中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析△
作者：许雪梅 司静懿 刘世德 徐建青 刘朝奇 李昆 陈浩 宋国兴
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室， 北京 100005
关键词：人乳头瘤病毒；E6E7基因；宫颈癌；序列
中国医学科学院学报990306 摘要 目的 分析中国山东地区宫颈癌患者HPV16型E6E7基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取DNA，经HPV多重引物PCR法鉴定标本中感染HPV型别，选感染HPV16型的标本DNA为模板进行PCR扩增，获得HPV16E6E7基因，将其重组入pALTER-1载体，进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中HPV16E6E7的重组质粒，命名为HPV16E6E7-SD。DNA序列分析表明，该序列全长776 bp，与已发表的德国标准株长度相等，但其核苷酸顺序的第557位核苷酸“T”变为“C”，即E6的终止密码子TAA变为谷氨酰胺密码子CAA。结论 中国山东地区宫颈癌患者组织中HPV16E6E7的基因结构与德国标准株HPV16E6E7基因之间存在差异。
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中图号 Q5
Isolating，Cloning，and Sequencing of HPV16E6E7 Gene from a Cervical Carcinoma Biopsy in Shandong Province
Xu Xuemei Si Jingyi Liu Shide Xu Jianqing Liu Zhaoqing，et al
(Department of Biophysics，Institute of Basic Medical Science，CAMS and PUMC，Beijing 100005)
Objective In order to study the structure specificity of HPV16E6E7 gene of a Chinese patient of cervical carcinoma in Shandong province.Methods The tissue DNA were abstracted from cervical carcinoma biopsies and the type of HPV was identified by HPV multiple primers PCR.HPV16E6E7 gene was amplified by PCR from the cervical carcinoma tissue DNA with the infection of HPV16 type only，and then cloned the E6E7 gene into pALTER-I vector.After sequencing the double strand，the gene was compared with the prototype E6E7 gene of HPV16.Results A new recombinant plasmid was constructed and named HPV16E6E7-SD.Sequencing results showed one mutation in HPV16E6E7-SD，the 557th neocleotide in the viral neocleotide sequence “T” was changed into “C”，and caused the termination cordon TAA of E6 gene to convert into a Gln cordon CAA.Conclusions There is a structure difference between HPV16E6E7-SD and the standard strain.
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Key words human papilloma virus; E6E7 gene; cervical carcinoma; sequence
宫颈癌是我国妇女因恶性肿瘤致死的主要原因，人乳头瘤病毒16型(human papilloma virus16，HPV16)是诱发宫颈癌的始动因子，并与人类多种恶性肿瘤的发生相关，HPV16的早期基因E6E7是致癌的关键基因，在恶性肿瘤中持续表达并为恶性表型的维持所必需[1]。HPV16E7基因编码的蛋白是一种特异的肿瘤排斥抗原，HPV16E6E7基因中存在许多抗原表位，可诱导特异的免疫反应[2]。人群感染HPV16后，可产生抗HPV16E6E7的特异性免疫[3]。1985年Seedorf等[4]首先从德国人宫颈癌组织中克隆了HPV16(标准株)，相继的研究发现，许多地区都有HPV16变异株的存在[5～9]。我国学者相继构建的HPV16E6及E7基因克隆多来源于标准株的HPV16质粒[10～12]，仅伍欣星等[12]克隆的HPV16E7-HB株来源于中国湖北地区宫颈癌患者的活检组织。为了解我国宫颈癌患者组织中HPV16E6E7基因结构特点，本实验通过对山东地区宫颈癌活检组织中HPV16E6E7基因的克隆及一级结构序列分析，探讨中国地方株与标准株(德国株)E6E7核苷酸序列差异，为我国HPV16E6E7相关疫苗的研制打下基础。
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1 材料和方法
标本 10例宫颈癌活检组织，由山东医科大学微生物学教研室赵蔚明教授提供，患者均为山东藉，病理学诊断均为宫颈鳞状上皮细胞癌。
引物 位于HPV16E6E7基因的开放读码框架的上、下游，包括起始密码ATG及终止密码TAA，含完整的E6E7基因，全长776 bp，引物的5′端分别加有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点及保护性碱基，加上部分引物序列，扩增片断的长度为795 bp，其核苷酸序列如下：
5′GACGGATCCATGCACCAAAAGAGAACTGCAATG3′
BamHⅠ
5′CTCGGAATTCTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGG3′
EcoRⅠ
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试剂与质粒 ExpandTM Long Template PCR系统购自Boehringer Mannheim公司，dNTP、T4连接酶、pALTER-1载体、核酸限制性内切酶均购自Promega公司，受体菌E.coli DH5α及质粒pGEX-2T、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18均为本室保存。HPV多重引物PCR试剂盒由本室合成提供，HPV6b b/11的共有引物、HPV16引物及HPV18引物3对引物，在同一扩增体系中进行PCR扩增[13]，经1次PCR反应，可同时检测标本中HPV6b、11、16、18等4种型别的HPV，阳性对照以HPV6b、11、16、18的质粒混合物为模板，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见3条带，长度依次为334、145及110 bp，它们分别为HPV18、HPV6b/11及HPV16的特异扩增片段。
PCR 常规提取组织DNA，用HPV多重引物PCR鉴定标本中HPV型别，取1例单纯HPV16阳性的标本为模板，用上述E6E7引物进行HPV16E6E7的PCR扩增。PCR反应体系为50 μl，其中含400 ng的宫颈癌组织DNA，2.5 mmol/L的dNTP，引物各25 pmol，以2 ng的HPV16质粒为阳性对照。94℃预变性8 min后，立即加入0.75 U的高保质酶，95℃变性45 s，54℃退火45 s，68℃延伸60 s，30个循环后再延伸300 s。
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PCR产物的克隆： 酚—氯仿抽提PCR产物，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶解后，加入T4连接酶，经16℃、10 h，定向重组入经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的pALTER-1载体(图1)，转化E.coli DH5a 感受态细胞，筛选阳性克隆后，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定。
图1 pALTER-HPV16E6E7构建示意图
Fig 1 Illustration of construction of plasmid pALTER-HPVE6E7
DNA序列测定： 提取质粒DNA，分别用pALTER-1载体的T7及SP6通用引物，采用双脱氧末端终止法按DNA测序试剂盒(Promega)说明书的程序操作，然后在DNA序列自动分析仪上测序。
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2 结果
宫颈癌组织HPV16E6E7基因扩增结果 HPV多重引物PCR鉴定各例宫颈癌标本中HPV型别，HPV16型单独感染的标本仅于110 bp处见一条扩增带(图2)。以HPV16型阳性标本为模板，PCR扩增HPV16E6E7基因，结果在795 bp处显现清晰的阳性扩增带，与以HPV16标准株质粒DNA扩增带处于同一水平，以pGEX-2TDNA为模板的阴性对照未见扩增带(图3)。
图2 HPV多重引物PCR检测宫颈癌活检组织中HPV感染型别的电泳分析
Fig 2 Electrophoretic analysis of products amplified with HPV multiple primers PCR from a sample of cervical carcinoma tissue
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1.negative control; 2.pBR322DNA/HinfⅠ marker; 3.HPV6b，11,16,18 positive control; 4.DNA sample of cervical carcinoma tissue
图3 宫颈癌活检组织DNA HPV16E6E7 PCR产物分析
Fig 3 Electrophoretic analysis of HPV16E6E7 PCR products
1.DNA sample of cervical carcinoma tissue; 2.HPV16 DNA positive control; 3.pBR322DNA/BstNⅠ marker; 4.negative control
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HPV16E6E7基因的克隆： PCR产物重组入pALTER-1，筛选的阳性克隆经BamHⅠ-EcoRⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后，在约776 bp处可见一条阳性扩增带(图4)。将此质粒命名为pHPV16E6E7-SD。
图4 重组质粒的酶切鉴定
Fig 4 Identification of the recombinant plasmids digested by BamHⅠ and EcoRⅠ
1.recombinant plasmid digested with BamHⅠ and EcoRⅠ; 2.recombinant plasmid; 3.pALTER-IDNA; 4.pBR322DNA/BstNⅠ marker; 5.λDNA/HindⅢ marker
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HPV16E6E7序列测定结果： 将鉴定后的5个重组质粒DNA混合，分别用SP6及T7启动子通用引物进行双向测序，结果表明HPV16E6E7-SD基因全长776 bp，大小与标准株一致，但其病毒核苷酸序列的557位核苷酸“T”变成了“C”，使E6的终止密码子TAA变成了谷氨酰胺密码子CAA(图5，6)。
图5 HPV16E6E7-SD部分核苷酸序列(反意链)
Fig 5 Partial neucleotide sequence of HPV16E6E7-SD with 5′ primer of the E7 C-termina
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图6 山东株HPV16E6E7基因序列
Fig 6 Nucleotide sequence of HPV16E6E7-SD
3 讨论
本研究首先对宫颈癌标本中感染的HPV DNA型别进行鉴定，筛选出单纯感染HPV16型的标本为模板，经PCR扩增E6E7基因，将其重组人pALTER-1载体，测序表明其长度与德国标准株一致，证明所克隆的基因确为HPV16E6E7基因。
HPV16E6E7基因是病毒的主要转化基因，其编码的E6蛋白及E7蛋白均为含“Cys-X-X-Cys”锌指结构的DNA结合蛋白，E6蛋白的N端及C端各形成2个锌指结构，可分别结合、降解抑癌基因p53; E7蛋白的C端也存在2个锌指结构，N端37个氨基酸残基与AdE1A和SV40T抗原蛋白相似，可与抑癌基因蛋白Rb结合，为E7蛋白的转化活性区。本研究克隆的山东株HPV16E6E7基因全长776 bp，与德国标准株核苷酸顺序比较，发现有一处变异，即病毒核苷酸序列557位的“T”变为“C”，使E6的终止密码子TAA变为谷氨酰胺密码子CAA。为排除DNA聚合酶可能造成的各种碱基错配，本实验在采取高保质ExpandTM Long Template PCR系统(错配率为0.025%)扩增的基础上，克隆经鉴定后，参照文献[5]将5个酶切鉴定后的重组质粒等量混合，通过在正反两个方向对目的基因的正链及负链进行测序，最大限度地减少了测序中可能存在的错配模板；且双向测序具有一定的校对功能，变异处G峰(反意链)清晰，单一背景无杂峰，因此消除了由实验造成的核苷酸顺序改变的可能性，表明本研究发现的病毒核苷酸序列第557位的变异由山东株HPV16E6E7基因与标准株病毒基因之间存在差异引起。Fujnaga等[9]通过PCR法测序分析发现，大多数侵袭性宫颈癌及癌前病变都检出了HPV16E7序列变异株。Lcenogle等[5]的研究表明，世界不同地区，如美国乔治亚州、亚拉巴马州、密苏里州及巴拿马地区的宫颈癌组织中都普遍存在HPV16E7变异株。Esche等[8]研究也证实存在HPV16E7变异株，通过进一步与对照组德国患者宫颈癌组织中病毒序列的比较分析，认为坦桑尼亚变异株具有地域特点。另外，宫颈癌组织中HPV16E6基因的多态性亦有报道[7]。国内仅伍欣星等[12]报道了1例湖北地区宫颈癌HPV16E7的变异株，该变异株E7基因的第43位谷氨酰胺密码子CAA变为终止密码子TAA，使E7肽链提前终止。本研究报道我国山东地区HPV16E6E7变异株，为了解我国宫颈癌患者组织中HPV16E6E7基因结构特点积累了流行病学资料。这种差异是否具有地域特性，是否会通过作用HPV16E6E7基因转录后存在多种剪接方式而影响其抗原性及转化活性[14]，相关的研究工作仍在继续进行中。
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△国家自然科学基金(39700131)资助
许雪梅为通讯作者
参考文献
1 司静懿，李 昆，宋国兴，等.宫颈癌病毒病因癌变原理的研究.中华病理学杂志，1993，22: 373～375
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3 Biogsiewicz LK，Fiander A，Nimako M，et al.A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus type 16 and 18，E6 and E7 proteins as immunotherapy encoding human papillomavirus type 16 and 18，E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer.Lancet，1996，347: 1523～1527
, 百拇医药
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, 百拇医药
10 袁育康，楚雍烈，刘延娜，等.应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因.西安医科大学学报，1995,16(3):235～237
11 苏应斌，赵文先，伍欣星，等.人乳头瘤病毒16型E7基因的体外扩增及其克隆和序列分析.中国病毒学，1995,10(4):303～308
12 伍欣星，赵文先，丁晓华，等.湖北地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的分离、克隆和序列分析.中国病毒学，1996，11(3):220～224
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14 Johnson MA，Blomfield PI，Bevan IS，et al.Analysis of human papillomavirus type 16 E6-E7 transcription in cervical carcinomas and normal cervical epithelium using the polymerase chain reaction.General Virol，1990，71:1473～1479
(1997-12-16收稿), 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生物物理室， 北京 100005
关键词：人乳头瘤病毒；E6E7基因；宫颈癌；序列
中国医学科学院学报990306 摘要 目的 分析中国山东地区宫颈癌患者HPV16型E6E7基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取DNA，经HPV多重引物PCR法鉴定标本中感染HPV型别，选感染HPV16型的标本DNA为模板进行PCR扩增，获得HPV16E6E7基因，将其重组入pALTER-1载体，进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中HPV16E6E7的重组质粒，命名为HPV16E6E7-SD。DNA序列分析表明，该序列全长776 bp，与已发表的德国标准株长度相等，但其核苷酸顺序的第557位核苷酸“T”变为“C”，即E6的终止密码子TAA变为谷氨酰胺密码子CAA。结论 中国山东地区宫颈癌患者组织中HPV16E6E7的基因结构与德国标准株HPV16E6E7基因之间存在差异。
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中图号 Q5
Isolating，Cloning，and Sequencing of HPV16E6E7 Gene from a Cervical Carcinoma Biopsy in Shandong Province
Xu Xuemei Si Jingyi Liu Shide Xu Jianqing Liu Zhaoqing，et al
(Department of Biophysics，Institute of Basic Medical Science，CAMS and PUMC，Beijing 100005)
Objective In order to study the structure specificity of HPV16E6E7 gene of a Chinese patient of cervical carcinoma in Shandong province.Methods The tissue DNA were abstracted from cervical carcinoma biopsies and the type of HPV was identified by HPV multiple primers PCR.HPV16E6E7 gene was amplified by PCR from the cervical carcinoma tissue DNA with the infection of HPV16 type only，and then cloned the E6E7 gene into pALTER-I vector.After sequencing the double strand，the gene was compared with the prototype E6E7 gene of HPV16.Results A new recombinant plasmid was constructed and named HPV16E6E7-SD.Sequencing results showed one mutation in HPV16E6E7-SD，the 557th neocleotide in the viral neocleotide sequence “T” was changed into “C”，and caused the termination cordon TAA of E6 gene to convert into a Gln cordon CAA.Conclusions There is a structure difference between HPV16E6E7-SD and the standard strain.
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Key words human papilloma virus; E6E7 gene; cervical carcinoma; sequence
宫颈癌是我国妇女因恶性肿瘤致死的主要原因，人乳头瘤病毒16型(human papilloma virus16，HPV16)是诱发宫颈癌的始动因子，并与人类多种恶性肿瘤的发生相关，HPV16的早期基因E6E7是致癌的关键基因，在恶性肿瘤中持续表达并为恶性表型的维持所必需[1]。HPV16E7基因编码的蛋白是一种特异的肿瘤排斥抗原，HPV16E6E7基因中存在许多抗原表位，可诱导特异的免疫反应[2]。人群感染HPV16后，可产生抗HPV16E6E7的特异性免疫[3]。1985年Seedorf等[4]首先从德国人宫颈癌组织中克隆了HPV16(标准株)，相继的研究发现，许多地区都有HPV16变异株的存在[5～9]。我国学者相继构建的HPV16E6及E7基因克隆多来源于标准株的HPV16质粒[10～12]，仅伍欣星等[12]克隆的HPV16E7-HB株来源于中国湖北地区宫颈癌患者的活检组织。为了解我国宫颈癌患者组织中HPV16E6E7基因结构特点，本实验通过对山东地区宫颈癌活检组织中HPV16E6E7基因的克隆及一级结构序列分析，探讨中国地方株与标准株(德国株)E6E7核苷酸序列差异，为我国HPV16E6E7相关疫苗的研制打下基础。
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1 材料和方法
标本 10例宫颈癌活检组织，由山东医科大学微生物学教研室赵蔚明教授提供，患者均为山东藉，病理学诊断均为宫颈鳞状上皮细胞癌。
引物 位于HPV16E6E7基因的开放读码框架的上、下游，包括起始密码ATG及终止密码TAA，含完整的E6E7基因，全长776 bp，引物的5′端分别加有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点及保护性碱基，加上部分引物序列，扩增片断的长度为795 bp，其核苷酸序列如下：
5′GACGGATCCATGCACCAAAAGAGAACTGCAATG3′
BamHⅠ
5′CTCGGAATTCTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGG3′
EcoRⅠ
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试剂与质粒 ExpandTM Long Template PCR系统购自Boehringer Mannheim公司，dNTP、T4连接酶、pALTER-1载体、核酸限制性内切酶均购自Promega公司，受体菌E.coli DH5α及质粒pGEX-2T、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18均为本室保存。HPV多重引物PCR试剂盒由本室合成提供，HPV6b b/11的共有引物、HPV16引物及HPV18引物3对引物，在同一扩增体系中进行PCR扩增[13]，经1次PCR反应，可同时检测标本中HPV6b、11、16、18等4种型别的HPV，阳性对照以HPV6b、11、16、18的质粒混合物为模板，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见3条带，长度依次为334、145及110 bp，它们分别为HPV18、HPV6b/11及HPV16的特异扩增片段。
PCR 常规提取组织DNA，用HPV多重引物PCR鉴定标本中HPV型别，取1例单纯HPV16阳性的标本为模板，用上述E6E7引物进行HPV16E6E7的PCR扩增。PCR反应体系为50 μl，其中含400 ng的宫颈癌组织DNA，2.5 mmol/L的dNTP，引物各25 pmol，以2 ng的HPV16质粒为阳性对照。94℃预变性8 min后，立即加入0.75 U的高保质酶，95℃变性45 s，54℃退火45 s，68℃延伸60 s，30个循环后再延伸300 s。
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PCR产物的克隆： 酚—氯仿抽提PCR产物，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶解后，加入T4连接酶，经16℃、10 h，定向重组入经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的pALTER-1载体(图1)，转化E.coli DH5a 感受态细胞，筛选阳性克隆后，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定。
图1 pALTER-HPV16E6E7构建示意图
Fig 1 Illustration of construction of plasmid pALTER-HPVE6E7
DNA序列测定： 提取质粒DNA，分别用pALTER-1载体的T7及SP6通用引物，采用双脱氧末端终止法按DNA测序试剂盒(Promega)说明书的程序操作，然后在DNA序列自动分析仪上测序。
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2 结果
宫颈癌组织HPV16E6E7基因扩增结果 HPV多重引物PCR鉴定各例宫颈癌标本中HPV型别，HPV16型单独感染的标本仅于110 bp处见一条扩增带(图2)。以HPV16型阳性标本为模板，PCR扩增HPV16E6E7基因，结果在795 bp处显现清晰的阳性扩增带，与以HPV16标准株质粒DNA扩增带处于同一水平，以pGEX-2TDNA为模板的阴性对照未见扩增带(图3)。
图2 HPV多重引物PCR检测宫颈癌活检组织中HPV感染型别的电泳分析
Fig 2 Electrophoretic analysis of products amplified with HPV multiple primers PCR from a sample of cervical carcinoma tissue
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1.negative control; 2.pBR322DNA/HinfⅠ marker; 3.HPV6b，11,16,18 positive control; 4.DNA sample of cervical carcinoma tissue
图3 宫颈癌活检组织DNA HPV16E6E7 PCR产物分析
Fig 3 Electrophoretic analysis of HPV16E6E7 PCR products
1.DNA sample of cervical carcinoma tissue; 2.HPV16 DNA positive control; 3.pBR322DNA/BstNⅠ marker; 4.negative control
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HPV16E6E7基因的克隆： PCR产物重组入pALTER-1，筛选的阳性克隆经BamHⅠ-EcoRⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后，在约776 bp处可见一条阳性扩增带(图4)。将此质粒命名为pHPV16E6E7-SD。
图4 重组质粒的酶切鉴定
Fig 4 Identification of the recombinant plasmids digested by BamHⅠ and EcoRⅠ
1.recombinant plasmid digested with BamHⅠ and EcoRⅠ; 2.recombinant plasmid; 3.pALTER-IDNA; 4.pBR322DNA/BstNⅠ marker; 5.λDNA/HindⅢ marker
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HPV16E6E7序列测定结果： 将鉴定后的5个重组质粒DNA混合，分别用SP6及T7启动子通用引物进行双向测序，结果表明HPV16E6E7-SD基因全长776 bp，大小与标准株一致，但其病毒核苷酸序列的557位核苷酸“T”变成了“C”，使E6的终止密码子TAA变成了谷氨酰胺密码子CAA(图5，6)。
图5 HPV16E6E7-SD部分核苷酸序列(反意链)
Fig 5 Partial neucleotide sequence of HPV16E6E7-SD with 5′ primer of the E7 C-termina
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图6 山东株HPV16E6E7基因序列
Fig 6 Nucleotide sequence of HPV16E6E7-SD
3 讨论
本研究首先对宫颈癌标本中感染的HPV DNA型别进行鉴定，筛选出单纯感染HPV16型的标本为模板，经PCR扩增E6E7基因，将其重组人pALTER-1载体，测序表明其长度与德国标准株一致，证明所克隆的基因确为HPV16E6E7基因。
HPV16E6E7基因是病毒的主要转化基因，其编码的E6蛋白及E7蛋白均为含“Cys-X-X-Cys”锌指结构的DNA结合蛋白，E6蛋白的N端及C端各形成2个锌指结构，可分别结合、降解抑癌基因p53; E7蛋白的C端也存在2个锌指结构，N端37个氨基酸残基与AdE1A和SV40T抗原蛋白相似，可与抑癌基因蛋白Rb结合，为E7蛋白的转化活性区。本研究克隆的山东株HPV16E6E7基因全长776 bp，与德国标准株核苷酸顺序比较，发现有一处变异，即病毒核苷酸序列557位的“T”变为“C”，使E6的终止密码子TAA变为谷氨酰胺密码子CAA。为排除DNA聚合酶可能造成的各种碱基错配，本实验在采取高保质ExpandTM Long Template PCR系统(错配率为0.025%)扩增的基础上，克隆经鉴定后，参照文献[5]将5个酶切鉴定后的重组质粒等量混合，通过在正反两个方向对目的基因的正链及负链进行测序，最大限度地减少了测序中可能存在的错配模板；且双向测序具有一定的校对功能，变异处G峰(反意链)清晰，单一背景无杂峰，因此消除了由实验造成的核苷酸顺序改变的可能性，表明本研究发现的病毒核苷酸序列第557位的变异由山东株HPV16E6E7基因与标准株病毒基因之间存在差异引起。Fujnaga等[9]通过PCR法测序分析发现，大多数侵袭性宫颈癌及癌前病变都检出了HPV16E7序列变异株。Lcenogle等[5]的研究表明，世界不同地区，如美国乔治亚州、亚拉巴马州、密苏里州及巴拿马地区的宫颈癌组织中都普遍存在HPV16E7变异株。Esche等[8]研究也证实存在HPV16E7变异株，通过进一步与对照组德国患者宫颈癌组织中病毒序列的比较分析，认为坦桑尼亚变异株具有地域特点。另外，宫颈癌组织中HPV16E6基因的多态性亦有报道[7]。国内仅伍欣星等[12]报道了1例湖北地区宫颈癌HPV16E7的变异株，该变异株E7基因的第43位谷氨酰胺密码子CAA变为终止密码子TAA，使E7肽链提前终止。本研究报道我国山东地区HPV16E6E7变异株，为了解我国宫颈癌患者组织中HPV16E6E7基因结构特点积累了流行病学资料。这种差异是否具有地域特性，是否会通过作用HPV16E6E7基因转录后存在多种剪接方式而影响其抗原性及转化活性[14]，相关的研究工作仍在继续进行中。
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许雪梅为通讯作者
参考文献
1 司静懿，李 昆，宋国兴，等.宫颈癌病毒病因癌变原理的研究.中华病理学杂志，1993，22: 373～375
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(1997-12-16收稿), 百拇医药