兔角膜碱烧伤后角膜组织中G-6-PD和胶原酶活性变化
作者：谢德雍 苏建中 罗德生 郑红花 李映红 王汉洲 王梅娟 董加喜
单位： 谢德雍 苏建中 (咸宁医学院附属第二医院眼科，咸宁 437100)；罗德生 郑红花 李映红 王汉洲 王梅娟 董加喜(咸宁医学院生物化学教研室，咸宁 437100)
关键词：角膜碱烧伤；6-磷酸葡萄糖脱氢酶；胶原酶；羟脯氨酸；氧化型谷胱甘肽
咸宁医学院学报990302摘 要 目的：探讨角膜组织中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)和胶原酶活性变化与角膜碱烧伤的关系。方法：用2mol/L NaOH溶液造成右眼角膜碱烧伤模型，以左眼为正常对照。分别于烧伤后不同时期测定两组角膜中的G-6-PD 的活性和氧化型谷胱甘肽(GSSG)及羟脯氨酸的含量。结果：与对照组相比，在烧伤后的1-16天，实验组的G-6-PD活性和羟脯氨酸含量下降，而GSSG含量升高，尤其是第8天的差异非常显著(P<0.01)，至第32天时上述指标基本接近对照组水平。G-6-PD活性与羟脯氨酸含量呈正相关，而与GSSG含量呈负相关。结论：G-6-PD活性降低导致GSSG含量升高继而胶原酶活性增强，可能是角膜碱烧伤的机制之一。
, 百拇医药
中图分类 R779.13
The Changes of G-6-PD and Collagenase Activity in Cornea
Tissue after Corneal Burn by Alkali in Rabbits
XIE Deyong1,SHU Jianzhong1,LUO Desheng2 et al
1 Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xianning Medical College,Xianning 437100
2 Department of Biochemistry,Xianning Medical College,Xianning 437100
, 百拇医药
ABSTRACT ObjectiveTo explore the relation between the corneal alkali burn and the change of Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD)and collagenase.Metheds The model of corneal burn was established with 2mol/L NaOH solution in the right eyes of rabbits while the left eyes as control group,and then measure the G-6-PD activity and the content of hydroxyprolin and oxidized glutathione(GSSG) in cornea tissue at different time after alkali burn.Results From the 1st to 16th days after the burning,the G-6-PD activity and hydroxyprolin content of experimental group decreased but GSSG increased,these indexes was found markedly different than those of control group (P<0.01) especially on the 8th day.On the 32nd day,the above indexes returned to the normal level.There was significant positive correlation between G-6-PD activity and hydroxyprolin content,but negative correlation between G-6-PD activity and GSSG content.Conclusion It is possibly one of the machanism of corneal alkali burn that lowered G-6-PD activity results in increasing of GSSG content and following activation of collagen-ase.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Corneal alkali burn;Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-PD);collagenase;hydroxyprolin;oxidized glutathione(GSSG)
眼角膜碱烧伤是较严重的化学损伤，探讨其损伤机制，对寻找有效治疗措施或药物，预防严重后遗症具有重要指导意义。笔者前文[1]报导了碱烧伤后角膜组织SOD活性降低，NO水平和MDA含量增高等自由基代谢紊乱所引发的脂质过氧化反应增强可能是其损伤机制之一。本文进一步探讨G-6-PD和胶原酶在角膜化学损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1动物模型
按文献[1]操作，将眼部检查无异常的健康白兔30只，经麻醉后，用2mol/LNaOH溶液浸泡的滤纸贴敷于右眼角膜上1分钟，再用灭菌生理盐水冲洗2分钟，左眼为正常对照。
, 百拇医药
1.2 GSSG、羟脯氨酸含量及G-6-PD活性测定
分别于碱烧伤后的第1、4、8、16、32、64天，随机取5只兔的实验眼和对照眼全层角膜组织，用pH8.0的Tris-HCl-EDTA缓冲液在冰浴下用DY-1型电动玻璃匀浆器制成5%匀浆，再用JY92-Ⅱ型超粉碎机破碎细胞。用Lowry法测定组织蛋白质含量。用连续监测法[2]测定G-6-PD活性，。按文献[3]方法测定GSSG含量。余下的角膜组织烘干、称重，采用文献[4]方法测定羟脯氨酸含量。
1.3 统计学处理
实验组与对照组间的G-6-PD 活性及GSSG、羟脯氨酸含量变化采用两样本均数的t检验。对实验组G-6-PD 活性与GSSG及羟脯氨酸含量和GSSG含量与羟脯氨酸含量的相关性，采用直线相关分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1G-6-P 活性的变化
烧伤后的1-16天，实验组角膜组织中的G-6-PD活性降低，与对照组同期相比，第4-16天(尤其是第8天)差异非常显著，至第32天酶活性已恢复至对照组水平(见表1).
表1 角膜碱烧后G-6-PD活性的变化
(
±s)(单位:U/g.pro) 天数
只数
实 验 组
对 照 组
1
, http://www.100md.com
5
2.856±0.157
3.087±0.154
4
5
2.807±0.115
3.062±0.125
8
5
2.665±0.122*
3.078±0.139
16
, http://www.100md.com
5
2.819±0.108△
3.062±0.129
32
5
3.018±0.169*
3.061±0.153
64
5
3.050±0.106
3.035±0.128
与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
, http://www.100md.com
2.2 GSSG含量的变化
烧伤后的，实验组角膜组织中的GSSG含量升高，但与对照组同期相比，第1天及第32天的变化无统计学意义，第8天达高峰，差异非常显著(P<0.01)，第64天，其含量接近对照组水平(见表2)。
2.3 羟脯氨酸含量的变化
烧伤后实验组羟脯氨酸含量降低，其变化规律同G-6-PD，与对照组同期相比，第4-16天的差异显著，尤其是第8天降低最显著，第32天时恢复至对照组水平(见表3)。表2 角膜碱烧后GSSG含量的变化
(±s)(单位:ug/g湿重) 天数
只数
, 百拇医药 实 验 组
对 照 组
1
5
23.115±1.850
22.314±1.739
4
5
25.923±2.290*
22.805±1.062
8
5
, 百拇医药 26.596±1.516△
22.260±1.571
16
5
25.481±1.768*
22.319±1.347
32
5
24.856±1.850
22.461±1.517
64
5
, 百拇医药
22.780±1.631
22.507±1.780
与对照组比较，*<0.05，△P<0.001
表3 角膜碱烧后羟脯氨酸含量的变化
(±s)(单位:μg/mg..pro) 天数
只数
实 验 组
对 照 组
1
5
, 百拇医药
36.205±1.009
36.488±0.987
4
5
33.613±1.426*
36.361±1.611
8
5
33.252±0.923△
36.499±1.065
16
5
, 百拇医药
33.867±1.446*
36.443±0.974
32
5
37.243±1.452
36.398±1.420
64
5
36.669±1.554
36.485±0.848
与对照组比较，*P<0.05，△<0.01
, http://www.100md.com
从实验组角膜组织中不同时期的G-6-PD活性与GSSG及羟脯氨酸含量分析发现，G-6-PD活性与GSSG含量呈负相关(r=-0.733)，与羟脯氨酸含量呈高度正相关(r=0.888)；GSSG含量与羟脯氨酸含量呈负相关(r=-0.795)。3 讨 论
角膜组织富含胶原，约占角膜蛋白质组成的90%[4]，角膜碱烧伤是一种以胶原明显降解为其特征的损伤。在生理条件下，角膜组织的胶原不易被其它蛋白酶降解，而胶原酶又是以潜酶[5](latent collagenase)或酶-抑制物的复合形式(胶原酶前体)存在而无活性，只有在一定条件下被激活(活化)才能催化胶原降解。可见，胶原酶在角膜碱烧伤中的作用十分重要。研究发现，碱烧伤后角膜组织出现大量的多形核白细胞(PMNs)浸润。一方面，PMNs在吞噬过程中和被可溶性物质激活时产生氧自由基而引发脂质过氧化作用增强，使角膜造成损伤[1]；另一方面，PMNs还大量释放蛋白水解酶，包括胶原酶潜酶，后者可被OH或H2O2及其衍生的其它活性氧氧化而激活[5]。本实验发现，当兔角膜碱烧伤后，角膜组织的G-6-PD活性降低的同时，伴有GSSG 含量增加，两者有明显的负相关。同时，由于GSSG含量增加，激活了角膜上皮的胶原酶。羟脯氨酸含量与GSSG含量也存在着明显的负相关，而与G-6-PD活性存在着明显的正相关，结果提示，角膜碱烧伤时，角膜组织中的G-6-PD活性降低，导致GSSG含量增多而激活胶原酶活性，也可能是造成角膜损伤的机制之一。
, 百拇医药
参考文献
1 谢德雍，苏建中，罗德生，等.兔角膜碱烧伤后角膜组织中的NO、MDA含量及SOD活性的变化.咸宁医学院学报，1996；2：77
2 朱忠勇主编.实用医学检验学.北京：人民军医出版社，1997：366
3 沈惠麒，赵利英，曲青云，等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988；2：103
4 黄一飞，宋琛，李玉奎.家兔角膜碱烧伤后胶原含量变化及实验性治疗的影响.眼科研究，1989；3：135
5 Burkhardt H,Hartmann F,Schwingel ML.Activation of latent collagenase from polymorphonuclear leukocytes by oxygen radicals.Enzyme，1986；36：221
(1999-07-29收稿), 百拇医药
单位： 谢德雍 苏建中 (咸宁医学院附属第二医院眼科，咸宁 437100)；罗德生 郑红花 李映红 王汉洲 王梅娟 董加喜(咸宁医学院生物化学教研室，咸宁 437100)
关键词：角膜碱烧伤；6-磷酸葡萄糖脱氢酶；胶原酶；羟脯氨酸；氧化型谷胱甘肽
咸宁医学院学报990302摘 要 目的：探讨角膜组织中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)和胶原酶活性变化与角膜碱烧伤的关系。方法：用2mol/L NaOH溶液造成右眼角膜碱烧伤模型，以左眼为正常对照。分别于烧伤后不同时期测定两组角膜中的G-6-PD 的活性和氧化型谷胱甘肽(GSSG)及羟脯氨酸的含量。结果：与对照组相比，在烧伤后的1-16天，实验组的G-6-PD活性和羟脯氨酸含量下降，而GSSG含量升高，尤其是第8天的差异非常显著(P<0.01)，至第32天时上述指标基本接近对照组水平。G-6-PD活性与羟脯氨酸含量呈正相关，而与GSSG含量呈负相关。结论：G-6-PD活性降低导致GSSG含量升高继而胶原酶活性增强，可能是角膜碱烧伤的机制之一。
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中图分类 R779.13
The Changes of G-6-PD and Collagenase Activity in Cornea
Tissue after Corneal Burn by Alkali in Rabbits
XIE Deyong1,SHU Jianzhong1,LUO Desheng2 et al
1 Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xianning Medical College,Xianning 437100
2 Department of Biochemistry,Xianning Medical College,Xianning 437100
, 百拇医药
ABSTRACT ObjectiveTo explore the relation between the corneal alkali burn and the change of Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD)and collagenase.Metheds The model of corneal burn was established with 2mol/L NaOH solution in the right eyes of rabbits while the left eyes as control group,and then measure the G-6-PD activity and the content of hydroxyprolin and oxidized glutathione(GSSG) in cornea tissue at different time after alkali burn.Results From the 1st to 16th days after the burning,the G-6-PD activity and hydroxyprolin content of experimental group decreased but GSSG increased,these indexes was found markedly different than those of control group (P<0.01) especially on the 8th day.On the 32nd day,the above indexes returned to the normal level.There was significant positive correlation between G-6-PD activity and hydroxyprolin content,but negative correlation between G-6-PD activity and GSSG content.Conclusion It is possibly one of the machanism of corneal alkali burn that lowered G-6-PD activity results in increasing of GSSG content and following activation of collagen-ase.
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KEY WORDS Corneal alkali burn;Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-PD);collagenase;hydroxyprolin;oxidized glutathione(GSSG)
眼角膜碱烧伤是较严重的化学损伤，探讨其损伤机制，对寻找有效治疗措施或药物，预防严重后遗症具有重要指导意义。笔者前文[1]报导了碱烧伤后角膜组织SOD活性降低，NO水平和MDA含量增高等自由基代谢紊乱所引发的脂质过氧化反应增强可能是其损伤机制之一。本文进一步探讨G-6-PD和胶原酶在角膜化学损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1动物模型
按文献[1]操作，将眼部检查无异常的健康白兔30只，经麻醉后，用2mol/LNaOH溶液浸泡的滤纸贴敷于右眼角膜上1分钟，再用灭菌生理盐水冲洗2分钟，左眼为正常对照。
, 百拇医药
1.2 GSSG、羟脯氨酸含量及G-6-PD活性测定
分别于碱烧伤后的第1、4、8、16、32、64天，随机取5只兔的实验眼和对照眼全层角膜组织，用pH8.0的Tris-HCl-EDTA缓冲液在冰浴下用DY-1型电动玻璃匀浆器制成5%匀浆，再用JY92-Ⅱ型超粉碎机破碎细胞。用Lowry法测定组织蛋白质含量。用连续监测法[2]测定G-6-PD活性，。按文献[3]方法测定GSSG含量。余下的角膜组织烘干、称重，采用文献[4]方法测定羟脯氨酸含量。
1.3 统计学处理
实验组与对照组间的G-6-PD 活性及GSSG、羟脯氨酸含量变化采用两样本均数的t检验。对实验组G-6-PD 活性与GSSG及羟脯氨酸含量和GSSG含量与羟脯氨酸含量的相关性，采用直线相关分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1G-6-P 活性的变化
烧伤后的1-16天，实验组角膜组织中的G-6-PD活性降低，与对照组同期相比，第4-16天(尤其是第8天)差异非常显著，至第32天酶活性已恢复至对照组水平(见表1).
表1 角膜碱烧后G-6-PD活性的变化
(
±s)(单位:U/g.pro) 天数只数
实 验 组
对 照 组
1
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5
2.856±0.157
3.087±0.154
4
5
2.807±0.115
3.062±0.125
8
5
2.665±0.122*
3.078±0.139
16
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5
2.819±0.108△
3.062±0.129
32
5
3.018±0.169*
3.061±0.153
64
5
3.050±0.106
3.035±0.128
与对照组相比*P<0.05，△P<0.01
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2.2 GSSG含量的变化
烧伤后的，实验组角膜组织中的GSSG含量升高，但与对照组同期相比，第1天及第32天的变化无统计学意义，第8天达高峰，差异非常显著(P<0.01)，第64天，其含量接近对照组水平(见表2)。
2.3 羟脯氨酸含量的变化
烧伤后实验组羟脯氨酸含量降低，其变化规律同G-6-PD，与对照组同期相比，第4-16天的差异显著，尤其是第8天降低最显著，第32天时恢复至对照组水平(见表3)。表2 角膜碱烧后GSSG含量的变化
(
±s)(单位:ug/g湿重) 天数只数
, 百拇医药 实 验 组
对 照 组
1
5
23.115±1.850
22.314±1.739
4
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25.923±2.290*
22.805±1.062
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, 百拇医药 26.596±1.516△
22.260±1.571
16
5
25.481±1.768*
22.319±1.347
32
5
24.856±1.850
22.461±1.517
64
5
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22.780±1.631
22.507±1.780
与对照组比较，*<0.05，△P<0.001
表3 角膜碱烧后羟脯氨酸含量的变化
(
±s)(单位:μg/mg..pro) 天数只数
实 验 组
对 照 组
1
5
, 百拇医药
36.205±1.009
36.488±0.987
4
5
33.613±1.426*
36.361±1.611
8
5
33.252±0.923△
36.499±1.065
16
5
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33.867±1.446*
36.443±0.974
32
5
37.243±1.452
36.398±1.420
64
5
36.669±1.554
36.485±0.848
与对照组比较，*P<0.05，△<0.01
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从实验组角膜组织中不同时期的G-6-PD活性与GSSG及羟脯氨酸含量分析发现，G-6-PD活性与GSSG含量呈负相关(r=-0.733)，与羟脯氨酸含量呈高度正相关(r=0.888)；GSSG含量与羟脯氨酸含量呈负相关(r=-0.795)。3 讨 论
角膜组织富含胶原，约占角膜蛋白质组成的90%[4]，角膜碱烧伤是一种以胶原明显降解为其特征的损伤。在生理条件下，角膜组织的胶原不易被其它蛋白酶降解，而胶原酶又是以潜酶[5](latent collagenase)或酶-抑制物的复合形式(胶原酶前体)存在而无活性，只有在一定条件下被激活(活化)才能催化胶原降解。可见，胶原酶在角膜碱烧伤中的作用十分重要。研究发现，碱烧伤后角膜组织出现大量的多形核白细胞(PMNs)浸润。一方面，PMNs在吞噬过程中和被可溶性物质激活时产生氧自由基而引发脂质过氧化作用增强，使角膜造成损伤[1]；另一方面，PMNs还大量释放蛋白水解酶，包括胶原酶潜酶，后者可被OH或H2O2及其衍生的其它活性氧氧化而激活[5]。本实验发现，当兔角膜碱烧伤后，角膜组织的G-6-PD活性降低的同时，伴有GSSG 含量增加，两者有明显的负相关。同时，由于GSSG含量增加，激活了角膜上皮的胶原酶。羟脯氨酸含量与GSSG含量也存在着明显的负相关，而与G-6-PD活性存在着明显的正相关，结果提示，角膜碱烧伤时，角膜组织中的G-6-PD活性降低，导致GSSG含量增多而激活胶原酶活性，也可能是造成角膜损伤的机制之一。
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参考文献
1 谢德雍，苏建中，罗德生，等.兔角膜碱烧伤后角膜组织中的NO、MDA含量及SOD活性的变化.咸宁医学院学报，1996；2：77
2 朱忠勇主编.实用医学检验学.北京：人民军医出版社，1997：366
3 沈惠麒，赵利英，曲青云，等.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988；2：103
4 黄一飞，宋琛，李玉奎.家兔角膜碱烧伤后胶原含量变化及实验性治疗的影响.眼科研究，1989；3：135
5 Burkhardt H,Hartmann F,Schwingel ML.Activation of latent collagenase from polymorphonuclear leukocytes by oxygen radicals.Enzyme，1986；36：221
(1999-07-29收稿), 百拇医药