PCR技术检测大肠肿瘤及肿瘤样病变中EB病毒DNA
作者：王宁霞 李扬秋 蒋光愉 徐以浩
单位：暨南大学医学院第一附属医院； 王宁霞 徐以浩 外科； 李扬秋 血液病研究室；蒋光愉 病理科(510630)
关键词：大肠肿瘤；EB病毒；PCR
广东医学990315 【摘要】 目的 探讨人类大肠肿瘤中是否存在疱疹病毒属中EB病毒的感染，EB病毒是否参与了肿瘤的致病作用。方法 应用PCR方法对10例大肠良性肿瘤或肿瘤样病变标本和10例大肠恶性肿瘤病变标本进行EB病毒DNA扩增。结果 在20例病变标本中，EB病毒DNA阳性率为19/20，所得DNA片断为311bp。结论 人类大肠良恶性肿瘤组织及某些称谓癌前病变的组织中存有EB病毒感染。致病作用可能和宿主细胞之间基因调控，与其它病毒的协同作用以及各种理化因素相关联。探讨EB病毒是否参与了大肠癌的致癌作用以及与基因间的相互关系，是十分有意义的课题。
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近年来，人类疱疹病毒(HHV)的致病作用，特别是致癌作用的研究方兴未艾，而EB病毒(EBV)作为一种人类B淋巴细胞滋生的疱疹病毒已公认为引起多种恶性肿瘤的相随病毒。如伯基特淋巴瘤、有免疫缺陷的B细胞淋巴瘤及众所周知的未分化型鼻咽癌(UNPC)。然而，至今的研究仍未能表明EBV在UNPC中起何种作用，而在胃、胸腺、肺内的未分化癌中亦可检出EBV。人们期待研究更多种类的肿瘤，以识别其与EBV的相随关系。人类大肠肿瘤是尚未涉足的领域，我们对此进行了初步探讨，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 取1986～1992年期间经我院手术的大肠肿瘤及肿瘤样病变的石腊包埋组织块20例。石腊包埋时间最长10 a，最短3 a。病理结果为：结肠炎性息肉5例，结肠乳头状瘤4例，绒毛状腺瘤1例；结肠及直肠腺癌6例，腺瘤和息肉恶变4例。
1.2 DNA提取 取5～10 μm厚度的石腊切片组织脱腊后，加入酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液提取DNA，再用乙醇沉淀，最后溶解于20 μL的TE缓冲液中，于-20℃保存备用。
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1.3 PCR 为了检测EBV的DNA存在，从Baer RJ等[1]报道的EBVDNA序列中选出引物一对进行PCR。引物序列为：EBV-1-sense primer-5’-GTCCCCACGCGCGCATAATG，EBV-2-antisense primer-5’-GTGGACTCCTGGCGCTTGA
PCR方法按Saiki等[2]报道进行。总反应体积为25 μL。其中引物各20pm，dNTP各125 nm。2.5 mL 10倍PCR缓冲液，2 μL Ta2q聚合酶及2 μL DNA样品。覆盖10 μL石腊油后，反应管置于PCR扩增仪中。经92℃ 1 min变性后，55℃干燥，1 min退火，72℃1 min合成。如此进行30次循环后于4℃保存，所得产物经2.5%琼脂糖凝电泳分析结果。同时设阳性对照(从质粒中所得标准品EBV DNA)和阴性对照(不含DNA)。
2 结果
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用从EBV DNA选用的一对引物进行PCR，检测腺癌及恶性息肉10例，良性息肉及腺瘤10例。除一例炎性息肉外，其余病例在琼脂糖凝胶上均出现阳性带，位于300～400 bp之间。证实该产物为311 bp大小DNA片段。全部检测结果EBV DNA阳性率为19/20。阳性对照呈阳性反应，阴性对照无反应出现。
3 讨论
自从80年代初研究认为人乳头状瘤病毒(MPV)感染与某些肿瘤密切相关以来，病毒的致癌作用一直受到人们的关注。鉴于在UNPC中百分之百找到EBV，人们比较公认EBV为肿瘤相随病毒。在NPC以外的肿瘤中寻找EBV是目前研究热点之一。本实验首次在大肠上皮病变中检出EBV，丰富了这一领域的研究。现就有关问题进行讨论。
3.1 大肠肿瘤中的病毒感染 90年代以来，人类疱疹病毒(HHV)的肿瘤病因学研究受到重视，其中巨细胞病毒(CMV)和EBV研究多有报道，而涉及的疾病只限于UNPC和淋巴细胞增殖性疾病，对消化道肿瘤疾病的研究国内外甚少报告。本试验在10例大肠良性肿瘤样病变及10例恶性病变中获得了19/20的EBV DNA检出率，这是一个值得重视的问题。我们选择引物所得到的扩增片段属Bam HIW片段，具有较高的敏感性和特异性。关于EBV的肠道感染途径并不十分清楚。有研究认为[3]，EBV原发感染发生于口咽上皮细胞，并在该部持续存在复制，口咽上皮邻近的B淋巴细胞提供EBV从上皮至B细胞的传播途径，这或许能解释EBV对肠道感染的途径。为了深入了解HHV与大肠肿瘤的关系，我们应用PCR在同组病例中分别检出HHV-6、HHV-7和HHV-8。尽管我们的病例数不多，但能如此集中的检出人类疱疹病毒属，这使我们注意到HHV属的生物结构与特性是否为大肠组织所易感，以及是否参与了大肠肿瘤的恶变过程。这无疑是一个十分有趣的课题。
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3.2 EBV的相随肿瘤性 鉴于在传染性单核细胞增多症及UNPC中百分之百检出EVB，目前公认EBV与肿瘤相随。EBV属有包膜的病毒颗粒，在被感染者血清中已证实存在包膜特异抗原和内部抗原，表明EBV确为人类致病因子。本组试验中，10例良性赘生物中EBV阳性率占9/10，而恶性病变阳性率却达10/10。目前认为大肠炎性息肉，乳头状瘤及绒毛状腺病均属癌前病变。根据本组实验结果，有理由对EBV是否参与了大肠良性赘生物恶变过程进行深入探讨。然而，目前EBV感染发生于上皮细胞感染哪一期尚不清楚，EBV是肿瘤的病因还仅是机遇性感染，抑或仅起协同作用，还难以定论。而这正是研究EBV相随肿瘤的关键所在。一般认为，EBV经B淋巴细胞滋生传播而持续存在与肿瘤发生有关。最近又有证据显示T淋巴细胞要比B细胞较之EBV更密切，能激活CD4T细胞，增强肿瘤基因表达[4]。我们认为EBV只是肿瘤形成过程中的一个中间环节或隐匿因素，其致病作用与其活性有关，有报道某些理化因素能激活Raji细胞中EBV，就证明了这一点[5]。
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3.3 今后需解决的问题 本组试验仅在20例良恶性肿瘤组织中检出EBV DNA，而正常大肠上皮组织中，癌旁组织中是否存有EBV DNA则需进一步检测，EBV的分子生物学研究、其结构与功能、与宿主细胞之间基因调控与表达以及寻找与病毒有协同作用的理化致癌因素当是深入研究的重点。由于EBV的感染非常普遍，而PCR的敏感性较高，预计会在更多的疾病中检出EBV，这对全面深入的研究EBV在肿瘤形成中的作用是十分有益的。
4 参考文献
[1] Baer RJ, Bankier AT, Biggin MD, et al. DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr Virus genome. Nature, 1994,310(5947):207
[2] Saiki RK, Gelfand OH, Stoffel S, et al. Perimerdirected enzymatic ampeification of DNA with thermosatabel DNA polymerase. Science, 1988,239:487
[3] 许学谷，编译；邻永忠，审校.EB病毒持续存在与病毒相随肿瘤.国外医学耳鼻咽喉科学分册，1995，19(3)：149
[4] 李 莉，综述；葛治华，审校.人类疱疹病毒-6型研究进展.国外医学微生物学分册，1993，16(1)：7
[5] 谭成汉，译；苏志茑，校.鼻咽癌高危地区的腌制食物提取物激活Raji细胞的EB病毒.癌症，1990，9(2)：171, http://www.100md.com
单位：暨南大学医学院第一附属医院； 王宁霞 徐以浩 外科； 李扬秋 血液病研究室；蒋光愉 病理科(510630)
关键词：大肠肿瘤；EB病毒；PCR
广东医学990315 【摘要】 目的 探讨人类大肠肿瘤中是否存在疱疹病毒属中EB病毒的感染，EB病毒是否参与了肿瘤的致病作用。方法 应用PCR方法对10例大肠良性肿瘤或肿瘤样病变标本和10例大肠恶性肿瘤病变标本进行EB病毒DNA扩增。结果 在20例病变标本中，EB病毒DNA阳性率为19/20，所得DNA片断为311bp。结论 人类大肠良恶性肿瘤组织及某些称谓癌前病变的组织中存有EB病毒感染。致病作用可能和宿主细胞之间基因调控，与其它病毒的协同作用以及各种理化因素相关联。探讨EB病毒是否参与了大肠癌的致癌作用以及与基因间的相互关系，是十分有意义的课题。
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近年来，人类疱疹病毒(HHV)的致病作用，特别是致癌作用的研究方兴未艾，而EB病毒(EBV)作为一种人类B淋巴细胞滋生的疱疹病毒已公认为引起多种恶性肿瘤的相随病毒。如伯基特淋巴瘤、有免疫缺陷的B细胞淋巴瘤及众所周知的未分化型鼻咽癌(UNPC)。然而，至今的研究仍未能表明EBV在UNPC中起何种作用，而在胃、胸腺、肺内的未分化癌中亦可检出EBV。人们期待研究更多种类的肿瘤，以识别其与EBV的相随关系。人类大肠肿瘤是尚未涉足的领域，我们对此进行了初步探讨，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 取1986～1992年期间经我院手术的大肠肿瘤及肿瘤样病变的石腊包埋组织块20例。石腊包埋时间最长10 a，最短3 a。病理结果为：结肠炎性息肉5例，结肠乳头状瘤4例，绒毛状腺瘤1例；结肠及直肠腺癌6例，腺瘤和息肉恶变4例。
1.2 DNA提取 取5～10 μm厚度的石腊切片组织脱腊后，加入酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液提取DNA，再用乙醇沉淀，最后溶解于20 μL的TE缓冲液中，于-20℃保存备用。
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1.3 PCR 为了检测EBV的DNA存在，从Baer RJ等[1]报道的EBVDNA序列中选出引物一对进行PCR。引物序列为：EBV-1-sense primer-5’-GTCCCCACGCGCGCATAATG，EBV-2-antisense primer-5’-GTGGACTCCTGGCGCTTGA
PCR方法按Saiki等[2]报道进行。总反应体积为25 μL。其中引物各20pm，dNTP各125 nm。2.5 mL 10倍PCR缓冲液，2 μL Ta2q聚合酶及2 μL DNA样品。覆盖10 μL石腊油后，反应管置于PCR扩增仪中。经92℃ 1 min变性后，55℃干燥，1 min退火，72℃1 min合成。如此进行30次循环后于4℃保存，所得产物经2.5%琼脂糖凝电泳分析结果。同时设阳性对照(从质粒中所得标准品EBV DNA)和阴性对照(不含DNA)。
2 结果
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用从EBV DNA选用的一对引物进行PCR，检测腺癌及恶性息肉10例，良性息肉及腺瘤10例。除一例炎性息肉外，其余病例在琼脂糖凝胶上均出现阳性带，位于300～400 bp之间。证实该产物为311 bp大小DNA片段。全部检测结果EBV DNA阳性率为19/20。阳性对照呈阳性反应，阴性对照无反应出现。
3 讨论
自从80年代初研究认为人乳头状瘤病毒(MPV)感染与某些肿瘤密切相关以来，病毒的致癌作用一直受到人们的关注。鉴于在UNPC中百分之百找到EBV，人们比较公认EBV为肿瘤相随病毒。在NPC以外的肿瘤中寻找EBV是目前研究热点之一。本实验首次在大肠上皮病变中检出EBV，丰富了这一领域的研究。现就有关问题进行讨论。
3.1 大肠肿瘤中的病毒感染 90年代以来，人类疱疹病毒(HHV)的肿瘤病因学研究受到重视，其中巨细胞病毒(CMV)和EBV研究多有报道，而涉及的疾病只限于UNPC和淋巴细胞增殖性疾病，对消化道肿瘤疾病的研究国内外甚少报告。本试验在10例大肠良性肿瘤样病变及10例恶性病变中获得了19/20的EBV DNA检出率，这是一个值得重视的问题。我们选择引物所得到的扩增片段属Bam HIW片段，具有较高的敏感性和特异性。关于EBV的肠道感染途径并不十分清楚。有研究认为[3]，EBV原发感染发生于口咽上皮细胞，并在该部持续存在复制，口咽上皮邻近的B淋巴细胞提供EBV从上皮至B细胞的传播途径，这或许能解释EBV对肠道感染的途径。为了深入了解HHV与大肠肿瘤的关系，我们应用PCR在同组病例中分别检出HHV-6、HHV-7和HHV-8。尽管我们的病例数不多，但能如此集中的检出人类疱疹病毒属，这使我们注意到HHV属的生物结构与特性是否为大肠组织所易感，以及是否参与了大肠肿瘤的恶变过程。这无疑是一个十分有趣的课题。
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3.2 EBV的相随肿瘤性 鉴于在传染性单核细胞增多症及UNPC中百分之百检出EVB，目前公认EBV与肿瘤相随。EBV属有包膜的病毒颗粒，在被感染者血清中已证实存在包膜特异抗原和内部抗原，表明EBV确为人类致病因子。本组试验中，10例良性赘生物中EBV阳性率占9/10，而恶性病变阳性率却达10/10。目前认为大肠炎性息肉，乳头状瘤及绒毛状腺病均属癌前病变。根据本组实验结果，有理由对EBV是否参与了大肠良性赘生物恶变过程进行深入探讨。然而，目前EBV感染发生于上皮细胞感染哪一期尚不清楚，EBV是肿瘤的病因还仅是机遇性感染，抑或仅起协同作用，还难以定论。而这正是研究EBV相随肿瘤的关键所在。一般认为，EBV经B淋巴细胞滋生传播而持续存在与肿瘤发生有关。最近又有证据显示T淋巴细胞要比B细胞较之EBV更密切，能激活CD4T细胞，增强肿瘤基因表达[4]。我们认为EBV只是肿瘤形成过程中的一个中间环节或隐匿因素，其致病作用与其活性有关，有报道某些理化因素能激活Raji细胞中EBV，就证明了这一点[5]。
, http://www.100md.com
3.3 今后需解决的问题 本组试验仅在20例良恶性肿瘤组织中检出EBV DNA，而正常大肠上皮组织中，癌旁组织中是否存有EBV DNA则需进一步检测，EBV的分子生物学研究、其结构与功能、与宿主细胞之间基因调控与表达以及寻找与病毒有协同作用的理化致癌因素当是深入研究的重点。由于EBV的感染非常普遍，而PCR的敏感性较高，预计会在更多的疾病中检出EBV，这对全面深入的研究EBV在肿瘤形成中的作用是十分有益的。
4 参考文献
[1] Baer RJ, Bankier AT, Biggin MD, et al. DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr Virus genome. Nature, 1994,310(5947):207
[2] Saiki RK, Gelfand OH, Stoffel S, et al. Perimerdirected enzymatic ampeification of DNA with thermosatabel DNA polymerase. Science, 1988,239:487
[3] 许学谷，编译；邻永忠，审校.EB病毒持续存在与病毒相随肿瘤.国外医学耳鼻咽喉科学分册，1995，19(3)：149
[4] 李 莉，综述；葛治华，审校.人类疱疹病毒-6型研究进展.国外医学微生物学分册，1993，16(1)：7
[5] 谭成汉，译；苏志茑，校.鼻咽癌高危地区的腌制食物提取物激活Raji细胞的EB病毒.癌症，1990，9(2)：171, http://www.100md.com