学龄前儿童龋病发病的多因素logistic回归分析
作者：庞 云 邬小佶 李 华 朱新英 陈贵珍 朱 杰
单位：马鞍山钢铁公司医院， 安徽 马鞍山 243000
关键词：龋病；回归分析
疾病控制杂志990325
【(摘要】 目的 介绍一种灵敏、简便的方法检测短串联重复序列(STR)。方法 采用PCR技术扩增STR，扩增产物经PAGE后银染。结果 银染后的产物清晰，易于判断相差2bp的核酸基因型。结论 PCR技术结合银染法提高检测的灵敏度，适于临床应用。
【中图分类号】 R446 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(1999)03-0209-02
, http://www.100md.com Fast silver staining method for detecting short tandem repeat
FANG Ya-ping， GUAN Bao-xiang， WANG Li-hua， XU Xi-ping.
Anhui Meizhong Biomedicine and Environmental Health Institute， Anqing 246001， China
【Abstract】 Objective To present a sensitive and simple method to detect short tandem repeat (STR). Method After PCR and PAGE，short DNA fragment were detected by a simplified silver staining method. Result The short DNA fragment were visualized clearly by silver staining，used to detect genotype. Conclusion PCR with silver staining method increased sensitivity， and can be used in clinical investigations.
, 百拇医药
【Key words】 short tandem repeat (STR); polymerase chain reaction (PCR); silver staining
短串联重复序列(short tandem repeat， STR)又称微卫星DNA，它是由2～7个碱基对作为核心单位串联重复形成的一类DNA序列，由STR在人基因组中出现的数目和频率的变化构成了STR位点的遗传多态性。它在人类基因组中广泛存在，且重组率低，在人群中表现高度个体特异性[1]。LDL受体基因第18外显子3′末端非翻译区上一段短片段串联重复序列(dTA)n在人群中存在多态性[2]。 我们应用多聚酶链反应(PCR)，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)建立了稳定观察只相差2bp核酸的方法，检测了家族性胆囊结石家系中(dTA)n多态性位点的基因型。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 材料 红细胞、白细胞裂解液、蛋白沉淀液、DNA水化液由美国GENTRA SYSTEMS INC.提供。PCR缓冲液、Taq酶由德国QIAGEN公司提供。dNTP、引物由美国New England Bio.Lab提供。PCR仪为英国HYBAID公司OMN-E型。高压电泳仪为美国BIO-RAD公司PAC-3000型。垂直电泳槽为DYY-22A型，由北京东方科贸中心提供。
银染所用的试剂均为国产分析纯，所有试剂均用去离子双重蒸馏水配制。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA的提取 取EDTA-Na4抗凝静脉血5 ml，加入30 ml红细胞裂解液，混匀后静置10 min、离心(3 000 rpm)、弃去上清液、加入RNase 25 μl(4 g.L-1)、蛋白酶30 μl(20 g.L-1)，白细胞裂解液10 ml，混匀后37℃温浴15 min，冷却至室温，加入4 ml蛋白沉淀液(保存于-20℃)，混匀后离心(3 000 rpm)，倾倒上清于10 ml异丙醇中，提取絮状DNA，加入1.5 ml DNA水化液过夜溶解。
, 百拇医药
1.2.2 DNA片段扩增 两引物序列如下： 5′CACTGAACAAATACAGCAACCAGGG 3′；5′CACTTTGTATATTGGTTGAAACTGT 3′。10 μl PCR体系包括：模板DNA 5 μl(10 ng.μl-1)，10×PCR缓冲液1 μl(含15 mM MgCl2)，引物各0.12 μl(200 nM)， Taq酶0.05 μl(5 U.μl-1)， dNTP 0.4 μl(200 uM)，灭菌去离子水3.31 μl。
PCR循环条件：94℃ 预变性5 min，94℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸7 min。
1.2.3 扩增产物的检测 配制10%聚丙烯酰胺凝胶(厚1 mm)，其中含7 M尿素，丙烯酰胺与聚丙烯酰胺比例为19∶1，电泳以1×TBE为缓冲液，PCR产物3 μl加上3 μl上样缓冲液(95%乙酰胺，0.05%溴甲酚兰，0.05%二甲苯氰)。电压180 V，电泳12小时。
, 百拇医药
电泳结束后，将凝胶移至已用去离子双重蒸馏水冲洗的塑料容器内，进行银染。
2 结果
LDL受体基因第18外显子的(dAT)n多态位点存在三种基因，分别为：A等位基因106 bp，B等位基因108 bp，C等位基因112 bp，相应的有六种基因型：AA, AB, AC, BB, BC, CC。如图1所示，银染所示的结果清晰，易辨认。
图1 PAGE后银染结果
本照片中16泳道为标准分子量标计物。1道为杂合子(bc);2，3，7，8，11道为纯合子(aa)；13道为纯合子(bb)；4，5，9，10道为杂合子(ac)；6道为杂合子(ab)；15道为纯合子(cc)；12，14道为PCR失败，无结果。
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3 讨论
PAGE上的核酸银染方法首先在Merril等的报告中提出，他们用HaeⅢ限制性核酸内切酶消化噬菌体(X174的双链DNA后进行PAGE，分离出的片段进行银染时在硝酸银溶液中加入还原剂甲醛以提高染色灵敏度，银的络合剂硫代硫酸钠则可以降低背景染色[3]。我们在做LDL受体基因型时对银染条件经实验证实得到一种较稳定的可分辨出相差2 bp的银染方法。
当甲醛浓度较高时，染色时间要缩短，浓度一般控制在500 μl*L-1。浓度较高时颜色发黄，背景污浊，浓度较低不仅染色时间延长而且不易着色。硫代硫酸钠作为银的络合剂，可减少非特异染色。它的用量可根据实验条件摸索，过多胶颜色发黄，过少则不足以鳌合掉游离的银离子，胶颜色发黑，一般10 g*L-1的硫代硫酸钠用量为10～20 μl*L-1。如果显色进程难控制，可将显色剂Na2CO3溶液(临用前配制)预冷至10℃，在硝酸银溶液(临用前配制)染色水洗后先用少量Na2CO3溶液浸胶，出现棕黑色后立即析出，再加入10℃ Na2CO3溶液显色至满意的条带出现。
, 百拇医药
胶的浓度和厚度也与染色效果有关。胶的浓度低于10%时，分辨力降低，难以分辨出2个碱基的差别;浓度过高时，不仅电泳时间需延长，而且银染后的条带不甚清晰。如果制备的是<1 mm的薄胶，染色时间需适当延长，如染色不足，由水漂洗后从染色的步骤开始，再试染一次。切记，在染色过程中应小心操作，以保证PAGE完整性。另外，银染过程中所用的塑料容器应用去离子水清洗干净，以减少银离子的附着。
银染法灵敏度高，检测蛋白核酸时可检测到1 pg*mm-3的交联物，这足以检测ng水平的DNA，在核酸分析中，对SSCP、 STR以及测序胶的染色中发挥重要作用。检测STR以前多采用放射自显影法，不仅耗时，价格昂贵，而且要用同位素，放射性污染严重。1994年Schwengel等采用高效荧光法对STR的产物进行半自动基因分型[4]， 此法虽有与同位素同样高的精确性，但目前国内难以普及。银染方法不需特殊的试剂仪器，简便易行，结果直观，还可以复制、摄影保存。银染试剂通常用国产的分析纯试剂即可，一般的临床实验室均可开展。
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【作者简介】 方亚平(1975-)，女，主管技师
关宝祥(1966-)，男，硕士研究生
【参考文献】
[1] Lin AM，Sprecher CJ，Puers C, et al. Multiplex sets for the amplification of polymorphic short tandem repeat loci-silver stain and fluorescence detection[J]. Biotechniques，1996，20(6)：882～889.
[2] Zuliani G，Hobbs HH. Dinucleotide repeat polymorphism at the 3′ end of the LDL receptor gene[J]. Nucleic Acids Research，1990，18：4300～4305.
, 百拇医药
[3] Brant JB，Gustavo CA， Peter MG. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J]. Anal Biochemistry，1991，196：80～83.
[4] Schwengel DA , Jedlicka AE , Nanthakumar EJ, et al. Comparision of fluorescence based semi-automated genotyping of multiple microsatellite loci with autoradiography techniques[J]. Genomics，1994，22:46～54.
(收稿日期 1999-04-26), 百拇医药
单位：马鞍山钢铁公司医院， 安徽 马鞍山 243000
关键词：龋病；回归分析
疾病控制杂志990325
【(摘要】 目的 介绍一种灵敏、简便的方法检测短串联重复序列(STR)。方法 采用PCR技术扩增STR，扩增产物经PAGE后银染。结果 银染后的产物清晰，易于判断相差2bp的核酸基因型。结论 PCR技术结合银染法提高检测的灵敏度，适于临床应用。
【中图分类号】 R446 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(1999)03-0209-02
, http://www.100md.com Fast silver staining method for detecting short tandem repeat
FANG Ya-ping， GUAN Bao-xiang， WANG Li-hua， XU Xi-ping.
Anhui Meizhong Biomedicine and Environmental Health Institute， Anqing 246001， China
【Abstract】 Objective To present a sensitive and simple method to detect short tandem repeat (STR). Method After PCR and PAGE，short DNA fragment were detected by a simplified silver staining method. Result The short DNA fragment were visualized clearly by silver staining，used to detect genotype. Conclusion PCR with silver staining method increased sensitivity， and can be used in clinical investigations.
, 百拇医药
【Key words】 short tandem repeat (STR); polymerase chain reaction (PCR); silver staining
短串联重复序列(short tandem repeat， STR)又称微卫星DNA，它是由2～7个碱基对作为核心单位串联重复形成的一类DNA序列，由STR在人基因组中出现的数目和频率的变化构成了STR位点的遗传多态性。它在人类基因组中广泛存在，且重组率低，在人群中表现高度个体特异性[1]。LDL受体基因第18外显子3′末端非翻译区上一段短片段串联重复序列(dTA)n在人群中存在多态性[2]。 我们应用多聚酶链反应(PCR)，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)建立了稳定观察只相差2bp核酸的方法，检测了家族性胆囊结石家系中(dTA)n多态性位点的基因型。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 材料 红细胞、白细胞裂解液、蛋白沉淀液、DNA水化液由美国GENTRA SYSTEMS INC.提供。PCR缓冲液、Taq酶由德国QIAGEN公司提供。dNTP、引物由美国New England Bio.Lab提供。PCR仪为英国HYBAID公司OMN-E型。高压电泳仪为美国BIO-RAD公司PAC-3000型。垂直电泳槽为DYY-22A型，由北京东方科贸中心提供。
银染所用的试剂均为国产分析纯，所有试剂均用去离子双重蒸馏水配制。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA的提取 取EDTA-Na4抗凝静脉血5 ml，加入30 ml红细胞裂解液，混匀后静置10 min、离心(3 000 rpm)、弃去上清液、加入RNase 25 μl(4 g.L-1)、蛋白酶30 μl(20 g.L-1)，白细胞裂解液10 ml，混匀后37℃温浴15 min，冷却至室温，加入4 ml蛋白沉淀液(保存于-20℃)，混匀后离心(3 000 rpm)，倾倒上清于10 ml异丙醇中，提取絮状DNA，加入1.5 ml DNA水化液过夜溶解。
, 百拇医药
1.2.2 DNA片段扩增 两引物序列如下： 5′CACTGAACAAATACAGCAACCAGGG 3′；5′CACTTTGTATATTGGTTGAAACTGT 3′。10 μl PCR体系包括：模板DNA 5 μl(10 ng.μl-1)，10×PCR缓冲液1 μl(含15 mM MgCl2)，引物各0.12 μl(200 nM)， Taq酶0.05 μl(5 U.μl-1)， dNTP 0.4 μl(200 uM)，灭菌去离子水3.31 μl。
PCR循环条件：94℃ 预变性5 min，94℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸7 min。
1.2.3 扩增产物的检测 配制10%聚丙烯酰胺凝胶(厚1 mm)，其中含7 M尿素，丙烯酰胺与聚丙烯酰胺比例为19∶1，电泳以1×TBE为缓冲液，PCR产物3 μl加上3 μl上样缓冲液(95%乙酰胺，0.05%溴甲酚兰，0.05%二甲苯氰)。电压180 V，电泳12小时。
, 百拇医药
电泳结束后，将凝胶移至已用去离子双重蒸馏水冲洗的塑料容器内，进行银染。
2 结果
LDL受体基因第18外显子的(dAT)n多态位点存在三种基因，分别为：A等位基因106 bp，B等位基因108 bp，C等位基因112 bp，相应的有六种基因型：AA, AB, AC, BB, BC, CC。如图1所示，银染所示的结果清晰，易辨认。
图1 PAGE后银染结果
本照片中16泳道为标准分子量标计物。1道为杂合子(bc);2，3，7，8，11道为纯合子(aa)；13道为纯合子(bb)；4，5，9，10道为杂合子(ac)；6道为杂合子(ab)；15道为纯合子(cc)；12，14道为PCR失败，无结果。
, http://www.100md.com
3 讨论
PAGE上的核酸银染方法首先在Merril等的报告中提出，他们用HaeⅢ限制性核酸内切酶消化噬菌体(X174的双链DNA后进行PAGE，分离出的片段进行银染时在硝酸银溶液中加入还原剂甲醛以提高染色灵敏度，银的络合剂硫代硫酸钠则可以降低背景染色[3]。我们在做LDL受体基因型时对银染条件经实验证实得到一种较稳定的可分辨出相差2 bp的银染方法。
当甲醛浓度较高时，染色时间要缩短，浓度一般控制在500 μl*L-1。浓度较高时颜色发黄，背景污浊，浓度较低不仅染色时间延长而且不易着色。硫代硫酸钠作为银的络合剂，可减少非特异染色。它的用量可根据实验条件摸索，过多胶颜色发黄，过少则不足以鳌合掉游离的银离子，胶颜色发黑，一般10 g*L-1的硫代硫酸钠用量为10～20 μl*L-1。如果显色进程难控制，可将显色剂Na2CO3溶液(临用前配制)预冷至10℃，在硝酸银溶液(临用前配制)染色水洗后先用少量Na2CO3溶液浸胶，出现棕黑色后立即析出，再加入10℃ Na2CO3溶液显色至满意的条带出现。
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胶的浓度和厚度也与染色效果有关。胶的浓度低于10%时，分辨力降低，难以分辨出2个碱基的差别;浓度过高时，不仅电泳时间需延长，而且银染后的条带不甚清晰。如果制备的是<1 mm的薄胶，染色时间需适当延长，如染色不足，由水漂洗后从染色的步骤开始，再试染一次。切记，在染色过程中应小心操作，以保证PAGE完整性。另外，银染过程中所用的塑料容器应用去离子水清洗干净，以减少银离子的附着。
银染法灵敏度高，检测蛋白核酸时可检测到1 pg*mm-3的交联物，这足以检测ng水平的DNA，在核酸分析中，对SSCP、 STR以及测序胶的染色中发挥重要作用。检测STR以前多采用放射自显影法，不仅耗时，价格昂贵，而且要用同位素，放射性污染严重。1994年Schwengel等采用高效荧光法对STR的产物进行半自动基因分型[4]， 此法虽有与同位素同样高的精确性，但目前国内难以普及。银染方法不需特殊的试剂仪器，简便易行，结果直观，还可以复制、摄影保存。银染试剂通常用国产的分析纯试剂即可，一般的临床实验室均可开展。
, http://www.100md.com
【作者简介】 方亚平(1975-)，女，主管技师
关宝祥(1966-)，男，硕士研究生
【参考文献】
[1] Lin AM，Sprecher CJ，Puers C, et al. Multiplex sets for the amplification of polymorphic short tandem repeat loci-silver stain and fluorescence detection[J]. Biotechniques，1996，20(6)：882～889.
[2] Zuliani G，Hobbs HH. Dinucleotide repeat polymorphism at the 3′ end of the LDL receptor gene[J]. Nucleic Acids Research，1990，18：4300～4305.
, 百拇医药
[3] Brant JB，Gustavo CA， Peter MG. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J]. Anal Biochemistry，1991，196：80～83.
[4] Schwengel DA , Jedlicka AE , Nanthakumar EJ, et al. Comparision of fluorescence based semi-automated genotyping of multiple microsatellite loci with autoradiography techniques[J]. Genomics，1994，22:46～54.
(收稿日期 1999-04-26), 百拇医药