氨基甙类抗生素耳中毒遗传易感性的分子流行病学研究
作者：潘虹 戚豫 柯肖枚 顾之平 刘新民 陆远 姜苏敏 刘洁芬 吴希如
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科(潘虹、戚豫、吴希如)，耳鼻喉科(柯肖枚、顾之平、陆远)，呼吸内科(刘新民)；北京市儿童医院(姜苏敏)；北京市第一聋哑学校(刘洁芬)
关键词：
中华医学杂志990319 在我国氨基甙类抗生素诱发的听力损伤仍是最常见的耳聋之一，约占全部耳聋的22%～25%[1]。近年来国内外已明确了线粒体基因组(mitochondrial DNA, mtDNA)上编码12S rRNA的基因突变1555A→G是其遗传易感性的分子生物学基础[2]。然而，该突变在氨基甙类抗生素致聋的中国人群中的出现频率不详。对于该突变进行筛查的应用价值亦缺乏可靠的评价。本文通过对散发及家族性氨基甙类抗生素致聋的病例以及正常人群进行了突变筛查，初步完成了该突变在我国人群中的分子流行病学调查，为防治提供了依据。
, 百拇医药
一、对象和方法
1.对象：来自北京医科大学第一医院、北京市儿童医院耳鼻喉科门诊、北京市第一聋哑学校有明确氨基甙类抗生素用药史的135例散发聋儿为散发组和28个家系116个成员为家族性组，其中系谱呈母系遗传方式的家系7个。阴性对照组为有明确用药史，但无任何听力和前庭功能受损的个体共65例，其中长期使用链霉素的33例，来自北京医科大学第一医院内科门诊。112例取自河北地区的无关个体为一般人群组。此外，3 个无综合征耳聋家系的17名成员也做为研究对象。
2.方法：(1) DNA提取：取2～5 ml抗凝外周血，蛋白酶K盐析法提取DNA[3]。(2) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物分别为mtDNA 1525～1549：5′CTAAAACCCCTACGCATTTATATAG3′和mtDNA 1624～1601：5′GCTTTGTGTTAAGCTACACTCTGG3′，由北京Cybersyn公司合成。反应条件见文献[4]。产物100 bp，质量浓度为2%琼脂糖凝胶电泳检测。(3) 限制性内切酶酶解及电泳：除以同功酶Alw261替代限制性内切酶BsmAI外，均按文献[4]操作。野生型酶解产物为80 bp和20 bp，1555位点发生A→G突变后该酶切位点消失。每例的酶解产物和PCR产物相邻排列以8%聚丙烯酰胺凝胶(Acry:Bis=19:1，20 cm×20 cm)于室温200伏电泳2小时。凝胶用银染显色，显色后凝胶用吸水玻璃纸包裹干燥保存。
, 百拇医药
3.统计学处理：采用χ2检验。
二、结果
1.在4组共428人中的突变检出结果：(见表1)。
表1 线粒体基因1555A→G突变检出情况 组别
例数
阳性数
阴性数
阳性率(%)
家族性
116
18
, 百拇医药
98
15.5
散 发
135
2
132
1.5
阴 性
65
0
65
0.0
一般人群
, 百拇医药 112
0
112
0.0
2.不同家系的突变检出结果：(见表2)。
表2 线粒体基因1555A→G突变在不同家系的分布 组别
家系数
阳性数
阴性数
阳性率(%)
母系遗传
7
, 百拇医药
4
3
57
其他家系
21
1
20
5
3.统计结果：(1) 该突变在家族性中的发生率(15.5%)高于散发病例组(1.5%)、阴性对照组(0.0)和一般人群(0.0)，χ2值分别为16.760 8、11.2、18.869，P值分别为<0.000 1、<0.01、<0.000 1，均小于0.01，差异有显著意义。(2) 该突变在散发个体组中的发生率(1.5%)与阴性对照组(0.0)和与一般人群(0.0)相比差异无显著意义。(3)该突变在呈母系遗传的家系中的发生率(4/7，57%)高于其他家系(1/21，5%)；在前者7个家系34名成员中15个存在该突变(占44%)，而后者21个家系的82名成员中仅3个存在该突变(3/82，4%)，χ2值30.0113，P<0.0001，两者之间差异有显著意义。
, 百拇医药
此外，还在3个无综合征耳聋家系(17名成员)检出1个家系5个成员中4个带有该突变。
三、讨论
很早就有人提出氨基甙类抗生素致聋存在遗传易感性，在90年代初发现的线粒体基因1555A→G突变为此提供了分子遗传学依据[4]。但在人群中该突变所占比例报道不一[5]。
我们的研究发现，线粒体基因1555A→G突变的发生率在呈母系遗传的氨基甙类抗生素致聋的家系中发生率最高，占50%以上；在非母系遗传的家系中发生率次之，为4.5%；而在散发病例中，该突变的发生率仅为1.5%，统计学上与正常人群几乎无差别。说明该突变造成的遗传易感性并不是氨基甙类抗生素引起耳聋发生的主要发病基础，提示该病可能有更多因素参与。由于发生率过低该突变不宜于在普通聋儿及亲属中进行筛查。相反对于有家族史，特别是呈明确母系遗传的氨基甙类抗生素相关的耳聋家系中，由于该突变发生率高，可以通过对全部母系成员的筛查进行预防咨询。我们对普通人，有较长期使用氨基甙类抗生素史而无异常表现的人群进行的筛查时未发现线粒体基因1555A→G突变存在，这也进一步说明了该突变在中国人中同样为致病性突变而非正常多态性改变。
, 百拇医药
此外，发现的一个无综合征耳聋存在线粒体基因1555A→G突变，且与发病相关并呈母系遗传，提示该突变在非抗生素诱发的耳聋中也起作用，也可看作“一个基因(突变)多种表型”学说的又一个证据。
参考文献
1 Pandya A, Xia X, Radnaabazar J, et al. Mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in two families from Mongolia with matrilineal aminoglycoside ototoxicity. J Med Genet, 1997,34:169-172.
2 Inoue K, Takai D, Soejima A, et al. Mutant mtDNA at 1555 A to G in 12S rRNA gene and hypersusceptibility of mitochondrial translation to streptomycin can be co-transferred to rho 0 Hela cells. Biochem Biophys Res Commun, 1996,223:496-501.
, 百拇医药
3 Miller SA, Dykes DD, Poleskey HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988,16:1215.
4 陈建明，陈金东，张丽珊，等. 人体对链霉素致聋遗传易感性的分子遗传学研究 .中华医学遗传学杂志,1996，13：152-155.
5 Fischel GN, Prezant TR, Chaltyaw WE, et al. Mitochondrial gene mutation is a significant predisposing factor in aminoglycoside ototoxicity. Am J Otolaryngol,1997, 18：173-178.
(收稿：1998-07-03 修回：1998-12-15), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科(潘虹、戚豫、吴希如)，耳鼻喉科(柯肖枚、顾之平、陆远)，呼吸内科(刘新民)；北京市儿童医院(姜苏敏)；北京市第一聋哑学校(刘洁芬)
关键词：
中华医学杂志990319 在我国氨基甙类抗生素诱发的听力损伤仍是最常见的耳聋之一，约占全部耳聋的22%～25%[1]。近年来国内外已明确了线粒体基因组(mitochondrial DNA, mtDNA)上编码12S rRNA的基因突变1555A→G是其遗传易感性的分子生物学基础[2]。然而，该突变在氨基甙类抗生素致聋的中国人群中的出现频率不详。对于该突变进行筛查的应用价值亦缺乏可靠的评价。本文通过对散发及家族性氨基甙类抗生素致聋的病例以及正常人群进行了突变筛查，初步完成了该突变在我国人群中的分子流行病学调查，为防治提供了依据。
, 百拇医药
一、对象和方法
1.对象：来自北京医科大学第一医院、北京市儿童医院耳鼻喉科门诊、北京市第一聋哑学校有明确氨基甙类抗生素用药史的135例散发聋儿为散发组和28个家系116个成员为家族性组，其中系谱呈母系遗传方式的家系7个。阴性对照组为有明确用药史，但无任何听力和前庭功能受损的个体共65例，其中长期使用链霉素的33例，来自北京医科大学第一医院内科门诊。112例取自河北地区的无关个体为一般人群组。此外，3 个无综合征耳聋家系的17名成员也做为研究对象。
2.方法：(1) DNA提取：取2～5 ml抗凝外周血，蛋白酶K盐析法提取DNA[3]。(2) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物分别为mtDNA 1525～1549：5′CTAAAACCCCTACGCATTTATATAG3′和mtDNA 1624～1601：5′GCTTTGTGTTAAGCTACACTCTGG3′，由北京Cybersyn公司合成。反应条件见文献[4]。产物100 bp，质量浓度为2%琼脂糖凝胶电泳检测。(3) 限制性内切酶酶解及电泳：除以同功酶Alw261替代限制性内切酶BsmAI外，均按文献[4]操作。野生型酶解产物为80 bp和20 bp，1555位点发生A→G突变后该酶切位点消失。每例的酶解产物和PCR产物相邻排列以8%聚丙烯酰胺凝胶(Acry:Bis=19:1，20 cm×20 cm)于室温200伏电泳2小时。凝胶用银染显色，显色后凝胶用吸水玻璃纸包裹干燥保存。
, 百拇医药
3.统计学处理：采用χ2检验。
二、结果
1.在4组共428人中的突变检出结果：(见表1)。
表1 线粒体基因1555A→G突变检出情况 组别
例数
阳性数
阴性数
阳性率(%)
家族性
116
18
, 百拇医药
98
15.5
散 发
135
2
132
1.5
阴 性
65
0
65
0.0
一般人群
, 百拇医药 112
0
112
0.0
2.不同家系的突变检出结果：(见表2)。
表2 线粒体基因1555A→G突变在不同家系的分布 组别
家系数
阳性数
阴性数
阳性率(%)
母系遗传
7
, 百拇医药
4
3
57
其他家系
21
1
20
5
3.统计结果：(1) 该突变在家族性中的发生率(15.5%)高于散发病例组(1.5%)、阴性对照组(0.0)和一般人群(0.0)，χ2值分别为16.760 8、11.2、18.869，P值分别为<0.000 1、<0.01、<0.000 1，均小于0.01，差异有显著意义。(2) 该突变在散发个体组中的发生率(1.5%)与阴性对照组(0.0)和与一般人群(0.0)相比差异无显著意义。(3)该突变在呈母系遗传的家系中的发生率(4/7，57%)高于其他家系(1/21，5%)；在前者7个家系34名成员中15个存在该突变(占44%)，而后者21个家系的82名成员中仅3个存在该突变(3/82，4%)，χ2值30.0113，P<0.0001，两者之间差异有显著意义。
, 百拇医药
此外，还在3个无综合征耳聋家系(17名成员)检出1个家系5个成员中4个带有该突变。
三、讨论
很早就有人提出氨基甙类抗生素致聋存在遗传易感性，在90年代初发现的线粒体基因1555A→G突变为此提供了分子遗传学依据[4]。但在人群中该突变所占比例报道不一[5]。
我们的研究发现，线粒体基因1555A→G突变的发生率在呈母系遗传的氨基甙类抗生素致聋的家系中发生率最高，占50%以上；在非母系遗传的家系中发生率次之，为4.5%；而在散发病例中，该突变的发生率仅为1.5%，统计学上与正常人群几乎无差别。说明该突变造成的遗传易感性并不是氨基甙类抗生素引起耳聋发生的主要发病基础，提示该病可能有更多因素参与。由于发生率过低该突变不宜于在普通聋儿及亲属中进行筛查。相反对于有家族史，特别是呈明确母系遗传的氨基甙类抗生素相关的耳聋家系中，由于该突变发生率高，可以通过对全部母系成员的筛查进行预防咨询。我们对普通人，有较长期使用氨基甙类抗生素史而无异常表现的人群进行的筛查时未发现线粒体基因1555A→G突变存在，这也进一步说明了该突变在中国人中同样为致病性突变而非正常多态性改变。
, 百拇医药
此外，发现的一个无综合征耳聋存在线粒体基因1555A→G突变，且与发病相关并呈母系遗传，提示该突变在非抗生素诱发的耳聋中也起作用，也可看作“一个基因(突变)多种表型”学说的又一个证据。
参考文献
1 Pandya A, Xia X, Radnaabazar J, et al. Mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in two families from Mongolia with matrilineal aminoglycoside ototoxicity. J Med Genet, 1997,34:169-172.
2 Inoue K, Takai D, Soejima A, et al. Mutant mtDNA at 1555 A to G in 12S rRNA gene and hypersusceptibility of mitochondrial translation to streptomycin can be co-transferred to rho 0 Hela cells. Biochem Biophys Res Commun, 1996,223:496-501.
, 百拇医药
3 Miller SA, Dykes DD, Poleskey HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988,16:1215.
4 陈建明，陈金东，张丽珊，等. 人体对链霉素致聋遗传易感性的分子遗传学研究 .中华医学遗传学杂志,1996，13：152-155.
5 Fischel GN, Prezant TR, Chaltyaw WE, et al. Mitochondrial gene mutation is a significant predisposing factor in aminoglycoside ototoxicity. Am J Otolaryngol,1997, 18：173-178.
(收稿：1998-07-03 修回：1998-12-15), 百拇医药