模拟高原缺氧复合梭曼中毒脑损伤特点及其救治*
作者：董兆君 赵吉青 吴强 王仕丽 李云鹏 刘勇 林海
单位：第三军医大学毒理学教研室 (重庆 400038)
关键词：
卫生毒理学杂志990312 梭曼以毒性大、作用快、中毒难防难治而著称，是外军重点装备的化学战剂之一。脑是对梭曼极为敏感的重要靶器官。梭曼进入脑内迅速与胆碱酯酶(ChE)结合并抑制其活性，使乙酰胆碱(ACh)在突触间隙大量蓄积，从而破坏神经中枢正常功能，导致一系列生理功能的改变[1，2]。脑也是对缺氧极为敏感的器官之一[3]。人员急速进驻高原地区，常因高原缺氧而发生适应不全或高山病，甚至脑水肿，其发生率和严重程度随进驻速度和海拔高度的增加而增加。国内外对高原缺氧复合梭曼中毒研究报道不多。早期结果业已证实，模拟4000m高原缺氧条件下，梭曼毒性明显增加：在平原疗效甚佳的救治药物效价也下降。据此认为，高原缺氧复合梭曼中毒时，其中毒机理、病理改变和临床过程会比平原中毒更加复杂，医学防护也会出现新问题。
, 百拇医药
我国高原地区幅员辽阔，且多为边疆战略要地。研究高原缺氧复合梭曼中毒的脑损伤机理和救治方案意义重大。利用高原缺氧动物模型和PC-12细胞株研究缺氧和梭曼中毒两因素作用下脑损伤特点，探讨神经生化和病理改变规律，观察药物的抗毒效果，以便为此类毒物中毒的防护和临床救治奠定理论基础。
1 研究方法
将动物置低压舱减压至4000m高度(61.2kPa,po2,13kPa))后维持不同时间。按设计要求分别为动物注射梭曼或药物，于各时相点取出动物，检测相应指标。PC12细胞悬浮于RPMI-1640培养液，在37℃培养。按照设计，将梭曼或药物加入培养液中，经一定时间培养后检测相关指标。脑含水量测定：断头处死动物，取脑，沿正中切线分为两半。一侧脑组织称其湿重后烘干，称其干重，计算脑组织含水量。含水量(g/g湿组织)=(W湿-W干)/W湿。参照Saria方法检测脑组织中伊文思蓝标记白蛋白含量：采用受体-配基结合法，经Scatchard作图，计算脑组织M-AChR的Bmax和Kd值；DTNB法测AChE活力；脑游离脂肪酸(FFA)测定按一次提取法进行，在4010型光度计波长440nm处测A值。以荧光法检测细胞游离Ca2+浓度。
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2 结果与讨论
2.1 缺氧复合梭曼中毒脑损伤的组织学特点 将动物置低压环境缺氧24h，脑组织神经髓鞘松散，高尔基复合体轻度肿胀，染色体边聚。随缺氧时间的延长髓鞘松散分离进一步加重。梭曼中毒使上述变化更为突出，可见轴突消失，线粒体明显肿胀，胶质细胞水肿。缺氧复合梭曼中毒48h水肿加重，神经元水肿。体外培养之PC-12细胞缺氧48h，细胞存活率减少28%，梭曼更使其减少至54%。可见缺氧和梭曼均有显著的神经细胞毒性作用，神经细胞水肿和脑水肿是这种细胞毒作用的直接表现。1.09 LD50梭曼中毒后60min和120min，大鼠脑含水量由对照水平的(0.75±0.04)g/g升高至(0.81±0.03)g/g和(0.82±0.04)g/g，均与对照组有显著差别(P<0.01)。并且脑含水量的增加有随中毒剂量增加而加重的趋势。同时，脑组织伊文思蓝标记白蛋白的含量由平原中毒组的5.63和高原对照组的3.73增加至7.85μg/100mg组织，分别升高39.4%和110.4%。脑血管通透性增加和脑含水量增加直接原因尚不清楚。有报道指出，无氧代谢所产生的游离脂肪酸(FAA)可导致脑组织肿胀和脑循环保障。我们的结果表明，高原缺氧条件下，大鼠梭曼中毒后15min到120min，脑组织FFA浓度维持在高水平，严重时可达对照组的283.3%。提示缺氧复合梭曼中毒所导致的FFA升高可能参与了脑水肿的形成。此外，急性缺氧动物脑组织中毒后48h，脑组织ATP含量由平原对照水平的(3.49±0.37)mg/g降至(1.36±0.45)mg/g湿组织。说明能量代谢障碍问题非常突出，也是造成脑损伤的重要原因。
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2.2 缺氧和梭曼双因素作用下的中枢胆碱能系统变化缺点 梭曼的主要靶位是AChE，高原反应的主要原因是缺氧，阐明二者共同作用下中枢胆碱能系统的变化规律，对于了解梭曼中毒脑损伤机理甚为重要。我们的初步结果显示，急性缺氧动物各脑区AChE活动与平原无μ多大差异，但高原缺氧的大鼠海马和纹状体AChE对梭曼的敏感性下降。平原时1LD50梭曼使纹状体AChE活力为下降49%(88.9±8.7)(μmol/min.mg)protein；4000m高原缺氧时，相同剂量梭曼使纹状体AChE活力仅下降20%。提示急性缺氧条件下，梭曼中毒动物脑组织ACh生成量不会比平原中毒时大。然而整体动物中毒观察发现，高原缺氧时梭曼毒性明显提高，这种矛盾的原因需要进一步探讨。我们采用受体分析法研究了各脑区M-ChR动力学参数，结果提示，缺氧本身可明显增加海马和纹状体M-ChR的最大结合率，且有显著的时效关系。急性缺氧0，8，24和72h时，海马的Bmax分别为：100%、101%、110%和119%；纹状体的Bmax分别为100%、119%、153%和167%。而缺氧时纹状体M-ChR的KD值呈反向变化。梭曼中毒并不明显改变缺氧对纹状体M-ChR最大结合率的影响。综合上述结果可以认为，高原缺氧时，虽然梭曼AChE的抑制作用有所下降，但胆碱能受体的结合效率却有提高，这可能是梭曼毒性增加的原因之一。
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2.3 Ca2+超载与梭曼脑损伤 文献指出，梭曼中毒可使脑细胞Ca2+浓度显著升高，而Ca2+超载又被认为是导致神经细胞损伤的重要原因[4，5]。我们观察到，缺氧和梭曼中毒两因素均可单独使PC-12细胞内游离Ca2+浓度升高。设缺氧的Ca2+含量为X，梭曼中毒的Ca2+含量为Y，经过推算发现，两因素共同作用下PC-12细胞游离Ca2+含量基本符合“X+Y×0.75”的关系。缺氧和梭曼中毒时PC-12细胞CaM也显著升高，中毒48h，达平原对照水平的1.74倍。动物实验结果提示，两因素作用下大鼠脑PLA2活性高达平原对照水平的583%。由此可见，高原缺氧复合梭曼中毒对神经组织Ca2+代谢的影响非常剧烈，是脑损伤的主要特征之一。Ca2+参与神经生物学的诸多过程，Ca2+超载可经磷脂酶途径，使磷脂代谢紊乱而损伤神经细胞；Ca2+也可激活蛋白激酶，使膜蛋白降解[5]。
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2.4 救治药物效果研究 “复方85”是效果甚佳的有机磷中毒救治药物，能有效地对抗缺氧和梭曼引起的脑血管通透性的增加，使脑组织伊文斯蓝含量由11.89μg/100mg降至4.33μg/100mg组织，但不能使之降至对照水平(2.27μg/100mg组织)。在“复方85”的基础上加用中药红景天后，脑组织伊文斯蓝含量与正常对照无显著差别(2.34μg/100mg组织)。“复方85”也能对抗复合损伤时脑组织CaM及PLA2的升高，红景天同样能加强“复方85”的作用。这些结果说明，“复方85”合用红景天对高原缺氧复合梭曼中毒引起的脑损伤有较好的效果。
3 结论
本系列研究结果说明，高原缺氧和梭曼中毒对中枢神经系统所造成的复合损伤比单一因素损伤严重，其主要特点是：(1)血管通透性和脑含水量显著增加，神经细胞形态学变化明显；(2)缺氧条件下，梭曼时脑AChE抑制程度有所减弱，但胆碱能受体结合效率显著升高；(3)神经系统钙平衡机制严重紊乱，Ca2+通过多种生化途径损伤神经细胞，可能是梭曼毒性增加的原因之一；(4)“复方85”部分但不是全部对抗复合损伤造成的脑损伤，中药红景天加强“复方85”的效果。
, 百拇医药
*全军“九五”指令课题(96L063)
参考文献
1.McDonough JH:Mcleod CG:Nipwoda MT.Direct microinjection of soman and VX into the amygdalaprouduces repetitive limbic convulsions and neuropathology.Brain Res,1987,435(2):123.
2.Burn JD:Leighton FA.Further studies of brain cholinesterase:cholinergic receptor ratios in the diagnosis of acute lethal poisoning of birds by anticholinesterase pesticides.J Wildl Dis，1996,32(2):216.
, 百拇医药
3.Badini-I，Zerbetto-E，bianchi-C，Beani-L，et al.Post-hypoxic recovery of acetylcholine release:different sensitivity of guinea pig neocortical and striatal slices.Neurochem-Int.1996，29(5),477～85.
4.Choi DW.Excitotoxic cell death.J Neurobiol,1992,23(46):1261.
5.Salter-MW:Hicks-JL.ATP causes release of intracellular Ca2+ via the phospholipase C beta/IP3 pathway in astrocytes from the dorsal spinal cord.J Neurosci.1995,15(4):2961.
(来稿日期 1999年2月), 百拇医药
单位：第三军医大学毒理学教研室 (重庆 400038)
关键词：
卫生毒理学杂志990312 梭曼以毒性大、作用快、中毒难防难治而著称，是外军重点装备的化学战剂之一。脑是对梭曼极为敏感的重要靶器官。梭曼进入脑内迅速与胆碱酯酶(ChE)结合并抑制其活性，使乙酰胆碱(ACh)在突触间隙大量蓄积，从而破坏神经中枢正常功能，导致一系列生理功能的改变[1，2]。脑也是对缺氧极为敏感的器官之一[3]。人员急速进驻高原地区，常因高原缺氧而发生适应不全或高山病，甚至脑水肿，其发生率和严重程度随进驻速度和海拔高度的增加而增加。国内外对高原缺氧复合梭曼中毒研究报道不多。早期结果业已证实，模拟4000m高原缺氧条件下，梭曼毒性明显增加：在平原疗效甚佳的救治药物效价也下降。据此认为，高原缺氧复合梭曼中毒时，其中毒机理、病理改变和临床过程会比平原中毒更加复杂，医学防护也会出现新问题。
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我国高原地区幅员辽阔，且多为边疆战略要地。研究高原缺氧复合梭曼中毒的脑损伤机理和救治方案意义重大。利用高原缺氧动物模型和PC-12细胞株研究缺氧和梭曼中毒两因素作用下脑损伤特点，探讨神经生化和病理改变规律，观察药物的抗毒效果，以便为此类毒物中毒的防护和临床救治奠定理论基础。
1 研究方法
将动物置低压舱减压至4000m高度(61.2kPa,po2,13kPa))后维持不同时间。按设计要求分别为动物注射梭曼或药物，于各时相点取出动物，检测相应指标。PC12细胞悬浮于RPMI-1640培养液，在37℃培养。按照设计，将梭曼或药物加入培养液中，经一定时间培养后检测相关指标。脑含水量测定：断头处死动物，取脑，沿正中切线分为两半。一侧脑组织称其湿重后烘干，称其干重，计算脑组织含水量。含水量(g/g湿组织)=(W湿-W干)/W湿。参照Saria方法检测脑组织中伊文思蓝标记白蛋白含量：采用受体-配基结合法，经Scatchard作图，计算脑组织M-AChR的Bmax和Kd值；DTNB法测AChE活力；脑游离脂肪酸(FFA)测定按一次提取法进行，在4010型光度计波长440nm处测A值。以荧光法检测细胞游离Ca2+浓度。
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2 结果与讨论
2.1 缺氧复合梭曼中毒脑损伤的组织学特点 将动物置低压环境缺氧24h，脑组织神经髓鞘松散，高尔基复合体轻度肿胀，染色体边聚。随缺氧时间的延长髓鞘松散分离进一步加重。梭曼中毒使上述变化更为突出，可见轴突消失，线粒体明显肿胀，胶质细胞水肿。缺氧复合梭曼中毒48h水肿加重，神经元水肿。体外培养之PC-12细胞缺氧48h，细胞存活率减少28%，梭曼更使其减少至54%。可见缺氧和梭曼均有显著的神经细胞毒性作用，神经细胞水肿和脑水肿是这种细胞毒作用的直接表现。1.09 LD50梭曼中毒后60min和120min，大鼠脑含水量由对照水平的(0.75±0.04)g/g升高至(0.81±0.03)g/g和(0.82±0.04)g/g，均与对照组有显著差别(P<0.01)。并且脑含水量的增加有随中毒剂量增加而加重的趋势。同时，脑组织伊文思蓝标记白蛋白的含量由平原中毒组的5.63和高原对照组的3.73增加至7.85μg/100mg组织，分别升高39.4%和110.4%。脑血管通透性增加和脑含水量增加直接原因尚不清楚。有报道指出，无氧代谢所产生的游离脂肪酸(FAA)可导致脑组织肿胀和脑循环保障。我们的结果表明，高原缺氧条件下，大鼠梭曼中毒后15min到120min，脑组织FFA浓度维持在高水平，严重时可达对照组的283.3%。提示缺氧复合梭曼中毒所导致的FFA升高可能参与了脑水肿的形成。此外，急性缺氧动物脑组织中毒后48h，脑组织ATP含量由平原对照水平的(3.49±0.37)mg/g降至(1.36±0.45)mg/g湿组织。说明能量代谢障碍问题非常突出，也是造成脑损伤的重要原因。
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2.2 缺氧和梭曼双因素作用下的中枢胆碱能系统变化缺点 梭曼的主要靶位是AChE，高原反应的主要原因是缺氧，阐明二者共同作用下中枢胆碱能系统的变化规律，对于了解梭曼中毒脑损伤机理甚为重要。我们的初步结果显示，急性缺氧动物各脑区AChE活动与平原无μ多大差异，但高原缺氧的大鼠海马和纹状体AChE对梭曼的敏感性下降。平原时1LD50梭曼使纹状体AChE活力为下降49%(88.9±8.7)(μmol/min.mg)protein；4000m高原缺氧时，相同剂量梭曼使纹状体AChE活力仅下降20%。提示急性缺氧条件下，梭曼中毒动物脑组织ACh生成量不会比平原中毒时大。然而整体动物中毒观察发现，高原缺氧时梭曼毒性明显提高，这种矛盾的原因需要进一步探讨。我们采用受体分析法研究了各脑区M-ChR动力学参数，结果提示，缺氧本身可明显增加海马和纹状体M-ChR的最大结合率，且有显著的时效关系。急性缺氧0，8，24和72h时，海马的Bmax分别为：100%、101%、110%和119%；纹状体的Bmax分别为100%、119%、153%和167%。而缺氧时纹状体M-ChR的KD值呈反向变化。梭曼中毒并不明显改变缺氧对纹状体M-ChR最大结合率的影响。综合上述结果可以认为，高原缺氧时，虽然梭曼AChE的抑制作用有所下降，但胆碱能受体的结合效率却有提高，这可能是梭曼毒性增加的原因之一。
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2.3 Ca2+超载与梭曼脑损伤 文献指出，梭曼中毒可使脑细胞Ca2+浓度显著升高，而Ca2+超载又被认为是导致神经细胞损伤的重要原因[4，5]。我们观察到，缺氧和梭曼中毒两因素均可单独使PC-12细胞内游离Ca2+浓度升高。设缺氧的Ca2+含量为X，梭曼中毒的Ca2+含量为Y，经过推算发现，两因素共同作用下PC-12细胞游离Ca2+含量基本符合“X+Y×0.75”的关系。缺氧和梭曼中毒时PC-12细胞CaM也显著升高，中毒48h，达平原对照水平的1.74倍。动物实验结果提示，两因素作用下大鼠脑PLA2活性高达平原对照水平的583%。由此可见，高原缺氧复合梭曼中毒对神经组织Ca2+代谢的影响非常剧烈，是脑损伤的主要特征之一。Ca2+参与神经生物学的诸多过程，Ca2+超载可经磷脂酶途径，使磷脂代谢紊乱而损伤神经细胞；Ca2+也可激活蛋白激酶，使膜蛋白降解[5]。
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2.4 救治药物效果研究 “复方85”是效果甚佳的有机磷中毒救治药物，能有效地对抗缺氧和梭曼引起的脑血管通透性的增加，使脑组织伊文斯蓝含量由11.89μg/100mg降至4.33μg/100mg组织，但不能使之降至对照水平(2.27μg/100mg组织)。在“复方85”的基础上加用中药红景天后，脑组织伊文斯蓝含量与正常对照无显著差别(2.34μg/100mg组织)。“复方85”也能对抗复合损伤时脑组织CaM及PLA2的升高，红景天同样能加强“复方85”的作用。这些结果说明，“复方85”合用红景天对高原缺氧复合梭曼中毒引起的脑损伤有较好的效果。
3 结论
本系列研究结果说明，高原缺氧和梭曼中毒对中枢神经系统所造成的复合损伤比单一因素损伤严重，其主要特点是：(1)血管通透性和脑含水量显著增加，神经细胞形态学变化明显；(2)缺氧条件下，梭曼时脑AChE抑制程度有所减弱，但胆碱能受体结合效率显著升高；(3)神经系统钙平衡机制严重紊乱，Ca2+通过多种生化途径损伤神经细胞，可能是梭曼毒性增加的原因之一；(4)“复方85”部分但不是全部对抗复合损伤造成的脑损伤，中药红景天加强“复方85”的效果。
, 百拇医药
*全军“九五”指令课题(96L063)
参考文献
1.McDonough JH:Mcleod CG:Nipwoda MT.Direct microinjection of soman and VX into the amygdalaprouduces repetitive limbic convulsions and neuropathology.Brain Res,1987,435(2):123.
2.Burn JD:Leighton FA.Further studies of brain cholinesterase:cholinergic receptor ratios in the diagnosis of acute lethal poisoning of birds by anticholinesterase pesticides.J Wildl Dis，1996,32(2):216.
, 百拇医药
3.Badini-I，Zerbetto-E，bianchi-C，Beani-L，et al.Post-hypoxic recovery of acetylcholine release:different sensitivity of guinea pig neocortical and striatal slices.Neurochem-Int.1996，29(5),477～85.
4.Choi DW.Excitotoxic cell death.J Neurobiol,1992,23(46):1261.
5.Salter-MW:Hicks-JL.ATP causes release of intracellular Ca2+ via the phospholipase C beta/IP3 pathway in astrocytes from the dorsal spinal cord.J Neurosci.1995,15(4):2961.
(来稿日期 1999年2月), 百拇医药