原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒RNA的实验研究
作者：张凤民 赵德超 郭淑元 郭彩玲 谷鸿喜
单位：张凤民 郭淑元 郭彩玲 谷鸿喜(哈尔滨医科大学微生物学教研室，150086)；赵德超(哈尔滨医科大学附属二院，150086)
关键词：柯萨奇B病毒；原位RT-PCR；HeLa细胞
中国地方病学杂志990303 【摘要】 目的 建立定位检测细胞或组织中柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR方法(直接法)。方法 对柯萨奇B病毒(1～6型)感染HeLa细胞，经核酸酶(DNase和RNase)处理后的病毒感染HeLa细胞以及非感染的HeLa细胞进行原位RT-PCR检测。结果 经扩增后，病毒感染的HeLa细胞呈蓝黑阳性信号；并且这种阳性信号经RNase A作用而消失，却不受DNase作用的影响；而非感染的HeLa细胞则不着色。结论 原位RT-PCR法可特异地检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中的病毒RNA，是一种特异和敏感的定位检测方法，可应用于研究该病毒的持续性感染及其与克山病等相关疾病的关系。
, 百拇医药
分类号：R373.23 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)03-0166-68
Experimental study on detection of viral RNA of Coxsackie virus B by means of in situ RT-PCR
ZHANG Fengmin,ZHAO Dechao,GUO Shuyuan,et al
Department of Microbiology,Harbin Medical University,Harbin 150086
【Abstract】 Objective To establish a sensitive metho d for detecting Coxsackie virus B RNA in cells and tissues locationally.Methods HeLa cells infected with coxsackie virus B ,tho se treated by DNase,RNase and non-viral infecting HeLa cells by nuclease tr eatment were detected.Results Non-viral infecting HeLa cells were negative,virus-infecting HeLa cells were stained with blue and black color,and the posit ive signals could be removed after digestion of RNase but not DNase.Conclusions It indicated that the method of in situ RT -PCR is specific and sensitive,and will be useful for research on coxsackie vir us B sustainable infection and related diseases.
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【Key words】 Coxsackie virus B In situ RT-PCR HeLa cell
柯萨奇病毒(Coxsackie Virus)为小RNA病毒，主要有A、B两组，其中柯萨奇B组病毒包括1～6个血清型，主要与人类病毒性心肌炎、心肌病及神经系统的感染有关，是影响人类健康的重要病原体之一。目前，有关该病毒与相关疾病，特别是心肌炎、心肌病和克山病等之间的关系，已经获得了一定的研究成果[1～3]。所采用的研究方法主要是PCR或原位杂交等，其中PCR法敏感性较高，但不能对细胞或组织中的病毒RNA进行定位检测，原位杂交法虽可定位，却检测敏感性不高。
为便于直接对柯萨奇B病毒感染组织或细胞中的病毒RNA进行特异和敏感的定位检测，以进一步研究该病毒感染与相关疾病之间的关系，我们建立了检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR方法，并对柯萨奇B病毒感染的HeLa细胞以及经核酸酶处理的病毒感染细胞进行了检测。获满意结果，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 病毒与细胞 柯萨奇B组病毒(1～6型)常规组织培养，调整各型别病毒滴度分别为100TCID50，备用。病毒增殖与制备待检细胞片均使用HeLa细胞，该细胞用含10%FCS的MEM培养基常规培养。
1.2 RT-PCR引物 按文献由上海复生生物工程公司合成，为柯萨奇病毒的通用引物，其序列来源于CBV基因5′非编码区。外引物是5′-ACCTTTGTGGCCTGTT-3′和5′-CACGGACACCCAAAGTA-3′，内引物是5′-AAGCACTTCTGGACCC-3′和5′-ATTCAGGGGCCGGAGGA-3′。
1.3 PRC用试剂 PCR所用的AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、DNase和RNaseA、蛋白酶K等酶类以及dNTP和生物素-11-dUTP等试剂购于Promage公司。亲合素-碱性磷酸酶、NBT和BCIP等购于北京华美生物工程公司。
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1.4 柯萨奇B病毒感染HeLa细胞片的制备 常规培养HeLa细胞成层后，分别接种1～6型CBV，感染12小时后，分别消化制备细胞悬液，等量混合，调整细胞浓度为300万/ml，滴玻片(0.1ml/片)培养24小时，经丙酮固定后备用。
1.5 原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中病毒RNA 首先用系列乙醇水化待检细胞片，蛋白酶K消化37℃15分钟后备用，其中对核酸酶消化实验的细胞分别使用DNase(10μg/ml)和RNaseA(10μg/ml)以及DNase+RNaseA联合进行作用，37℃过夜处理；然后加入原位RT-PCR反应液(含AMV逆转录酶1U，TaqDNA聚合酶1U，dATP、dCTP、dGTP各为200mmol/L,dTTP140mmol
/L,生物素-11-dUTP70mmol/L等)50μl/片，覆盖盖玻片后，进行逆转录反应(42℃30分钟)和PCR扩增(96℃1分钟，52℃2分钟，72℃2分钟，35次循环)，最后加入亲合素—碱性磷酸酶(0.5mol/L,50μl)作用,进行NBT和BCIP显色反应，37℃2小时。用显微镜观察结果并拍照，其中阳性细胞呈蓝黑着色，阴性细胞不着色。
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2 实验结果
2.1 原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中病毒RNA结果 用原位RT-PCR法对柯萨奇B病毒感染HeLa细胞和未感染的HeLa细胞进行检测。结果可见，经原位RT-PCR扩增后，柯萨奇B病毒感染的HeLa细胞呈蓝黑着色，阳性信号充满细胞，为阳性结果；而非病毒感染的HeLa细胞不着色，为阴性结果。
2.2 经核酸酶处理后柯萨奇B病毒感染HeLa细胞的原位RT-PCR结果 分别对经DNase、RNaseA、DNase+RNaseA处理的柯萨奇B病毒感染HeLa细胞，进行原位RT-PCR检测。结果可见，经RNase作用后柯萨奇B病毒感染HeLa细胞的原位RT-PCR阳性信号消失；并且经DNase+RNase共同作用时，阳性信号也消失；但DNase作用不影响阳性信号。
3 讨论
目前研究柯萨奇B病毒与心肌炎等相关疾患(病毒性心肌炎、心肌病、克山病等)的关系，主要采取的分子生物学方法是聚合酶链式反应(PCR)和原位杂交等方法，尽管这些方法分别具有敏感性、特异性较高(PCR)或者可以定位检测(原位杂交)等方面的优点，但是尚不能把高敏感性与定位检测结合起来，直接用于相关的研究，特别是在研究该病毒的持续性感染如病毒RNA复制与感染细胞表面抗原表达之间关系等方面受到限制。
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自1990年Hasse[4]等首创原位PCR方法后，在病毒学检测等方面进行了广泛的应用，并且原位PCR技术已经从间接法发展成为直接法[5]。本文建立了定位检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR法，并对该病毒感染的HeLa细胞以及经核酸酶处理后的病毒感染细胞进行了检测。结果表明，经原位RT-PCR扩增后，柯萨奇B病毒感染的HeLa细胞呈蓝黑着色，阳性信号充满细胞；而非病毒感染的HeLa细胞不着色；核酸酶消化实验证实，经RNase作用后柯萨奇B病毒感染HeLa细胞的原位RT-PCR阳性信号消失，DNase和RNase共同作用时，阳性信号也消失，但DNase作用不影响阳性信号。说明，原位RT-PCR的阳性信号是柯萨奇B病毒特异性和RNA特异性的。
本文实验结果提示原位RT-PCR法是一种可以特异、敏感地定位检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中病毒RNA的方法。如果同时对比检测相应组织或细胞中的柯萨奇B病毒相关抗原的表达情况，将有助于阐明柯萨奇B病毒相关疾病如心肌病和克山病等疾患的生物病因，以及进行柯萨奇B病毒相关疾患发生过程中的病毒持续性感染与免疫性病理等机理方面的研究。有关研究将进一步报道。
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基金来源：黑龙江省重点学科后备带头人基金
作者简介：张凤民，男，1963年生，副教授，硕士生导师
参考文献
[1] Bowlrs NE,Richardson PJ,Olsen EGJ,et al.Detection of Coxsackie virus B specific RNA sequence in myocardial biopsy sample from patient with myo carditis and dilated cardiomyopathy [J].Lancet,1986,1120～1123
[2] 沈茜，汪美先，章同华，等.原位核酸杂交法检测柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌组织中的病毒RNA[J].中华微生物学和免疫学杂志，1991,11(3):193～196
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[3] 钟学宽，张凤民，江自然，等.原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与云南亚急性克山病的关系[J].中国地方病学杂志，1993,12(4):193～195
[4] Hasse AJ,Relzel EF,Staskus KA,et al.Amplification and detection of lentivirus DNA in side cells.Proc Natl Acad Sci USA[J].1990,87:4971～4975
[5] Long AA,Komminoth P,Lee E,et al.Comparison of indirect and dir ect in situ PCR in cell,preparation and tissue section,detection of viral DN A,gene rearrangements and chromosomal translocations[J].Histochemistry,1993,99 :151～162
*收稿日期：1998-09-10；修订日期：1998-09-24, 百拇医药
单位：张凤民 郭淑元 郭彩玲 谷鸿喜(哈尔滨医科大学微生物学教研室，150086)；赵德超(哈尔滨医科大学附属二院，150086)
关键词：柯萨奇B病毒；原位RT-PCR；HeLa细胞
中国地方病学杂志990303 【摘要】 目的 建立定位检测细胞或组织中柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR方法(直接法)。方法 对柯萨奇B病毒(1～6型)感染HeLa细胞，经核酸酶(DNase和RNase)处理后的病毒感染HeLa细胞以及非感染的HeLa细胞进行原位RT-PCR检测。结果 经扩增后，病毒感染的HeLa细胞呈蓝黑阳性信号；并且这种阳性信号经RNase A作用而消失，却不受DNase作用的影响；而非感染的HeLa细胞则不着色。结论 原位RT-PCR法可特异地检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中的病毒RNA，是一种特异和敏感的定位检测方法，可应用于研究该病毒的持续性感染及其与克山病等相关疾病的关系。
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分类号：R373.23 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)03-0166-68
Experimental study on detection of viral RNA of Coxsackie virus B by means of in situ RT-PCR
ZHANG Fengmin,ZHAO Dechao,GUO Shuyuan,et al
Department of Microbiology,Harbin Medical University,Harbin 150086
【Abstract】 Objective To establish a sensitive metho d for detecting Coxsackie virus B RNA in cells and tissues locationally.Methods HeLa cells infected with coxsackie virus B ,tho se treated by DNase,RNase and non-viral infecting HeLa cells by nuclease tr eatment were detected.Results Non-viral infecting HeLa cells were negative,virus-infecting HeLa cells were stained with blue and black color,and the posit ive signals could be removed after digestion of RNase but not DNase.Conclusions It indicated that the method of in situ RT -PCR is specific and sensitive,and will be useful for research on coxsackie vir us B sustainable infection and related diseases.
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【Key words】 Coxsackie virus B In situ RT-PCR HeLa cell
柯萨奇病毒(Coxsackie Virus)为小RNA病毒，主要有A、B两组，其中柯萨奇B组病毒包括1～6个血清型，主要与人类病毒性心肌炎、心肌病及神经系统的感染有关，是影响人类健康的重要病原体之一。目前，有关该病毒与相关疾病，特别是心肌炎、心肌病和克山病等之间的关系，已经获得了一定的研究成果[1～3]。所采用的研究方法主要是PCR或原位杂交等，其中PCR法敏感性较高，但不能对细胞或组织中的病毒RNA进行定位检测，原位杂交法虽可定位，却检测敏感性不高。
为便于直接对柯萨奇B病毒感染组织或细胞中的病毒RNA进行特异和敏感的定位检测，以进一步研究该病毒感染与相关疾病之间的关系，我们建立了检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR方法，并对柯萨奇B病毒感染的HeLa细胞以及经核酸酶处理的病毒感染细胞进行了检测。获满意结果，现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 病毒与细胞 柯萨奇B组病毒(1～6型)常规组织培养，调整各型别病毒滴度分别为100TCID50，备用。病毒增殖与制备待检细胞片均使用HeLa细胞，该细胞用含10%FCS的MEM培养基常规培养。
1.2 RT-PCR引物 按文献由上海复生生物工程公司合成，为柯萨奇病毒的通用引物，其序列来源于CBV基因5′非编码区。外引物是5′-ACCTTTGTGGCCTGTT-3′和5′-CACGGACACCCAAAGTA-3′，内引物是5′-AAGCACTTCTGGACCC-3′和5′-ATTCAGGGGCCGGAGGA-3′。
1.3 PRC用试剂 PCR所用的AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、DNase和RNaseA、蛋白酶K等酶类以及dNTP和生物素-11-dUTP等试剂购于Promage公司。亲合素-碱性磷酸酶、NBT和BCIP等购于北京华美生物工程公司。
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1.4 柯萨奇B病毒感染HeLa细胞片的制备 常规培养HeLa细胞成层后，分别接种1～6型CBV，感染12小时后，分别消化制备细胞悬液，等量混合，调整细胞浓度为300万/ml，滴玻片(0.1ml/片)培养24小时，经丙酮固定后备用。
1.5 原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中病毒RNA 首先用系列乙醇水化待检细胞片，蛋白酶K消化37℃15分钟后备用，其中对核酸酶消化实验的细胞分别使用DNase(10μg/ml)和RNaseA(10μg/ml)以及DNase+RNaseA联合进行作用，37℃过夜处理；然后加入原位RT-PCR反应液(含AMV逆转录酶1U，TaqDNA聚合酶1U，dATP、dCTP、dGTP各为200mmol/L,dTTP140mmol
/L,生物素-11-dUTP70mmol/L等)50μl/片，覆盖盖玻片后，进行逆转录反应(42℃30分钟)和PCR扩增(96℃1分钟，52℃2分钟，72℃2分钟，35次循环)，最后加入亲合素—碱性磷酸酶(0.5mol/L,50μl)作用,进行NBT和BCIP显色反应，37℃2小时。用显微镜观察结果并拍照，其中阳性细胞呈蓝黑着色，阴性细胞不着色。
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2 实验结果
2.1 原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中病毒RNA结果 用原位RT-PCR法对柯萨奇B病毒感染HeLa细胞和未感染的HeLa细胞进行检测。结果可见，经原位RT-PCR扩增后，柯萨奇B病毒感染的HeLa细胞呈蓝黑着色，阳性信号充满细胞，为阳性结果；而非病毒感染的HeLa细胞不着色，为阴性结果。
2.2 经核酸酶处理后柯萨奇B病毒感染HeLa细胞的原位RT-PCR结果 分别对经DNase、RNaseA、DNase+RNaseA处理的柯萨奇B病毒感染HeLa细胞，进行原位RT-PCR检测。结果可见，经RNase作用后柯萨奇B病毒感染HeLa细胞的原位RT-PCR阳性信号消失；并且经DNase+RNase共同作用时，阳性信号也消失；但DNase作用不影响阳性信号。
3 讨论
目前研究柯萨奇B病毒与心肌炎等相关疾患(病毒性心肌炎、心肌病、克山病等)的关系，主要采取的分子生物学方法是聚合酶链式反应(PCR)和原位杂交等方法，尽管这些方法分别具有敏感性、特异性较高(PCR)或者可以定位检测(原位杂交)等方面的优点，但是尚不能把高敏感性与定位检测结合起来，直接用于相关的研究，特别是在研究该病毒的持续性感染如病毒RNA复制与感染细胞表面抗原表达之间关系等方面受到限制。
, http://www.100md.com
自1990年Hasse[4]等首创原位PCR方法后，在病毒学检测等方面进行了广泛的应用，并且原位PCR技术已经从间接法发展成为直接法[5]。本文建立了定位检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR法，并对该病毒感染的HeLa细胞以及经核酸酶处理后的病毒感染细胞进行了检测。结果表明，经原位RT-PCR扩增后，柯萨奇B病毒感染的HeLa细胞呈蓝黑着色，阳性信号充满细胞；而非病毒感染的HeLa细胞不着色；核酸酶消化实验证实，经RNase作用后柯萨奇B病毒感染HeLa细胞的原位RT-PCR阳性信号消失，DNase和RNase共同作用时，阳性信号也消失，但DNase作用不影响阳性信号。说明，原位RT-PCR的阳性信号是柯萨奇B病毒特异性和RNA特异性的。
本文实验结果提示原位RT-PCR法是一种可以特异、敏感地定位检测柯萨奇B病毒感染HeLa细胞中病毒RNA的方法。如果同时对比检测相应组织或细胞中的柯萨奇B病毒相关抗原的表达情况，将有助于阐明柯萨奇B病毒相关疾病如心肌病和克山病等疾患的生物病因，以及进行柯萨奇B病毒相关疾患发生过程中的病毒持续性感染与免疫性病理等机理方面的研究。有关研究将进一步报道。
, http://www.100md.com
基金来源：黑龙江省重点学科后备带头人基金
作者简介：张凤民，男，1963年生，副教授，硕士生导师
参考文献
[1] Bowlrs NE,Richardson PJ,Olsen EGJ,et al.Detection of Coxsackie virus B specific RNA sequence in myocardial biopsy sample from patient with myo carditis and dilated cardiomyopathy [J].Lancet,1986,1120～1123
[2] 沈茜，汪美先，章同华，等.原位核酸杂交法检测柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌组织中的病毒RNA[J].中华微生物学和免疫学杂志，1991,11(3):193～196
, http://www.100md.com
[3] 钟学宽，张凤民，江自然，等.原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与云南亚急性克山病的关系[J].中国地方病学杂志，1993,12(4):193～195
[4] Hasse AJ,Relzel EF,Staskus KA,et al.Amplification and detection of lentivirus DNA in side cells.Proc Natl Acad Sci USA[J].1990,87:4971～4975
[5] Long AA,Komminoth P,Lee E,et al.Comparison of indirect and dir ect in situ PCR in cell,preparation and tissue section,detection of viral DN A,gene rearrangements and chromosomal translocations[J].Histochemistry,1993,99 :151～162
*收稿日期：1998-09-10；修订日期：1998-09-24, 百拇医药