内蒙一起F2a志贺菌痢爆发的质粒分析
作者：夏桂枝 王 红 白石山 叶礼燕 俞守义 郝加虎
单位：夏桂枝 叶礼燕(南京军区福州总医院儿科， 福建 福州 350001)；夏桂枝 王 红 俞守义 郝加虎(第一军医大学流行病学教研室， 广东 广州 510515)；白石山(内蒙古解放军第253医院， 内蒙古 呼和浩特 010051)
关键词：志贺菌；质粒图谱；限制性内切酶图谱
疾病控制杂志990304
【摘要】 目的 探讨内蒙一起菌痢爆发的特异传染源。方法 对43株F2a志贺菌进行质粒图谱和质粒DNA酶切图谱分析。结果 ①质粒图谱和质粒DNA酶切图谱特征相同的菌株为引起本次菌痢爆发的优势克隆；②本次爆发偶合有部分散发病例；③经污染的食物传播是本次爆发的主要传播途径。结论 质粒分析能较为特异、敏感地揭示不同来源志贺菌间的遗传联系和差别，从而准确说明爆发或流行事件的真相。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R378.25； Q783.1 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(1999)03-0164-03
Plasmid analysis of S.flexneri 2a isolated from a shigellosis outbreak in Inner Mongolia
XIA Gui-zhi, WANG Hong, BAI Shi-shan， YE Li-yan, YU Shou-yi， HAO Jia-hu.
Department of Pediatrics of Fuzhou General Hospital， Nanjing Military District, Fuzhou 10515, China
, 百拇医药 【Abstract】 Objective To explore the special source of infection from a shigellosis outbreak in Inner Mongolia. Methods Plasmid profile and plasmid DNA restriction endonuclease analyses were carried out on 43 strains of S.flexneri 2a. Results (1) The strains which had same features of plasmid profile and plasmid DNA restriction endonuclease analyses were the predominant clone in this Shigellosis outbreak; (2) There were some sporadic cases which were included in the outbreak by chronological and spacial coincidence; (3) The route of transmission was contaminated food. Conclusion The plasmid DNA restricition endonuclease analysis was more specific and sensitive than plasmid profile, but they both had some restrictions.
, 百拇医药
【Key words】 shigella; plasmid profile; restriction endonuclease pattern
80年代以来，随着分子生物学理论和技术的发展，一些分子生物学技术逐渐被引入感染性疾病的流行病学研究领域，质粒分析因其具有快速、简便的特点和对不同来源菌株具备较强的鉴别能力而成为肠道传染病流行病学研究的有力工具[1～3]。本文应用质粒图谱和质粒DNA酶切图谱分析了内蒙呼和浩特市的一起菌痢爆发，并将两种方法分析的结果进行比较。
1 材料与方法
1.1 菌株 43株F2a志贺菌系1997年在内蒙呼和浩特市某驾驶学校发生的一起菌痢爆发期间自现
患病例、炊事员带菌者和食堂残余食物中分离到的，F2a T32、E.coli V517为第一军医大学流行病学教研室保存菌种，细菌按常规用LB培养基培养。
, 百拇医药
1.2 材料 Tris、SDS、限制性内切酶EcoR-Ⅰ购自宝灵曼公司，λDNA Hind-Ⅲ分子量标准购自华美公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 方法 质粒DNA小量快速提取按碱变性法，0.7%的琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙啶)电泳，恒压50 V，3～4 h后在紫外灯下观察结果，质粒DNA的限制性内切酶消化按厂家推荐的条件进行，电泳同上述。
2 结果
2.1 流行病学背景 1997年5月29日～6月4日内蒙呼和浩特市某驾驶学校发生一起菌痢爆发，共发现病例141例，罹患率31.06%(141/454)。患者均为第一食堂就餐学员，流行呈单峰型，发病高峰为第2～5天，发病115例，占发病总数的81.56%。患者大便培养103份，41份培养出F2a志贺菌；10名食堂炊事员大便培养，一人F2a(+);从发病当天食堂炊具和所剩饭菜采样21份，其中凉拌豆腐皮中培养出了F2a志贺菌。现场调查认为这是一起由食堂污染的凉拌豆腐皮引起的食物源性的菌痢爆发，炊事员带菌者可能是引起本次菌痢爆发的传染源。
, 百拇医药
2.2 质粒分析
2.2.1 质粒图谱分析
图1 内蒙分离株质粒图谱
43株F2a志贺菌的质粒图谱表明：除M9703、M9729外各株质粒图谱相同，均包含一个140 MDa大质粒和三个小质粒，M9703多一个小质粒，M9729小质粒图谱相同，但缺少大质粒。
2.2.2 质粒DNA的酶切图谱分析
图2 内蒙分离株质粒DNA酶切图谱
43株F2a分离株可分为四种不同的质粒DNA酶切图谱：M9727、M9728、M9729各自有独立的谱型，其余40株酶切图谱相同。
, 百拇医药
3 讨论
志贺菌属均包含一个120 MDa或140 MDa的大质粒和数个大小不一的小质粒，大质粒与细菌的毒力有关，部分小质粒与细菌的耐药性有关[4]。血清型一致而来源不同的志贺菌可包含大小不一、数目不同的小质粒，且在一定区域和时间内保持相对稳定，有其特异性。由于分子量不同的质粒经琼脂糖凝胶电泳后，具有不同的迁移谱带，因此根据质粒图谱的不同可将来源不同的菌株区分开来。质粒DNA酶切图谱分析是在质粒DNA图谱的基础上利用限制性内切酶特异识别碱基序列位点降解DNA的特点，比较质粒DNA的限制性内切酶图谱，分析其内部片段构成是否一致，能更特异准确地揭示各菌株间的遗传联系和差别，可分辨出比质粒图谱更多的菌型[5]。
本文结果表明：质粒图谱和质粒DNA酶切图谱相同的菌株分别占所有菌株的95.35%和93.00%，提示其为本次菌痢爆发的优势克隆，是引起本次菌痢爆发的流行株；从食物中分离的菌株M9707两种图谱的特征均与优势克隆相同，证明此次爆发是通过污染的食物而引起传播的；食堂炊事员大便中虽然分离出了F2a志贺菌M9703，但与优势克隆相比，质粒图谱明显不同，说明它与引起本次菌痢爆发的菌株不属同一克隆，不是本次爆发的传染源；M9727、M9728酶切图谱与优势克隆存在明显差异，分属不同克隆，相应病例不能归入爆发事件，而是偶合于本次爆发的散发病例。由此可见，质粒分析提供了较生化血清学分型更特异和敏感的检测手段，能更准确地揭示爆发和流行事件的真相。
, http://www.100md.com
质粒图谱和质粒DNA酶切图谱比较，质粒图谱可将43株F2a志贺菌分为三个不同的谱型，而质粒DNA酶切图谱则能分为四个不同的谱型，我们可以看到质粒DNA酶切图谱的分辨率高于质粒图谱；这是因为质粒图谱无法区分那些分子量相同但碱基顺序不同的质粒，而酶切图谱则可根据酶切生成的片段大小不同而进行鉴别。
需要指出的是：M9729的质粒图谱和质粒DNA酶切图谱都比较特异，其中质粒图谱缺少大质粒，酶切图谱电泳带明显少于其他菌株，需要排除大质粒发生丢失的可能性。因为质粒属于染色体外的DNA，不是细菌生存所必需的组分，在长时间保存或多次传代后容易发生丢失，使分析结果受到影响。这种现象说明质粒分析方法虽然具有简单、特异和敏感的优点但也存在一定的局限性[6]，还需要与其他分子生物学方法相结合，才能在流行病学研究中发挥更大的作用。
【作者简介】 夏桂枝(1969-)，女，主治医师，硕士
, 百拇医药 王 红(1956-)，男，副教授，博士，硕士生导师
【参考文献】
[1] Litwin CM, Ryan KJ, Chipowsky S, et al. Molecular epidemiology of shigella sonnei in pima county, Hrizona: evidence for a Mexico-related plasmid[J]. J Infect Dis, 1990,161:797～800.
[2] Agodi A, Jones C, Threlfall EJ, et al. Molecular characterization of trimethoprim resistance in shigella sonnei in sicily[J]. Epidemiol infect, 1990,105:29～40.
, http://www.100md.com
[3] Litwin CM, Leonard RB, Carroll KC, et al. Characterization of endemic strains of shigella sonnei by use of plasmid DNA analysis and pulsed-field gel electrophoresis to detect patterns of transmission[J]. J Infect Dis, 1997,175:864～870.
[4] Jamieson AF, Bremer DA, Bergquist PL, et al. Characterization of plasmids from antibiotic-resistant shigella isolates by agarose gel electrophoresis[J]. J Gen Microbiol, 1979,113:73～81.
, 百拇医药 [5] Yagupsky P, Loeffelholz M, Bell K, et al. Use of multiple markers for investigation of an epidemic of shigella sonnei infections in monroe county, New York[J]. J Clin Microbiol, 1991,29:2855～2858.
[6] Liu PY, Lau YJ, Hu BS, et al. Analysis of clonal relatoinships among isolates of shigella sonnei by different molecular typing methods[J]. J Clin Microbiol, 1995,33(7):1779～1783.
(收稿日期 1999-06-10), http://www.100md.com
单位：夏桂枝 叶礼燕(南京军区福州总医院儿科， 福建 福州 350001)；夏桂枝 王 红 俞守义 郝加虎(第一军医大学流行病学教研室， 广东 广州 510515)；白石山(内蒙古解放军第253医院， 内蒙古 呼和浩特 010051)
关键词：志贺菌；质粒图谱；限制性内切酶图谱
疾病控制杂志990304
【摘要】 目的 探讨内蒙一起菌痢爆发的特异传染源。方法 对43株F2a志贺菌进行质粒图谱和质粒DNA酶切图谱分析。结果 ①质粒图谱和质粒DNA酶切图谱特征相同的菌株为引起本次菌痢爆发的优势克隆；②本次爆发偶合有部分散发病例；③经污染的食物传播是本次爆发的主要传播途径。结论 质粒分析能较为特异、敏感地揭示不同来源志贺菌间的遗传联系和差别，从而准确说明爆发或流行事件的真相。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R378.25； Q783.1 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(1999)03-0164-03
Plasmid analysis of S.flexneri 2a isolated from a shigellosis outbreak in Inner Mongolia
XIA Gui-zhi, WANG Hong, BAI Shi-shan， YE Li-yan, YU Shou-yi， HAO Jia-hu.
Department of Pediatrics of Fuzhou General Hospital， Nanjing Military District, Fuzhou 10515, China
, 百拇医药 【Abstract】 Objective To explore the special source of infection from a shigellosis outbreak in Inner Mongolia. Methods Plasmid profile and plasmid DNA restriction endonuclease analyses were carried out on 43 strains of S.flexneri 2a. Results (1) The strains which had same features of plasmid profile and plasmid DNA restriction endonuclease analyses were the predominant clone in this Shigellosis outbreak; (2) There were some sporadic cases which were included in the outbreak by chronological and spacial coincidence; (3) The route of transmission was contaminated food. Conclusion The plasmid DNA restricition endonuclease analysis was more specific and sensitive than plasmid profile, but they both had some restrictions.
, 百拇医药
【Key words】 shigella; plasmid profile; restriction endonuclease pattern
80年代以来，随着分子生物学理论和技术的发展，一些分子生物学技术逐渐被引入感染性疾病的流行病学研究领域，质粒分析因其具有快速、简便的特点和对不同来源菌株具备较强的鉴别能力而成为肠道传染病流行病学研究的有力工具[1～3]。本文应用质粒图谱和质粒DNA酶切图谱分析了内蒙呼和浩特市的一起菌痢爆发，并将两种方法分析的结果进行比较。
1 材料与方法
1.1 菌株 43株F2a志贺菌系1997年在内蒙呼和浩特市某驾驶学校发生的一起菌痢爆发期间自现
患病例、炊事员带菌者和食堂残余食物中分离到的，F2a T32、E.coli V517为第一军医大学流行病学教研室保存菌种，细菌按常规用LB培养基培养。
, 百拇医药
1.2 材料 Tris、SDS、限制性内切酶EcoR-Ⅰ购自宝灵曼公司，λDNA Hind-Ⅲ分子量标准购自华美公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.3 方法 质粒DNA小量快速提取按碱变性法，0.7%的琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙啶)电泳，恒压50 V，3～4 h后在紫外灯下观察结果，质粒DNA的限制性内切酶消化按厂家推荐的条件进行，电泳同上述。
2 结果
2.1 流行病学背景 1997年5月29日～6月4日内蒙呼和浩特市某驾驶学校发生一起菌痢爆发，共发现病例141例，罹患率31.06%(141/454)。患者均为第一食堂就餐学员，流行呈单峰型，发病高峰为第2～5天，发病115例，占发病总数的81.56%。患者大便培养103份，41份培养出F2a志贺菌；10名食堂炊事员大便培养，一人F2a(+);从发病当天食堂炊具和所剩饭菜采样21份，其中凉拌豆腐皮中培养出了F2a志贺菌。现场调查认为这是一起由食堂污染的凉拌豆腐皮引起的食物源性的菌痢爆发，炊事员带菌者可能是引起本次菌痢爆发的传染源。
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2.2 质粒分析
2.2.1 质粒图谱分析
图1 内蒙分离株质粒图谱
43株F2a志贺菌的质粒图谱表明：除M9703、M9729外各株质粒图谱相同，均包含一个140 MDa大质粒和三个小质粒，M9703多一个小质粒，M9729小质粒图谱相同，但缺少大质粒。
2.2.2 质粒DNA的酶切图谱分析
图2 内蒙分离株质粒DNA酶切图谱
43株F2a分离株可分为四种不同的质粒DNA酶切图谱：M9727、M9728、M9729各自有独立的谱型，其余40株酶切图谱相同。
, 百拇医药
3 讨论
志贺菌属均包含一个120 MDa或140 MDa的大质粒和数个大小不一的小质粒，大质粒与细菌的毒力有关，部分小质粒与细菌的耐药性有关[4]。血清型一致而来源不同的志贺菌可包含大小不一、数目不同的小质粒，且在一定区域和时间内保持相对稳定，有其特异性。由于分子量不同的质粒经琼脂糖凝胶电泳后，具有不同的迁移谱带，因此根据质粒图谱的不同可将来源不同的菌株区分开来。质粒DNA酶切图谱分析是在质粒DNA图谱的基础上利用限制性内切酶特异识别碱基序列位点降解DNA的特点，比较质粒DNA的限制性内切酶图谱，分析其内部片段构成是否一致，能更特异准确地揭示各菌株间的遗传联系和差别，可分辨出比质粒图谱更多的菌型[5]。
本文结果表明：质粒图谱和质粒DNA酶切图谱相同的菌株分别占所有菌株的95.35%和93.00%，提示其为本次菌痢爆发的优势克隆，是引起本次菌痢爆发的流行株；从食物中分离的菌株M9707两种图谱的特征均与优势克隆相同，证明此次爆发是通过污染的食物而引起传播的；食堂炊事员大便中虽然分离出了F2a志贺菌M9703，但与优势克隆相比，质粒图谱明显不同，说明它与引起本次菌痢爆发的菌株不属同一克隆，不是本次爆发的传染源；M9727、M9728酶切图谱与优势克隆存在明显差异，分属不同克隆，相应病例不能归入爆发事件，而是偶合于本次爆发的散发病例。由此可见，质粒分析提供了较生化血清学分型更特异和敏感的检测手段，能更准确地揭示爆发和流行事件的真相。
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质粒图谱和质粒DNA酶切图谱比较，质粒图谱可将43株F2a志贺菌分为三个不同的谱型，而质粒DNA酶切图谱则能分为四个不同的谱型，我们可以看到质粒DNA酶切图谱的分辨率高于质粒图谱；这是因为质粒图谱无法区分那些分子量相同但碱基顺序不同的质粒，而酶切图谱则可根据酶切生成的片段大小不同而进行鉴别。
需要指出的是：M9729的质粒图谱和质粒DNA酶切图谱都比较特异，其中质粒图谱缺少大质粒，酶切图谱电泳带明显少于其他菌株，需要排除大质粒发生丢失的可能性。因为质粒属于染色体外的DNA，不是细菌生存所必需的组分，在长时间保存或多次传代后容易发生丢失，使分析结果受到影响。这种现象说明质粒分析方法虽然具有简单、特异和敏感的优点但也存在一定的局限性[6]，还需要与其他分子生物学方法相结合，才能在流行病学研究中发挥更大的作用。
【作者简介】 夏桂枝(1969-)，女，主治医师，硕士
, 百拇医药 王 红(1956-)，男，副教授，博士，硕士生导师
【参考文献】
[1] Litwin CM, Ryan KJ, Chipowsky S, et al. Molecular epidemiology of shigella sonnei in pima county, Hrizona: evidence for a Mexico-related plasmid[J]. J Infect Dis, 1990,161:797～800.
[2] Agodi A, Jones C, Threlfall EJ, et al. Molecular characterization of trimethoprim resistance in shigella sonnei in sicily[J]. Epidemiol infect, 1990,105:29～40.
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[3] Litwin CM, Leonard RB, Carroll KC, et al. Characterization of endemic strains of shigella sonnei by use of plasmid DNA analysis and pulsed-field gel electrophoresis to detect patterns of transmission[J]. J Infect Dis, 1997,175:864～870.
[4] Jamieson AF, Bremer DA, Bergquist PL, et al. Characterization of plasmids from antibiotic-resistant shigella isolates by agarose gel electrophoresis[J]. J Gen Microbiol, 1979,113:73～81.
, 百拇医药 [5] Yagupsky P, Loeffelholz M, Bell K, et al. Use of multiple markers for investigation of an epidemic of shigella sonnei infections in monroe county, New York[J]. J Clin Microbiol, 1991,29:2855～2858.
[6] Liu PY, Lau YJ, Hu BS, et al. Analysis of clonal relatoinships among isolates of shigella sonnei by different molecular typing methods[J]. J Clin Microbiol, 1995,33(7):1779～1783.
(收稿日期 1999-06-10), http://www.100md.com