血液透析患者丙型肝炎病毒高变区核苷酸序列分析
作者：汪年松 潘卫 竺艳娟 方芳 廖履坦
单位：汪年松 (200233 上海市第六人民医院肾内科)；潘卫 方芳 (第二军医大学微生物教研室)；竺艳娟 廖履坦 (上海医科大学中山医院肾内科)
关键词：C型肝炎样病毒属；血液透析；碱基序列；肝炎；丙型；输血
血液透析患者丙型肝炎病毒高变区核苷酸序列分析 摘要 目的 探讨维持性血液透析(血透)患者感染丙型肝炎病毒(HCV)的传播途径。方法 应用核苷酸序列分析技术检测15例血透患者感染的HCV高变区(HVR)核苷酸序列，并进行同源性比较。结果 比较15例血透患者HCV HVR核苷酸序列发现，分离株8、12和14间核苷酸序列同源性高达97.00%，株4、5和10间同源性高达95.00%，株1、3～8、10～14相互间同源性均在80.00%以上，这些患者均在同一房间透析或有共用透析机史；株2与其他各株间同源性为61.25%～66.25%，株9与其他各株间同源性57.50%～67.50%,两者均有大量输血史。结论 血透患者感染HCV的主要原因为输血，同时在血透环境中亦可能存在HCV感染的医源性传播途径。
, 百拇医药
Nucleotide Sequence Analysis for High Variance Region of Hepatitis C Virus in Patients with Hemodialysis
WANG Niansong*, PAN Wei, ZHU Yanjuan, et al.
*Department of Nephrology, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai 200233
Abstract Objective To investigate the route of transmission for hepatitis C virus (HCV) infection in patients on hemodialysis(HD). Methods Nucleotide sequence of high variance region (HVR)of HCV was analyzed with nucleotide sequencing technique in 15 HD patients, and its homology was compared. Results Comparison of the nucleotide sequences of HCV HVR in 15 HD patients showed that their homologies in isolates 8, 12 and 14 reached 97.50%, 95.00% in isolates 4, 5 and 10, and more than 80.00% in isolates 1, 3-8 and 10-14. Clinical data showed that all these patients were hemodialyzed in the same room with the same HD machine. Isolates 2 and all others were 61.25%-66.25% in homology, and 57.50%-67.50% in isolates 9 and all others, and both the patients had histories of large-quantity blood transfusion. Conclusion Blood transfusion was the primary risk factor for HCV infection in HD patients, but iatrogenic transmission of HCV through HD environment could also exist.
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Key words Hepatitis C-like viruses Hemodialysis Base sequence Hepatitis C Blood transfusion
国外许多研究认为，血液透析(血透)患者感染丙型肝炎病毒(HCV)，除了输血外尚存在与透析有关的医源性传播途径[1-4]，但有关报道结论不一致[2-4]，我们采用核苷酸序列测定技术，直接测定部分血透患者感染的HCV高变区(HVR)核苷酸序列，并进行比较，以探讨血透患者感染HCV的传播途径。
对象与方法
一、病例选择
15例血透患者均在中山医院血液净化中心行维持性透析治疗，男7例、女8例，平均年龄为47.3(34～70)岁，血透时间最短6个月，最长96个月，平均透析时间为36.8个月。血透前均无肝炎史，乙型和甲型肝炎病毒感染标志均阴性，透后3个月～3年出现ALT增高，乙型和甲型肝炎标志物多次阴性，其中5例透析时间在2年内者透前抗-HCV阴性。本中心每月常规检测肝功能、肾功能、血常规和血气分析，每3个月检测乙型和甲型肝炎标志物，1994年4月后常规检测抗-HCV。此15例患者均经ELISA法和RT-PCR法检测证实抗-HCV和HCV RNA阳性，方法见文献[5]。
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二、核苷酸序列测定
1.引物：引物由中科院上海细胞研究所合成。SE1:5′-CTACTCCGGATCCCACAAGC-3′(相应于HCV J株1 338～1 357位)，ASE1:5′-GGGCTCGGAGTGAAGCAATA-3′(相应于HCV J株1 848～1 867位)，SE2:5′-ATTCCATGGTGGGGAACTGG-3′(相应于HCV J株1 414～1 433位)，ASE2:5′-GCAATACACTGGACCACACA-3′(相应于HCV J株1 883～1 852位)。
2.RT-Nested-PCR检测：由SE1、ASE1引导进行第1轮扩增，SE2、ASE2引导进行第2轮扩增。取第2轮PCR产物20 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果[5]。
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3.序列分析：第2轮PCR扩增产物经琼脂糖超纯胶电泳纯化后作为测序模板，以SE2或ASE2末端标记同位素(γ-32P)作为测序引物，使用双链DNA循环测序盒(GIBCO BRL公司产品)进行序列分析[6]。
结果
一、15例血透患者感染HCV分离株HCV RNA HVR(E2/NS1区)扩增产物的核苷酸序列测定结果见图1。
图1 15例血透患者HCV分离株E2/NS1区部分核苷酸序列(1 479～1 559为高变区)
二、15例血透患者相互间HCV分离株HVR核苷酸序列的同源性比较：
, http://www.100md.com
由表1可见，各分离株间HCV RNA HVR核苷酸序列同源性57.50%～97.50%。
表1 血液透析患者感染的HCV分离株间E2/NS1区核苷酸序列同源性的比较(%)
分离株
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讨论 血透患者感染HCV的医源性传播途径已经引起广泛关注，但有关的证据多来自回顾性和前瞻性研究，本研究是采用分子流行病学方法。基因分型常用于传播途径的探索[7]，但是HCV有多种基因型，且各种基因型有一定的地区分布，一定人群中有一种基因型占优势，因而基因分型在研究HCV医源性传播中的作用受到一定的限制。HCV核苷酸序列分析可以直接比较分离株之间的核苷酸序列同源性和异源性，是探索传播途径最直接、准确的方法[2]。HCV基因组高度变异，但5′-NCR最为保守，亲缘最远的株间，相同的序列高达92%～100%,而E2/NS1区为高变区，不同型间的核苷酸序列同源性在67.7%左右[8]，高变区核苷酸序列同源性非常高，就很可能是来源于同一病毒株。HCV型间变异>20%，型内变异>10%[9]，且同一患者HCV HVR序列可连续变异[10]。
, http://www.100md.com
临床分析证实,此15例患者均在同一透析房间透析，其中株8、12、14患者长期共用透析机(分别为8、6和3年)，株14从未接受输血和血制品，在透析半年左右肝功能异常；株4、5、10透析时间分别为7、5、1年，株5从未接受输血和血制品，三者在同一透析室隔床透析且共用透析机。在分离株1、3～8、10～14中，除株5、6、8、14外，其他均不同程度的接受输血和血制品。
本研究证实血透患者感染HCV，除了输血外，尚可能存在医源性传播，共用透析机和透析房间、护士操作不当等都认为是可能的途径[1-3]，阻断这些传播途径是预防的关键。
*本研究受卫生部科研基金资助(编号：96-2-128)
参考文献
1 Okuda K,Hayashi H,Yokozeki K,et al.Mode of nosocomial HCV infection among chronic hemodialysis patients and its prevention.Hepatology,1994,19:293-298.
, 百拇医药
2 Sampietro M,Badalamenti S,Salvadori S,et al.High prevalence of a rare hepatitis C virus in patients treated in the same hemodialysis unit:evidence for nosocomial transmission of HCV.Kidney Int,1995,47:911-917.
3 Stuyver L,Claeys H,Wyseur A,et al.Hepatitis C virus in a hemodialysis unit:molecular evidence for nosocomial transmission.Kidney Int,1996,49:889-895.
4 Zeuzem S,Scheuermann EH,Waschk D,et al.Phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolated from hemodialysis patients.Kidney Int,1996,49:896-904.
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5 潘卫，戚中田，崔晓红，等.PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群.第二军医大学学报，1995，16：405-408.
6 Murry V.Improved double-standed DNA sequencing using the liner polymerase chain reaction.Nucleies Acids Res,1989,17:8889-8899.
7 Okamoto H,Sugiyama Y,Okada S,et al.Tying hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infection sources .J Gen Virol,1992,73:673-684.
, 百拇医药 8 史英辉，韩世杰.HCV基因及其核苷酸序列差异的生物学作用与疾病的关系.国外医学病毒学分册，1995，12：85-88.
9 Okamoto H,Okada S,Sugiyama Y,et al.Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reports isolates for conserved and divergent regions .J Gen Virol,1991,72:2697-2704.
10 窦骏，刘克州.丙型肝炎病毒超变区的研究进展.国外医学流行病传染病学分册，1995，22：252-255.
收稿日期：1998-02-20 修回日期：1998-11-10, http://www.100md.com
单位：汪年松 (200233 上海市第六人民医院肾内科)；潘卫 方芳 (第二军医大学微生物教研室)；竺艳娟 廖履坦 (上海医科大学中山医院肾内科)
关键词：C型肝炎样病毒属；血液透析；碱基序列；肝炎；丙型；输血
血液透析患者丙型肝炎病毒高变区核苷酸序列分析 摘要 目的 探讨维持性血液透析(血透)患者感染丙型肝炎病毒(HCV)的传播途径。方法 应用核苷酸序列分析技术检测15例血透患者感染的HCV高变区(HVR)核苷酸序列，并进行同源性比较。结果 比较15例血透患者HCV HVR核苷酸序列发现，分离株8、12和14间核苷酸序列同源性高达97.00%，株4、5和10间同源性高达95.00%，株1、3～8、10～14相互间同源性均在80.00%以上，这些患者均在同一房间透析或有共用透析机史；株2与其他各株间同源性为61.25%～66.25%，株9与其他各株间同源性57.50%～67.50%,两者均有大量输血史。结论 血透患者感染HCV的主要原因为输血，同时在血透环境中亦可能存在HCV感染的医源性传播途径。
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Nucleotide Sequence Analysis for High Variance Region of Hepatitis C Virus in Patients with Hemodialysis
WANG Niansong*, PAN Wei, ZHU Yanjuan, et al.
*Department of Nephrology, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai 200233
Abstract Objective To investigate the route of transmission for hepatitis C virus (HCV) infection in patients on hemodialysis(HD). Methods Nucleotide sequence of high variance region (HVR)of HCV was analyzed with nucleotide sequencing technique in 15 HD patients, and its homology was compared. Results Comparison of the nucleotide sequences of HCV HVR in 15 HD patients showed that their homologies in isolates 8, 12 and 14 reached 97.50%, 95.00% in isolates 4, 5 and 10, and more than 80.00% in isolates 1, 3-8 and 10-14. Clinical data showed that all these patients were hemodialyzed in the same room with the same HD machine. Isolates 2 and all others were 61.25%-66.25% in homology, and 57.50%-67.50% in isolates 9 and all others, and both the patients had histories of large-quantity blood transfusion. Conclusion Blood transfusion was the primary risk factor for HCV infection in HD patients, but iatrogenic transmission of HCV through HD environment could also exist.
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Key words Hepatitis C-like viruses Hemodialysis Base sequence Hepatitis C Blood transfusion
国外许多研究认为，血液透析(血透)患者感染丙型肝炎病毒(HCV)，除了输血外尚存在与透析有关的医源性传播途径[1-4]，但有关报道结论不一致[2-4]，我们采用核苷酸序列测定技术，直接测定部分血透患者感染的HCV高变区(HVR)核苷酸序列，并进行比较，以探讨血透患者感染HCV的传播途径。
对象与方法
一、病例选择
15例血透患者均在中山医院血液净化中心行维持性透析治疗，男7例、女8例，平均年龄为47.3(34～70)岁，血透时间最短6个月，最长96个月，平均透析时间为36.8个月。血透前均无肝炎史，乙型和甲型肝炎病毒感染标志均阴性，透后3个月～3年出现ALT增高，乙型和甲型肝炎标志物多次阴性，其中5例透析时间在2年内者透前抗-HCV阴性。本中心每月常规检测肝功能、肾功能、血常规和血气分析，每3个月检测乙型和甲型肝炎标志物，1994年4月后常规检测抗-HCV。此15例患者均经ELISA法和RT-PCR法检测证实抗-HCV和HCV RNA阳性，方法见文献[5]。
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二、核苷酸序列测定
1.引物：引物由中科院上海细胞研究所合成。SE1:5′-CTACTCCGGATCCCACAAGC-3′(相应于HCV J株1 338～1 357位)，ASE1:5′-GGGCTCGGAGTGAAGCAATA-3′(相应于HCV J株1 848～1 867位)，SE2:5′-ATTCCATGGTGGGGAACTGG-3′(相应于HCV J株1 414～1 433位)，ASE2:5′-GCAATACACTGGACCACACA-3′(相应于HCV J株1 883～1 852位)。
2.RT-Nested-PCR检测：由SE1、ASE1引导进行第1轮扩增，SE2、ASE2引导进行第2轮扩增。取第2轮PCR产物20 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果[5]。
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3.序列分析：第2轮PCR扩增产物经琼脂糖超纯胶电泳纯化后作为测序模板，以SE2或ASE2末端标记同位素(γ-32P)作为测序引物，使用双链DNA循环测序盒(GIBCO BRL公司产品)进行序列分析[6]。
结果
一、15例血透患者感染HCV分离株HCV RNA HVR(E2/NS1区)扩增产物的核苷酸序列测定结果见图1。
图1 15例血透患者HCV分离株E2/NS1区部分核苷酸序列(1 479～1 559为高变区)
二、15例血透患者相互间HCV分离株HVR核苷酸序列的同源性比较：
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由表1可见，各分离株间HCV RNA HVR核苷酸序列同源性57.50%～97.50%。
表1 血液透析患者感染的HCV分离株间E2/NS1区核苷酸序列同源性的比较(%)
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讨论 血透患者感染HCV的医源性传播途径已经引起广泛关注，但有关的证据多来自回顾性和前瞻性研究，本研究是采用分子流行病学方法。基因分型常用于传播途径的探索[7]，但是HCV有多种基因型，且各种基因型有一定的地区分布，一定人群中有一种基因型占优势，因而基因分型在研究HCV医源性传播中的作用受到一定的限制。HCV核苷酸序列分析可以直接比较分离株之间的核苷酸序列同源性和异源性，是探索传播途径最直接、准确的方法[2]。HCV基因组高度变异，但5′-NCR最为保守，亲缘最远的株间，相同的序列高达92%～100%,而E2/NS1区为高变区，不同型间的核苷酸序列同源性在67.7%左右[8]，高变区核苷酸序列同源性非常高，就很可能是来源于同一病毒株。HCV型间变异>20%，型内变异>10%[9]，且同一患者HCV HVR序列可连续变异[10]。
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临床分析证实,此15例患者均在同一透析房间透析，其中株8、12、14患者长期共用透析机(分别为8、6和3年)，株14从未接受输血和血制品，在透析半年左右肝功能异常；株4、5、10透析时间分别为7、5、1年，株5从未接受输血和血制品，三者在同一透析室隔床透析且共用透析机。在分离株1、3～8、10～14中，除株5、6、8、14外，其他均不同程度的接受输血和血制品。
本研究证实血透患者感染HCV，除了输血外，尚可能存在医源性传播，共用透析机和透析房间、护士操作不当等都认为是可能的途径[1-3]，阻断这些传播途径是预防的关键。
*本研究受卫生部科研基金资助(编号：96-2-128)
参考文献
1 Okuda K,Hayashi H,Yokozeki K,et al.Mode of nosocomial HCV infection among chronic hemodialysis patients and its prevention.Hepatology,1994,19:293-298.
, 百拇医药
2 Sampietro M,Badalamenti S,Salvadori S,et al.High prevalence of a rare hepatitis C virus in patients treated in the same hemodialysis unit:evidence for nosocomial transmission of HCV.Kidney Int,1995,47:911-917.
3 Stuyver L,Claeys H,Wyseur A,et al.Hepatitis C virus in a hemodialysis unit:molecular evidence for nosocomial transmission.Kidney Int,1996,49:889-895.
4 Zeuzem S,Scheuermann EH,Waschk D,et al.Phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolated from hemodialysis patients.Kidney Int,1996,49:896-904.
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5 潘卫，戚中田，崔晓红，等.PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群.第二军医大学学报，1995，16：405-408.
6 Murry V.Improved double-standed DNA sequencing using the liner polymerase chain reaction.Nucleies Acids Res,1989,17:8889-8899.
7 Okamoto H,Sugiyama Y,Okada S,et al.Tying hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infection sources .J Gen Virol,1992,73:673-684.
, 百拇医药 8 史英辉，韩世杰.HCV基因及其核苷酸序列差异的生物学作用与疾病的关系.国外医学病毒学分册，1995，12：85-88.
9 Okamoto H,Okada S,Sugiyama Y,et al.Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reports isolates for conserved and divergent regions .J Gen Virol,1991,72:2697-2704.
10 窦骏，刘克州.丙型肝炎病毒超变区的研究进展.国外医学流行病传染病学分册，1995，22：252-255.
收稿日期：1998-02-20 修回日期：1998-11-10, http://www.100md.com