TTV感染及复制与原发性肝癌关系的病例—对照研究
作者：李国坚 吴继周 周元平 刘志明 周桂英 罗光汉 单晓阳
单位：李国坚 吴继周 刘志明 周桂英 罗光汉 单晓阳 广西医科大学第一附院(南宁530021)；周元平 中山医科大学第三附院
关键词：套式-PCR；TTVDNA；HCC；病例—对照研究
广西预防医学990302
摘要 应用病例—对照研究方法对TTV感染及复制与原发性肝癌关系进行研究。选择原发性肝癌病人88例，同时选择非肝病、非肿瘤病人以及献血员75人作为对照。TTVDNA的检查采用套式-PCR方法。研究结果表明，病例组和对照组TTVDNA的检出率分别为20.45%(18/88)和10.67%(8/75)。经统计学分析P值接近显著性水平(P=0.089)。提示，TTV的感染及复制与原发性肝癌发生可能存在一定关系，但目前尚不能下定论。
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A case-control study on the relationship between infection,replication of TTV and hepatocellular carcinoma.
Li Guojian,Wu Jizhou,Zhou Yuanping,et al.
The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning,530021
Abstract A case-control study on the relationship between infection,replication and hepatocellular carcinoma(HCC) was reported in this paper.TTVDNA in sera of 88 patients with hepatocellular carcinoma,and 75 patients with non-liver diseases,non-tumor as well as blood donors was detected by Nested-PCR.The investigation results showed that the positive rates of TTVDNA in the case and control were 20.45%(18/88)and 10.67%(8/75)respectively(P=0.089). The analysis suggests that the infection,replication of TTV might be play a part role of the causation HCC.
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Key words Nested-PCR TTVDNA HCC Case-control study
1997年日本学者在对一名输血后发生不明原因肝炎病人血清进行分析时发现了一种新的肝炎病毒TTV[1]。而后，对非甲—戊型暴发型肝炎、慢性肝炎、肝癌、血友病病人、静脉吸毒者、血液透析病人及献血员调查发现均有不同程度TTV感染[2]。我国广东也发现有此病毒的感染[3]。广西是原发性肝细胞癌(HCC)高发区，过去已对HBV、HCV、HDV以及HGV与HCC关系进行了研究[4]。由于TTV是新发现的肝炎病毒，该病毒与HCC关系如何，目前国内外研究报道甚少。
1 材料与方法
1.1 研究对象 原发性肝癌病人为1998年7月至10月在我院及附属肿瘤医院住院并按全国原发性肝癌的诊断标准进行诊断的原发性肝癌病人88例(其中有病理诊断57例)。其中男性73例，女性15例，年龄22～73岁，平均年龄为38.9岁，对照组为我院住院的非肝病和非肿瘤病人以及献血员共75例。其中男性64例，女性11例，年龄20～61岁，平均39.5岁。
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1.2 检测方法 采取研究对象外周血5ml，分离出血清低温(-20℃)保存备测。应用套式-PCR检测血清中的TTVDNA。TTVDNA引物为中山医科大三院传染病科提供的根据Okamoto等[2]报道而设计的引物。本研究所用套式PCR的程序是：(1)模板制备：于0.5ml离心管中加入裂解液5.5μl和50μl待测血清进行裂解。裂解程序为：55℃30分，97℃15分，将温度降至4℃后取出，12000rpm离心5分钟，取上清液作为第一轮PCR模板。(2)第一轮PCR：取第一轮PCR反应体系含引物T1和T2各20pmol/l,2mmol/l，10×Taq酶Buffer2.1μl，dNTPs 2.1μl,Taq酶2u，以及5μl模板放入0.5ml离心管，反应总体积为20μl，加一滴石蜡油覆盖，上PCR扩增仪进行扩增。循环参数为：94℃40秒，55℃40秒，72℃1分，扩增35个循环，72℃7分钟延长。(3)第二轮PCR：取第二轮PCR反应体系含引物T3和T4各20pmol/l,2mmol/l，10×Taq酶Buffer2.1μl,dNTPs2.1μl,Taq酶2μl，第一轮PCR扩增产物3μl放入0.5ml离心管中，反应总体积为20μl，加1滴石蜡油，上PCR仪进行扩增。循环参数为94℃30秒55℃40秒，72℃50秒，扩增30个循环，72℃7分钟延长。(4)结果判断：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线透射分析仪上观察结果，出现272bP DNA带即为阳性。
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采用华西医科大学卫生统计教研室设计的PEMS统计软件包中的计数资料两样本率比较的χ\+2检验方法，在计算机上运算。
2 结果与讨论
88例原发性肝癌病人血清中TTVDNA检出率为20.45%(18/88)，而对照组仅为10.67%(8/75)。经统计学分析结果表明，两组无显著性差异(P=0.089)。目前认为，原发性肝癌主要病因为HBV感染、饮用污染水源、摄入黄曲霉毒素。除HBV外，HCV的感染也与HCC的发生关系极为密切[5]，在西方国家尤为如此。TTV是一种新发现的肝炎病毒，虽有研究报道认为该病毒可以引起慢性肝损伤，但其致病性如何目前尚不清楚，是人们目前关注的焦点[6]，更不清楚该病毒与HCC发生的关系。本研究结果表明，肝癌病人的TTVDNA阳性率达20.45%(18/88)，高于对照组的10.67%(8/75)，但未达到统计学显著性水平(P=0.089)。此结果似乎提示，TTV的感染及复制与HCC的发生可能存在一定关系。但是，有作者对日本各种肝病的调查发现，原发性肝癌和其他肝病病人中的TTVDNA检出率分别为39%和46%～49%[2]，说明在日本人中TTV的感染与原发性肝癌的发生无明显关系。日本人中各种肝病病人TTVDNA检出率均明显高于我们的研究结果，可能是由于日本和我区的TTV流行情况有差别，也可能是由于所采用的引物敏感性差别有关。由于原发性肝癌是多因素综合作用的结果，因此，不同地区中各种致癌因子作用大小不同，就如HBV、HCV的致肝癌作用一样，HBV在我区肝癌致病作用中起主要作用，而HCV作用甚微。但西方国家和日本，HCV的作用甚至大于HBV，所以，不能除外TTV的作用由于环境因素的差别而所起的致癌作用不同。TTV是一种新发现的肝炎病毒，该病毒的一些基因序列功能尚未弄清。有研究结果表明，未见到TTVDNA整合到肝癌组织中[7]，因此TTV的感染及复制与HCC发生关系如何目前尚难定论，还需深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase level in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
2 Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Mole
-cular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfu
-sion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res,1998,10:1
, 百拇医药
3 周伯平，马为民，孙 彤，等.TTV在非甲一庚型肝炎患者中的检测、克隆及测序.中华传染病杂志，1998，16(3)：111
4 吴继周，汤春园，梁任祥，等.HBV、HCV和HGV的感染对HCC家庭聚集性的影响.广西预防医学，1998，4(3)：135
5 Kew MC,Y MC,Kedda MA，et al.The relative roles of hepatitis B and C viruses in the etiology of hepato cellular carcinoma in Southern African blacks.Gastroenterol，1997，112(1):184
6 Cossart Y.TTV a common virus,but pathogenic?Lancet，1998，352:164
7 Yamamoto T.Hepatocellular carcinomas infecfed with the novel TTVDNA virus lack viral integration.Biochem Biophys Res Commun,1998,251(1):339
1998-12-29收稿。1999-04-02修回。, 百拇医药
单位：李国坚 吴继周 刘志明 周桂英 罗光汉 单晓阳 广西医科大学第一附院(南宁530021)；周元平 中山医科大学第三附院
关键词：套式-PCR；TTVDNA；HCC；病例—对照研究
广西预防医学990302
摘要 应用病例—对照研究方法对TTV感染及复制与原发性肝癌关系进行研究。选择原发性肝癌病人88例，同时选择非肝病、非肿瘤病人以及献血员75人作为对照。TTVDNA的检查采用套式-PCR方法。研究结果表明，病例组和对照组TTVDNA的检出率分别为20.45%(18/88)和10.67%(8/75)。经统计学分析P值接近显著性水平(P=0.089)。提示，TTV的感染及复制与原发性肝癌发生可能存在一定关系，但目前尚不能下定论。
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A case-control study on the relationship between infection,replication of TTV and hepatocellular carcinoma.
Li Guojian,Wu Jizhou,Zhou Yuanping,et al.
The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning,530021
Abstract A case-control study on the relationship between infection,replication and hepatocellular carcinoma(HCC) was reported in this paper.TTVDNA in sera of 88 patients with hepatocellular carcinoma,and 75 patients with non-liver diseases,non-tumor as well as blood donors was detected by Nested-PCR.The investigation results showed that the positive rates of TTVDNA in the case and control were 20.45%(18/88)and 10.67%(8/75)respectively(P=0.089). The analysis suggests that the infection,replication of TTV might be play a part role of the causation HCC.
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Key words Nested-PCR TTVDNA HCC Case-control study
1997年日本学者在对一名输血后发生不明原因肝炎病人血清进行分析时发现了一种新的肝炎病毒TTV[1]。而后，对非甲—戊型暴发型肝炎、慢性肝炎、肝癌、血友病病人、静脉吸毒者、血液透析病人及献血员调查发现均有不同程度TTV感染[2]。我国广东也发现有此病毒的感染[3]。广西是原发性肝细胞癌(HCC)高发区，过去已对HBV、HCV、HDV以及HGV与HCC关系进行了研究[4]。由于TTV是新发现的肝炎病毒，该病毒与HCC关系如何，目前国内外研究报道甚少。
1 材料与方法
1.1 研究对象 原发性肝癌病人为1998年7月至10月在我院及附属肿瘤医院住院并按全国原发性肝癌的诊断标准进行诊断的原发性肝癌病人88例(其中有病理诊断57例)。其中男性73例，女性15例，年龄22～73岁，平均年龄为38.9岁，对照组为我院住院的非肝病和非肿瘤病人以及献血员共75例。其中男性64例，女性11例，年龄20～61岁，平均39.5岁。
, http://www.100md.com
1.2 检测方法 采取研究对象外周血5ml，分离出血清低温(-20℃)保存备测。应用套式-PCR检测血清中的TTVDNA。TTVDNA引物为中山医科大三院传染病科提供的根据Okamoto等[2]报道而设计的引物。本研究所用套式PCR的程序是：(1)模板制备：于0.5ml离心管中加入裂解液5.5μl和50μl待测血清进行裂解。裂解程序为：55℃30分，97℃15分，将温度降至4℃后取出，12000rpm离心5分钟，取上清液作为第一轮PCR模板。(2)第一轮PCR：取第一轮PCR反应体系含引物T1和T2各20pmol/l,2mmol/l，10×Taq酶Buffer2.1μl，dNTPs 2.1μl,Taq酶2u，以及5μl模板放入0.5ml离心管，反应总体积为20μl，加一滴石蜡油覆盖，上PCR扩增仪进行扩增。循环参数为：94℃40秒，55℃40秒，72℃1分，扩增35个循环，72℃7分钟延长。(3)第二轮PCR：取第二轮PCR反应体系含引物T3和T4各20pmol/l,2mmol/l，10×Taq酶Buffer2.1μl,dNTPs2.1μl,Taq酶2μl，第一轮PCR扩增产物3μl放入0.5ml离心管中，反应总体积为20μl，加1滴石蜡油，上PCR仪进行扩增。循环参数为94℃30秒55℃40秒，72℃50秒，扩增30个循环，72℃7分钟延长。(4)结果判断：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线透射分析仪上观察结果，出现272bP DNA带即为阳性。
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采用华西医科大学卫生统计教研室设计的PEMS统计软件包中的计数资料两样本率比较的χ\+2检验方法，在计算机上运算。
2 结果与讨论
88例原发性肝癌病人血清中TTVDNA检出率为20.45%(18/88)，而对照组仅为10.67%(8/75)。经统计学分析结果表明，两组无显著性差异(P=0.089)。目前认为，原发性肝癌主要病因为HBV感染、饮用污染水源、摄入黄曲霉毒素。除HBV外，HCV的感染也与HCC的发生关系极为密切[5]，在西方国家尤为如此。TTV是一种新发现的肝炎病毒，虽有研究报道认为该病毒可以引起慢性肝损伤，但其致病性如何目前尚不清楚，是人们目前关注的焦点[6]，更不清楚该病毒与HCC发生的关系。本研究结果表明，肝癌病人的TTVDNA阳性率达20.45%(18/88)，高于对照组的10.67%(8/75)，但未达到统计学显著性水平(P=0.089)。此结果似乎提示，TTV的感染及复制与HCC的发生可能存在一定关系。但是，有作者对日本各种肝病的调查发现，原发性肝癌和其他肝病病人中的TTVDNA检出率分别为39%和46%～49%[2]，说明在日本人中TTV的感染与原发性肝癌的发生无明显关系。日本人中各种肝病病人TTVDNA检出率均明显高于我们的研究结果，可能是由于日本和我区的TTV流行情况有差别，也可能是由于所采用的引物敏感性差别有关。由于原发性肝癌是多因素综合作用的结果，因此，不同地区中各种致癌因子作用大小不同，就如HBV、HCV的致肝癌作用一样，HBV在我区肝癌致病作用中起主要作用，而HCV作用甚微。但西方国家和日本，HCV的作用甚至大于HBV，所以，不能除外TTV的作用由于环境因素的差别而所起的致癌作用不同。TTV是一种新发现的肝炎病毒，该病毒的一些基因序列功能尚未弄清。有研究结果表明，未见到TTVDNA整合到肝癌组织中[7]，因此TTV的感染及复制与HCC发生关系如何目前尚难定论，还需深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase level in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
2 Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Mole
-cular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfu
-sion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res,1998,10:1
, 百拇医药
3 周伯平，马为民，孙 彤，等.TTV在非甲一庚型肝炎患者中的检测、克隆及测序.中华传染病杂志，1998，16(3)：111
4 吴继周，汤春园，梁任祥，等.HBV、HCV和HGV的感染对HCC家庭聚集性的影响.广西预防医学，1998，4(3)：135
5 Kew MC,Y MC,Kedda MA，et al.The relative roles of hepatitis B and C viruses in the etiology of hepato cellular carcinoma in Southern African blacks.Gastroenterol，1997，112(1):184
6 Cossart Y.TTV a common virus,but pathogenic?Lancet，1998，352:164
7 Yamamoto T.Hepatocellular carcinomas infecfed with the novel TTVDNA virus lack viral integration.Biochem Biophys Res Commun,1998,251(1):339
1998-12-29收稿。1999-04-02修回。, 百拇医药