注前后端粒酶活性的表达阳性率分别为85%和50%，其差别具有统计学意义(P<0.01)。
端粒酶提取原液通过10倍及100倍稀释后，检测结果按“-”、“+”、“++”、“+++”用药前分别为3例、4例、9例和4例；用药后则分别为10例、5例、4例和1例(图1)，用药后肿瘤组织的端粒酶活性明显降低(P<0.01)。
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图1 端粒酶活性检测
1.阳性对照；2.Marker；3，5.分别为同一肿
瘤膀胱灌注前后；4.为标本3经10倍稀释后。
3 讨论
卡介苗用于预防浅表性膀胱癌术后复发，使膀胱癌的治疗效果得到了明显提高。但由于卡介苗的一些严重副反应及保存时间短等缺点，以致它的应用不能得到广泛推广。国外学者于70年代开始研究用卡介苗的提取成分细胞壁骨架代替活卡介苗，即保留其免疫活性成分而清除其余组分，用于临床已初见成效〔3〕。本研究根据膀胱肿瘤免疫治疗的最新进展〔4〕，采用BCG-CWS加IL-2联合膀胱灌注，通过检测灌注前后膀胱肿瘤组织中端粒酶活性表达的改变，进一步探讨该治疗的作用机理。
最新的研究表明，端粒酶活性的改变与肿瘤细胞的无限增殖密切相关〔5〕。端粒酶活性的增高在人体许多恶性肿瘤组织中已得到证实，如神经母细胞瘤(94%)、乳腺癌(93%)、大肠癌(93%)、肝癌(85%)、胃癌(85%)、前列腺癌(84%)、肺癌(80%)、非小细胞癌(76%)等〔6〕，膀胱癌组织中端粒酶阳性表达为76.2%～91.7%〔7，8〕，而肿瘤邻近的正常组织以及良性肿瘤中端粒酶活性均为阴性表达或仅为弱阳性表达。因此，端粒酶是目前最具特异性和普遍性的肿瘤标志物，它在肿瘤的诊断和治疗方面有广阔的发展前途。
, 百拇医药
本研究结果显示膀胱癌组织端粒酶活性表达的阳性率为85%，与文献报告的相似[7，8]。用BCG-CWS加IL-2膀胱灌注后肿瘤组织中端粒酶的活性明显下降。有研究表明，肿瘤组织端粒酶活性的改变与肿瘤的临床生物学行为密切相关。Monika等通过端粒酶的半定量研究发现，端粒酶的活性在晚期大肠癌中表达水平明显高于早期肿瘤，而且端粒酶表达水平的增高与肿瘤细胞的浸润，肿瘤进展及转移有关〔9〕。彭均铮等研究表明，浸润性膀胱癌的端粒酶活性较表浅性膀胱癌高，肿瘤越大端粒酶活性越高，肿瘤分化差者其端粒酶的活性也提高〔7〕。本研究采用最新研制开发的BCG-CWS，加上生物制剂IL-2联合膀胱灌注，1周后肿瘤组织的端粒酶活性明显降低，说明该治疗能有效地抑制肿瘤细胞端粒酶的活性，提示该治疗能抑制肿瘤细胞的生长或杀灭肿瘤细胞，阻止肿瘤的发展。其机理可能是通过机体的免疫反应而使肿瘤细胞端粒酶数量减少或原有的端粒酶不表现出活性功能，因此肿瘤细胞失去永生化，逐渐发生变性、环死或凋亡。Morales等研究表明，BCG膀胱灌注可直接引起肿瘤的坏死和消退，其中很可能就包括着一系列端粒酶的改变〔10〕。
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由于端粒酶在恶性肿瘤中的特异表达，对它的抑制或灭活在肿瘤治疗方面将带来一个新的希望。BCG-CWS加IL-2联合膀胱灌注能有效地抑制肿瘤组织端粒酶的活性，表明它对膀胱肿瘤具有确实可靠的防治效果。卡介苗细胞壁骨架(BCG-CWS)与卡介苗(BCG)比具有副反应小、保存时间长等优点，因而其实际应用价值较高，适合在基层医院推广使用。加用抗肿瘤作用确切的白细胞介素2(IL-2)，这给膀胱肿瘤的防治提供了一条崭新的途径。
基金项目：吴阶平泌尿外科基金资助
参考文献
1 戴宇平，梅骅，欧阳颖敏.BCG细胞壁骨架膀胱灌注防治浅表膀胱癌复发的研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，1998，19：721.
2 Kamata S, Kageyama Y, Yonese J, et al. Significant telomere reduction in human superficial transitional cell carcinoma〔J〕.Br J Urol, 1996,78：704.
, 百拇医药
3 Yanamura Y. Adjuvant immunotherapy of lung cancer with BCG cell wall skeleton(BCG-CWS)〔J〕.Cancer,1979,43：1343.
4 Riggs DR,Tarry WF, Dehaven JI,et al. Immunotherapy of murine transitional cell carcinoma of the bladder using alpha and gamma interferon in combination with other forms of immunotherapy〔J〕.J Urol, 1992,347： 212.
5 Blackburn EH.Telomerase：no end in sight〔J〕.Cell,1994,77：621.
6 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer〔J〕. Eur J Cancer, 1997,33： 787.
, 百拇医药
7 彭钧静，张元芳，丁强，等.膀胱癌组织中端粒酶活性研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，1997，18：601.
8 Linn JF, Lango M, Halachmi S, et al. Microsatellite analysis and telomerase activity in archived tissue and urine samples of bladder cancer patients〔J〕. Int J Cancer, 1997,74：625.
9 Engelhardt M, Drullinsky P, Guillem J, et al. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res,1997,3：1931.
10 Morales A, Eidinger D, Bruce AW, et al. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors〔J〕. J Urol, 1976,116：180.
收稿日期：1998-11-13；修回日期：1998-12-24, http://www.100md.com