单细胞电泳试验检测接触丙烯腈男工精子DNA双链断裂
作者：徐德祥 SHEN Han-min ONG Chun-nan
单位：
徐德祥(安徽医科大学卫生毒理学教研室， 安徽 合肥 230032)；SHEN Han-min ONG Chun-nan(新加坡国立大学社区、职业和家政医学系， 新加坡 119260)
关键词：丙烯腈；精子；DNA断裂；单细胞凝胶电泳试验(慧星试验)
疾病控制杂志990309
【摘要】 目的 探讨接触丙烯腈对男工精子DNA损伤作用。方法 用单细胞凝胶电泳试验或称慧星试验对9名接触丙烯腈男工和9名健康对照者精子DNA链断裂进行了检测。结果 接触组男工精子细胞核平均慧星尾长为(8.8±3.68)μm，明显长于对照组的(4.5±2.25)μm。接触组1级、2级、3级和4级慧星百分率分别为5.5%、8.7%、6.7%和9.0%，明显高于对照组的4.4%、3.3%、4.0%和4.2%。结论 接触丙烯腈引起男工精子DNA链断裂，并可能损害男性生殖功能。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R135.1； R446.119 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(1999)03-0175-03
Detection of acrylonitrile-induced DNA double strand breakage in ACN-exposed workers' sperm using single cell gel electrophoresis
XU De-xiang, SHEN Han-min, ONG Chun-nan.
Department of Hygiene Toxicology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
【Abstract】 Objective To assess acrylonitrile (ACN)-induced DNA strand breakage in human sperm cells. Methods Single cell gel electrophoresis(SCGE) or Comet assay was used to investigate DNA strand breakage in sperm cells of 9 ACN-exposed workers. Comet tail length of each sperm cell was measured and the degree of DNA damage was graded visualy into 5 grades. Results
, 百拇医药
Mean tail length of comet assay was 8.8±3.68 μm in exposed group, and 4.5±2.25 μm in the control. The rates of grade 1, grade 2, grade 3 and grade 4 comets were 5.5%, 8.7%, 6.7% and 9.0% in exposure group, significantly higher than 4.4%, 3.3%, 4.0% and 4.2% in the control. Conclusions These results suggest that ACN can act as a genotoxic agent by inducing DNA breakage in spermatogenesis and may impair the male reproductive function in ACN-exposed workers.
【Key words】 acrylonitrile(ACN); sperm; DNA breakage; single cell gel electrophoresis(comet assay)
, http://www.100md.com
丙烯腈(acrylonitrile ACN)是工业有机合成的重要单体，广泛应用于腈纶纤维、丁腈橡胶、ABS工业塑料及某些合成树脂的制造。有关ACN的一般毒作用资料较多[1]，但随着毒理学研究的不断深入，ACN的特殊毒作用尤其是致癌、致畸和致突变作用已引起越来越广泛的关注。大量实验研究表明，ACN对试验动物有致癌和致畸作用[2～4]。此外，ACN与人类肺癌的关系以及ACN引起的生殖毒作用也先后在长期接触ACN职工中得到证实[5～7]。本文用本实验室建立的单细胞凝胶电泳试验(single cell gel electropherosis, SCGE)或称慧星实验(comet assay)技术对某腈纶厂9名ACN接触男工和9名对照者的精子DNA链断裂进行了检测和分析，为进一步评价ACN的男性生殖毒作用并探讨其毒作用机理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 对象 实验组9例，某腈纶厂男工，ACN接触时间均为2.8年，各采样点各时点(每月定时定点检测一次)ACN空气浓度均低于国家车间空气卫生标准(2 mg.m-3)。年龄范围：25～35岁。对照组9例，无ACN接触史，年龄范围24～35岁。所有研究对象在近一年内无放射线和可疑药物接触史。
, 百拇医药
1.2 试剂 低溶点和正常溶点凝胶，生命技术公司(Gaitherburg, MD)产品。其它试剂均为Sigma公司(St. Louse, MO)产品。
1.3 仪器 Nikon AFX-IIA型荧光显微镜，由日本Nikon公司生产。
表1 ACN接触组和对照组之间精液常规检测结果比较(
±s) 组别
n
体积
(ml)
密度
106.ml-1
, http://www.100md.com
总数
106
活率
%
活 力(%)
异常率
(%)
0
Ⅰ
Ⅱ-Ⅲ
接触组
9
2.4±0.8
, http://www.100md.com
73±15**
208±170*
61±12
39±4
11±2
50±5
47.7±10.5
对照组
9
2.1±0.8
145±38
287±124
, 百拇医药
59±8
41±4
6±1
53±6
48.6±8.6
与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01
1.4 精液标本的采集 采用手淫法。采集前禁欲3～5天，采集后盛于无菌容器内，室温下液化后进行精液常规检查[8]，剩余样品分装，-70℃保存。
1.5 单细胞电泳试验 根据我室首次建立的单细胞电泳技术，具体操作步骤如下：首先在冰冻玻片上铺上100 μl 0.75%的正常溶点凝胶，盖上盖玻片，在室温下静置5 min。6 μl精子细胞悬液(2×106细胞.ml-1)与54 μl 0.75%的低溶点凝胶在37℃条件下充分混匀后铺在第一层凝胶上，在4℃静置8 min。120 μl 0.75%低溶点凝胶铺在第二层凝胶上，在4℃静置8 min。玻片在含有2.5 M NaCl, 100 mM Na2-EDTA, 10 mM Tris, 1% sodium lauryl sarcosine, 1% Triton X-100 (pH10)的裂解液中4℃条件下作用1 h以裂解精子细胞。然后玻片依次在下列溶液中作用以解聚精子核中DNA，首先在含有2.5 M NaCl, 5 mM Tris, 0.05% sodium lauryl sarcosin, 10 mM DTT (pH7.4)溶液中4℃条件下作用1 h，接着在含有2.5 M NaCl, 5 mM Tris, 0.05% sodium lauryl sarcosine, 10μg.ml-1 RNase(pH7.4)溶液中37℃条件下作用4 h；最后在含有2.5 M NaCl, 5 mM Tris, 0.05% sodium lauryl sarcosine, 200 μg.ml-1 蛋白酶K(pH7.4)溶液中37℃条件下作用15 h。玻片在含有300 mM醋酸钠、100 mM Tris(pH10)的电解液中平衡20 min，在12 V(0.46 V.cm-1)、100 mA、4℃条件下电泳60 min。玻片最后在0.4 M Tris-HCl缓冲液中中和5 min，用15 μg.ml-1的EB染色、封片。
, 百拇医药
1.6 镜检和计数 使用蓝色激发光，在Nikon荧光显微镜油镜下选择无重叠，荧光信号强的精子核计数。使用目镜测微尺测量每个精子细胞核的慧星尾长，并根据慧星尾部DNA含量将精子细胞核DNA损伤程度分为5级：0级：<5%，无损伤(核基本完整)；1级：5%～20%，轻度损伤；2级：20%～40%，中度损伤；3级：40%～95%，重度损伤；4级：>95%，完全损伤(核基本消失)。每个样本重复测试3次，每次计数100个精子。
1.7 统计分析 所有数据用SPSS和Excel软件包处理。
2 结果
2.1 精液常规分析 9名健康者和9名ACN接触男工精液常规检测结果显示，接触组精子密度和精子总数明显低于对照组，见表1。
2.2 精子DNA链断裂 用本室建立的单细胞电泳试验(慧星试验)方法检测人精子细胞，在荧光显微镜下可观察到明显的慧尾。ACN接触组和对照组平均慧尾长度分别是(8.8±3.68)μm和(4.5±2.25)μm，有明显差异，见图1(P<0.01)。ACN接触组完整精子细胞(0级)和1级、2级、3级、4级慧星精子细胞百分率分别为70.1%和5.5%、8.7%、6.7%、9.0%，与对照组的84.1%和4.4%、3.3%、4.0%、4.2%有明显差异(P<0.01、图2)。
, 百拇医药
图1 接触组与对照组之间平均慧星尾长(μm)的差异比较(±s)
图2 接触组和对照组之间不同等级慧星精子细胞的差异比较(%)
3 讨论
ACN对实验动物的生殖和胚胎毒性在几个经典的大鼠三代繁殖实验中得到证实[3，4]。有关ACN对人的生殖毒性，有两篇有价值的研究报告。其一，对534名ACN接触男工的生殖流行病学调查结果显示：接触组妻子的死胎死产、新生儿先天性畸形和自然流产的相对危险度分别高达4.73、3.89和2.46[6]。而对477名接触ACN女工妊娠结局的调查也发现，孕期接触ACN引起妊娠合并症、恶阻、贫血，以及早产、新生儿出生缺陷发生率明显升高[7]。本文通过对9名ACN接触男工和9名对照者精液的常规检查，发现接触组平均精子密度和精子总数均明显低于对照组。这些研究结果表明，ACN对职业接触男工和女工均有生殖毒作用。然而，由于长期以来缺少快速和有效的检测人类生殖遗传毒作用的实验方法，有关ACN是否引起生殖细胞遗传毒作用却了解不多，仅有的几篇报告均来自动物试验结果。对雄性小鼠睾丸的生化和病理研究发现，ACN可引起睾丸内一系列酶活性的改变，主要表现为三梨糖醇脱氢酶(SDH)和酸性磷酸酶活性的降低以及乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖醛酸酶活性的升高，并出现输精管变性和精子数减少[9]。在随后的研究中进一步证实，ACN与小鼠睾丸组织中DNA发生共价结合，干扰DNA合成和修复过程[10]。
, 百拇医药
近年来，分子生物学技术取得重大突破，作者早前用荧光原位杂位(FISH)对18名男工精子性染色体非整倍体进行了检测，结果显示9名接触ACN男工性染色体非整倍体发生率为0.70%，明显高于对照组的0.35%。其中XX、YY和XY二体百分率分别为0.10%、0.23%和0.37%，明显高于对照组的0.05%、0.10%和0.20%[11]，第1次用分子生物学技术证实ACN可引起人精子性染色体数目畸变。Chang等的研究结果显示，ACN引起成年人支气管上皮细胞DNA单链断裂[12]，表明在体外条件下ACN是体细胞DNA断裂剂。本文使用单细胞电泳技术对9名接触时间为2.8年，接触浓度低于2 mg.m-3(车间最高容许浓度)的ACN接触男工精子DNA链断裂进行的检测结果表明：ACN接触男工精子细胞核平均慧星尾长为(8.8±3.68)μm，明显高于对照组的(4.5±2.25)μm；1级、2级、3级和4级慧星发生率分别为5.5%、8.7%、6.7%和9.0%，明显高于对照组的4.4%、3.3%、4.0%和4.2%，表明即使接触低于目前车间最高容许浓度的ACN也可能引起人精子细胞DNA链断裂。但由于本次研究的样本数太少，ACN的生殖毒作用及其毒作用机理尚需要在以后的研究中进一步探讨。
, 百拇医药
【基金项目】 中华医学基金(CMB)资助课题
【作者简介】 徐德祥(1962-)，副教授，硕士
SHEN Han-min(1964-),研究员，博士
ONG Chun-nan(1949-)，教授，博士
【参考文献】
[1] 张正东，戴修道. ACN毒理学研究进展[J]. 中国公共卫生学报， 1994，13(4)：248～250.
[2] Maltoni CA. Carcinogenicity on bioassays rats of acrylonitrile administered by inhalation and ingestion[J]. Med Law， 1977，68：401～404.
, 百拇医药
[3] Beliles RP. Three-generation reproduction study of rats receiving acrylonitrile in drinking water BI project NO 2660[R]. Washington DC： Chemical Manufacturers Association, February, 1980.
[4] Murray FJ. Teratogenicity of acrylonitrile given to rats by gavage or by inhalation[J]. Food Cosment Toxicol, 1978,16(6):547～550.
[5] O'Berg M. Epidemiology study of workers exposed to acrylonitrile[J]. J Occup Med, 1980,22:245～249.
, http://www.100md.com
[6] 吴维铠，苏 江，黄美媛，等. 接触ACN男工的生殖结局流行病学调查[J]. 中华劳动卫生职业病杂志，1994，12：261～263.
[7] 吴维皑，苏 江，黄美媛，等. ACN接触女工的生殖流行病学调查[J]. 中华预防医学杂志，1995，29：83～85.
[8] WHO. WHO laboratory manual for the examination of human sperm and sperm-cervical macus interaction. 3rd[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1992.43～44.
[9] Tandon R, Saxena DK, Chandra SV, et al. Testicular effects of acrylonitrile in mice[J]. Toxicol Lett, 1988,42:55～58.
, 百拇医药
[10] Ahmed AE, Abdel-Rahman SZ， Noural Deen AM. Acrylonitrile interaction with testicular DNA in rats[J]. J Biochem Toxicol, 1992,7:5～8.
[11] 徐德祥，郑履康，邓丽霞. 荧光原位杂交检测接触ACN男工精子性染色体数目畸变[J]. 癌变*畸变*突变. 待发表.
[12] Chang CM, Hsia MT, Stoner GD， et al. Acrylonitrile-induced sister-chromatid exchanges and DNA single-strand breaks in adult human bronchial epithelial cells[J]. Mutat Res， 1990,241:355～358.
(收稿日期 1999-05-16), http://www.100md.com
单位：
徐德祥(安徽医科大学卫生毒理学教研室， 安徽 合肥 230032)；SHEN Han-min ONG Chun-nan(新加坡国立大学社区、职业和家政医学系， 新加坡 119260)
关键词：丙烯腈；精子；DNA断裂；单细胞凝胶电泳试验(慧星试验)
疾病控制杂志990309
【摘要】 目的 探讨接触丙烯腈对男工精子DNA损伤作用。方法 用单细胞凝胶电泳试验或称慧星试验对9名接触丙烯腈男工和9名健康对照者精子DNA链断裂进行了检测。结果 接触组男工精子细胞核平均慧星尾长为(8.8±3.68)μm，明显长于对照组的(4.5±2.25)μm。接触组1级、2级、3级和4级慧星百分率分别为5.5%、8.7%、6.7%和9.0%，明显高于对照组的4.4%、3.3%、4.0%和4.2%。结论 接触丙烯腈引起男工精子DNA链断裂，并可能损害男性生殖功能。
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【中图分类号】 R135.1； R446.119 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(1999)03-0175-03
Detection of acrylonitrile-induced DNA double strand breakage in ACN-exposed workers' sperm using single cell gel electrophoresis
XU De-xiang, SHEN Han-min, ONG Chun-nan.
Department of Hygiene Toxicology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
【Abstract】 Objective To assess acrylonitrile (ACN)-induced DNA strand breakage in human sperm cells. Methods Single cell gel electrophoresis(SCGE) or Comet assay was used to investigate DNA strand breakage in sperm cells of 9 ACN-exposed workers. Comet tail length of each sperm cell was measured and the degree of DNA damage was graded visualy into 5 grades. Results
, 百拇医药
Mean tail length of comet assay was 8.8±3.68 μm in exposed group, and 4.5±2.25 μm in the control. The rates of grade 1, grade 2, grade 3 and grade 4 comets were 5.5%, 8.7%, 6.7% and 9.0% in exposure group, significantly higher than 4.4%, 3.3%, 4.0% and 4.2% in the control. Conclusions These results suggest that ACN can act as a genotoxic agent by inducing DNA breakage in spermatogenesis and may impair the male reproductive function in ACN-exposed workers.
【Key words】 acrylonitrile(ACN); sperm; DNA breakage; single cell gel electrophoresis(comet assay)
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丙烯腈(acrylonitrile ACN)是工业有机合成的重要单体，广泛应用于腈纶纤维、丁腈橡胶、ABS工业塑料及某些合成树脂的制造。有关ACN的一般毒作用资料较多[1]，但随着毒理学研究的不断深入，ACN的特殊毒作用尤其是致癌、致畸和致突变作用已引起越来越广泛的关注。大量实验研究表明，ACN对试验动物有致癌和致畸作用[2～4]。此外，ACN与人类肺癌的关系以及ACN引起的生殖毒作用也先后在长期接触ACN职工中得到证实[5～7]。本文用本实验室建立的单细胞凝胶电泳试验(single cell gel electropherosis, SCGE)或称慧星实验(comet assay)技术对某腈纶厂9名ACN接触男工和9名对照者的精子DNA链断裂进行了检测和分析，为进一步评价ACN的男性生殖毒作用并探讨其毒作用机理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 对象 实验组9例，某腈纶厂男工，ACN接触时间均为2.8年，各采样点各时点(每月定时定点检测一次)ACN空气浓度均低于国家车间空气卫生标准(2 mg.m-3)。年龄范围：25～35岁。对照组9例，无ACN接触史，年龄范围24～35岁。所有研究对象在近一年内无放射线和可疑药物接触史。
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1.2 试剂 低溶点和正常溶点凝胶，生命技术公司(Gaitherburg, MD)产品。其它试剂均为Sigma公司(St. Louse, MO)产品。
1.3 仪器 Nikon AFX-IIA型荧光显微镜，由日本Nikon公司生产。
表1 ACN接触组和对照组之间精液常规检测结果比较(
±s) 组别n
体积
(ml)
密度
106.ml-1
, http://www.100md.com
总数
106
活率
%
活 力(%)
异常率
(%)
0
Ⅰ
Ⅱ-Ⅲ
接触组
9
2.4±0.8
, http://www.100md.com
73±15**
208±170*
61±12
39±4
11±2
50±5
47.7±10.5
对照组
9
2.1±0.8
145±38
287±124
, 百拇医药
59±8
41±4
6±1
53±6
48.6±8.6
与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01
1.4 精液标本的采集 采用手淫法。采集前禁欲3～5天，采集后盛于无菌容器内，室温下液化后进行精液常规检查[8]，剩余样品分装，-70℃保存。
1.5 单细胞电泳试验 根据我室首次建立的单细胞电泳技术，具体操作步骤如下：首先在冰冻玻片上铺上100 μl 0.75%的正常溶点凝胶，盖上盖玻片，在室温下静置5 min。6 μl精子细胞悬液(2×106细胞.ml-1)与54 μl 0.75%的低溶点凝胶在37℃条件下充分混匀后铺在第一层凝胶上，在4℃静置8 min。120 μl 0.75%低溶点凝胶铺在第二层凝胶上，在4℃静置8 min。玻片在含有2.5 M NaCl, 100 mM Na2-EDTA, 10 mM Tris, 1% sodium lauryl sarcosine, 1% Triton X-100 (pH10)的裂解液中4℃条件下作用1 h以裂解精子细胞。然后玻片依次在下列溶液中作用以解聚精子核中DNA，首先在含有2.5 M NaCl, 5 mM Tris, 0.05% sodium lauryl sarcosin, 10 mM DTT (pH7.4)溶液中4℃条件下作用1 h，接着在含有2.5 M NaCl, 5 mM Tris, 0.05% sodium lauryl sarcosine, 10μg.ml-1 RNase(pH7.4)溶液中37℃条件下作用4 h；最后在含有2.5 M NaCl, 5 mM Tris, 0.05% sodium lauryl sarcosine, 200 μg.ml-1 蛋白酶K(pH7.4)溶液中37℃条件下作用15 h。玻片在含有300 mM醋酸钠、100 mM Tris(pH10)的电解液中平衡20 min，在12 V(0.46 V.cm-1)、100 mA、4℃条件下电泳60 min。玻片最后在0.4 M Tris-HCl缓冲液中中和5 min，用15 μg.ml-1的EB染色、封片。
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1.6 镜检和计数 使用蓝色激发光，在Nikon荧光显微镜油镜下选择无重叠，荧光信号强的精子核计数。使用目镜测微尺测量每个精子细胞核的慧星尾长，并根据慧星尾部DNA含量将精子细胞核DNA损伤程度分为5级：0级：<5%，无损伤(核基本完整)；1级：5%～20%，轻度损伤；2级：20%～40%，中度损伤；3级：40%～95%，重度损伤；4级：>95%，完全损伤(核基本消失)。每个样本重复测试3次，每次计数100个精子。
1.7 统计分析 所有数据用SPSS和Excel软件包处理。
2 结果
2.1 精液常规分析 9名健康者和9名ACN接触男工精液常规检测结果显示，接触组精子密度和精子总数明显低于对照组，见表1。
2.2 精子DNA链断裂 用本室建立的单细胞电泳试验(慧星试验)方法检测人精子细胞，在荧光显微镜下可观察到明显的慧尾。ACN接触组和对照组平均慧尾长度分别是(8.8±3.68)μm和(4.5±2.25)μm，有明显差异，见图1(P<0.01)。ACN接触组完整精子细胞(0级)和1级、2级、3级、4级慧星精子细胞百分率分别为70.1%和5.5%、8.7%、6.7%、9.0%，与对照组的84.1%和4.4%、3.3%、4.0%、4.2%有明显差异(P<0.01、图2)。
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图1 接触组与对照组之间平均慧星尾长(μm)的差异比较(
±s)图2 接触组和对照组之间不同等级慧星精子细胞的差异比较(%)
3 讨论
ACN对实验动物的生殖和胚胎毒性在几个经典的大鼠三代繁殖实验中得到证实[3，4]。有关ACN对人的生殖毒性，有两篇有价值的研究报告。其一，对534名ACN接触男工的生殖流行病学调查结果显示：接触组妻子的死胎死产、新生儿先天性畸形和自然流产的相对危险度分别高达4.73、3.89和2.46[6]。而对477名接触ACN女工妊娠结局的调查也发现，孕期接触ACN引起妊娠合并症、恶阻、贫血，以及早产、新生儿出生缺陷发生率明显升高[7]。本文通过对9名ACN接触男工和9名对照者精液的常规检查，发现接触组平均精子密度和精子总数均明显低于对照组。这些研究结果表明，ACN对职业接触男工和女工均有生殖毒作用。然而，由于长期以来缺少快速和有效的检测人类生殖遗传毒作用的实验方法，有关ACN是否引起生殖细胞遗传毒作用却了解不多，仅有的几篇报告均来自动物试验结果。对雄性小鼠睾丸的生化和病理研究发现，ACN可引起睾丸内一系列酶活性的改变，主要表现为三梨糖醇脱氢酶(SDH)和酸性磷酸酶活性的降低以及乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖醛酸酶活性的升高，并出现输精管变性和精子数减少[9]。在随后的研究中进一步证实，ACN与小鼠睾丸组织中DNA发生共价结合，干扰DNA合成和修复过程[10]。
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近年来，分子生物学技术取得重大突破，作者早前用荧光原位杂位(FISH)对18名男工精子性染色体非整倍体进行了检测，结果显示9名接触ACN男工性染色体非整倍体发生率为0.70%，明显高于对照组的0.35%。其中XX、YY和XY二体百分率分别为0.10%、0.23%和0.37%，明显高于对照组的0.05%、0.10%和0.20%[11]，第1次用分子生物学技术证实ACN可引起人精子性染色体数目畸变。Chang等的研究结果显示，ACN引起成年人支气管上皮细胞DNA单链断裂[12]，表明在体外条件下ACN是体细胞DNA断裂剂。本文使用单细胞电泳技术对9名接触时间为2.8年，接触浓度低于2 mg.m-3(车间最高容许浓度)的ACN接触男工精子DNA链断裂进行的检测结果表明：ACN接触男工精子细胞核平均慧星尾长为(8.8±3.68)μm，明显高于对照组的(4.5±2.25)μm；1级、2级、3级和4级慧星发生率分别为5.5%、8.7%、6.7%和9.0%，明显高于对照组的4.4%、3.3%、4.0%和4.2%，表明即使接触低于目前车间最高容许浓度的ACN也可能引起人精子细胞DNA链断裂。但由于本次研究的样本数太少，ACN的生殖毒作用及其毒作用机理尚需要在以后的研究中进一步探讨。
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【基金项目】 中华医学基金(CMB)资助课题
【作者简介】 徐德祥(1962-)，副教授，硕士
SHEN Han-min(1964-),研究员，博士
ONG Chun-nan(1949-)，教授，博士
【参考文献】
[1] 张正东，戴修道. ACN毒理学研究进展[J]. 中国公共卫生学报， 1994，13(4)：248～250.
[2] Maltoni CA. Carcinogenicity on bioassays rats of acrylonitrile administered by inhalation and ingestion[J]. Med Law， 1977，68：401～404.
, 百拇医药
[3] Beliles RP. Three-generation reproduction study of rats receiving acrylonitrile in drinking water BI project NO 2660[R]. Washington DC： Chemical Manufacturers Association, February, 1980.
[4] Murray FJ. Teratogenicity of acrylonitrile given to rats by gavage or by inhalation[J]. Food Cosment Toxicol, 1978,16(6):547～550.
[5] O'Berg M. Epidemiology study of workers exposed to acrylonitrile[J]. J Occup Med, 1980,22:245～249.
, http://www.100md.com
[6] 吴维铠，苏 江，黄美媛，等. 接触ACN男工的生殖结局流行病学调查[J]. 中华劳动卫生职业病杂志，1994，12：261～263.
[7] 吴维皑，苏 江，黄美媛，等. ACN接触女工的生殖流行病学调查[J]. 中华预防医学杂志，1995，29：83～85.
[8] WHO. WHO laboratory manual for the examination of human sperm and sperm-cervical macus interaction. 3rd[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1992.43～44.
[9] Tandon R, Saxena DK, Chandra SV, et al. Testicular effects of acrylonitrile in mice[J]. Toxicol Lett, 1988,42:55～58.
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(收稿日期 1999-05-16), http://www.100md.com