奥替普拉在阻断细胞恶性转化时对某些基因表达的影响
作者：柏 华 罗贤懋 胡国刚 魏慧娟 李中骞
单位：柏 华， 罗贤懋， 胡国刚， 魏慧娟， 李中骞(中国协和医科大学、中国医学科学院肿瘤研究所，北京 100021
关键词：奥替普拉；谷胱甘肽-S-转移酶-π；ras基因
药学学报990318 EFFECT OF SOME GENES EXPRESSION IN INHIBITION OF
CELLUAR MALIGNANT TRANSFORMATION BY OLTIPRAZ
Bai Hua(Bai H), Luo Xianmao(Luo XM), Hu Guogang(Hu GG), Wei Huijuan(Wei HJ) and Li Zhongqian(Li ZQ)
, 百拇医药
(Cancer Institute and Clinic Cancer College, Chinese Academy of Medical Science
and Peking Union Medical College, Beijing 100021)
ABSTRACT AIM: To investigate the effect of some gene expression in inhibition of celluar malignant transformation by oltipraz. METHODS: Human fetal lung (HFL) treated with cigarette smoking condensate (CSC) and / or oltipraz was extracted for DNA and transfected into Rat-1 cell. C-Ha-ras gene mutation of Rat-1 and transformated Rat-1 cell were analyzed by PCR-RFLP. GST activity and GST-π were examined by colorimetric determination and ELISA. RESULTS: Oltipraz can decrease GST activity and GST-π protein content along with its inhibition of HFL carcinogenesis, but no obvious effect on mP53 gene expression. CONCLUSION: The effects of GST-π and C-Ha-ras gene may be involved in inhibition of cellular malignant transformation by oltipraz.
, 百拇医药
KEY WORDS oltipraz; GST-π; ras gene
奥替普拉(oltipraz)来源于十字花科(Cruciferase)蔬菜，全称5-(2-吡嗪基)-4-甲1,2-2羟基-3-硫酮，文献报道它为一种防癌抑癌剂[1]。我们用致癌素香烟凝聚物(cigarette smoking condensate CSC)诱发人胚肺组织恶性转化，提取DNA转染Rat-1细胞，在诱使Rat-1细胞恶性转化时加入奥替普拉，观察恶性转化情况，并比较分析了C-Ha-ras基因突变和谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)基因表达情况。
材料与方法
药品 奥替普拉由美国NIH的Bourat博士赠送，CSC(由医科院肿瘤所李玉华博士提供)20 μg.μl-1；C-Ha-ras引物：①CAGGCCCCCTGAGCGATG，②TCCAGGATGCCAGGCAC；抗鼠mP53单抗购自北京中山生物技术公司。
, http://www.100md.com
组织培养及诱癌处理 培养的人胚肺组织分为6组：(1) DMSO对照组；(2) 用oltipraz处理；(3) 先用oltipraz处理,24 h后再用CSC处理(oltipraz→CSC)；(4) oltipraz与CSC同时处理(oltipraz/CSC)；(5) 先用CSC处理，24 h后再用oltipraz处理(CSC→oltipraz)；(6) CSC处理。CSC浓度100 μg.ml-1，oltipraz浓度150 μg.ml-1，均作用24 h；Rat-1细胞的转化实验参见文献[2]。
PCR-RFLP PCR反应液组成为三蒸水24 μl,10×buffer 5.0 μl,1 mmol.L-1 dNTP 12.5 μl,Ha-ras-1 primer 4.25 μg,Ha-ras-2 primer 4.25 μg,DNA sample 0.5 μg,反应流程为70℃ 1.5 min,93℃ 30 s,50℃ 1 min，循环32次，琼脂糖电泳检查扩增产物，C-Ha-ras基因第12位密码子的点突变用Msp I酶切鉴定。
, 百拇医药
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性测定 取0.2 mol.L-1磷酸缓冲液(PB) 2 ml加入玻管中，30℃水浴，加底物20 mmmol.L-1，1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB) 500 μl;20 mmmol.L-1 GSH 50 μl,样品100 μl,混匀后测1 min时A340值；GST-π测定(ELISA法)，使用小鼠单抗MAb III,BSA包被，依次加样品或抗原标准，加多抗，再加驴抗兔IgG-碱性磷酸酶，加磷酸硝基酚(PNPP)，最后加3 mol.L-1 NaOH终止反应。用酶联免疫仪测A410值。计算各样品GST-π含量(ng.ml-1)，以蛋白含量为基准换算成GST-π实际含量(ng/mgprotein)。
细胞mP53的免疫组化 参照文献[3]进行。
, 百拇医药
实验结果
1 从生长曲线分析奥替普拉对细胞恶性转化的抑制作用
上述6组培养的人胚肺组织提取DNA转染Rat-1细胞，结果仅在CSC组、CSC→oltipraz两组获得恶性转化细胞，3组细胞在同样条件下培养，作生长曲线(图1)观察比较，可见转化细胞生长较快。
Fig 1 Growth curves of Rat-1 and transformed Rat-1 cells. △ — △ T-Rat-1 cell (CSC group), ○ — ○ T-Rat-1 cell (CSC→oltipraz group), ● — ● Rat-1 cell (control); 3×104 basic cell were cultured in 24 hole dish and the grown cells were counted after 1 to 6 days (n=2).
, http://www.100md.com
2 奥替普拉在阻断CSC致Rat-1细胞恶性转化中对C-Ha-ras基因的影响
PCR扩增：对两组转化细胞分别提取DNA备用，然后设计两对C-ha-ras基因引物用PCR扩增，仅在CSC组能扩增出一条278 bp的电泳带。Rat-1细胞和其它细胞的DNA PCR扩增C-Ha-ras基因均为阴性。RFLP：对上述能扩增特异条带的PCR产物用MspI酶切，并设阳性与阴性对照，发现此扩增条带不能被切开，而阴性对照能被切开，说明有12位密码子的点突变。
3 奥替普拉对各组恶性转化细胞GST-π和GSTs的影响
由表1可见CSC处理后获得的转化Rat-1细胞(T-Rat-1)，GSTs活性和GST-π含量均升高；而奥替普拉与CSC相互作用后处理的Rat-1细胞，GSTs和GST-π均较低，差别显著。
Tab 1 GSTs activity and GST-π content of Rat-1, T-Rat-1 cells Group
, http://www.100md.com
GSTs activity
/nmol.L-1.min-1.mg-1
GST-π content
/ng.mg-1 protein
Control (Rat-1)
35.6±9.3
49.5±10.7
CSC/oltipraz (Rat-1)
36.7±8.9Δ
, 百拇医药
51.4±9.6Δ
CSC (T-Rat-1)
65.4±18.1*
101.4±25.6*
n=3, (
±s). *P<0.05 vs control; ΔP<0.05 vs CSC groups. Cells were culturrd in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM); Actual concentration of CSC was 100 μg.ml-1； Actual concentration of oltipraz was 150 μg.ml-1.4 奥替普拉对恶性细胞P53表达的影响
, 百拇医药
用细胞免疫化学方法分别对Rat-1 cell和恶性转化Rat-1 cell进行mP53表达分析，未发现明显差别。
讨论
奥替普拉阻断CSC诱发人肺早期癌变不是一个单纯的过程，在组织病理变化的深层，涉及某些基因表达的变化。GST-π被认为可能是启动癌变最早和最精确的肿瘤标志之一。本实验室曾证实[4]由CSC，DEN等致癌剂处理人胚肺提取DNA转染获得的转化Rat-1细胞，GSTs活性,GST-π均明显高于对照组；Northern Blot检测显示转化细胞GST-π mRNA表达也较对照细胞高。本次研究发现加用奥替普拉作用后，GST-π活性有所降低，差别有显著性(P<0.05)，说明奥替普拉在一定条件下影响CSC的致癌作用。作为解毒酶的GST-π，致癌剂作用后可以拮抗性、应激性升高，持续时间短；而抗癌剂作用后也可以协同性、贮备性升高，持续时间较长，这与致癌剂使用的剂量及时间选择性密切相关[5]。
, http://www.100md.com
P53基因突变见于80%以上的小细胞肺癌和60%的非小细胞肺癌，本实验的转化Rat-1细胞与正常Rat-1细胞之间，未发现P53表达的差异，但人胚肺组织病理切片发现有奥替普拉作用者突变型P53(mP53)表达降低了，两者差别有显著性(资料待发表)，说明用奥替普拉阻断CSC所致人肺早期癌变中，抑制mP53基因的高表达在一定条件下才会发生。
ras基因突变学说是解释人肺癌变早期分子机制的经典学说[2]。c-Ha-ras癌基因的第12位密码子前两个核苷酸和第11位密码子的后两个核苷酸(CCGG)正好是限制性内切酶Msp I的酶切位点。我们用奥替普拉进行的阻断试验；一部分并未完全阻断但获得了恶性转化细胞，而这一组恶性细胞c-Ha-ras检测也为阳性，这为奥替普拉阻断人肺早期癌变的时间依赖性和由量变到质变提供了另一佐证。但对已出现癌前病变的人胚肺组织，并进入癌变促进阶段，未检测到c-Ha-ras基因突变，这并非说明ras基因仅在癌变启动中发挥作用，而是因为ras基因突变在癌变早期发生率低。还不能断言奥替普拉对CSC致癌作用的阻断是由于修复或逆转了ras基因的突变，可能是影响了ras基因的表达，或者在蛋白水平或者在mRNA水平，或者是oltipraz中和了CSC的致癌性与毒性。
, 百拇医药
现址：首都医科大学宣武医院，北京 100053
Tel:(010)63013355-2833,E-mail:cpbhcpbh@public.bat.net.cn)
参考文献
1 Wattenberg LW, Bueding E. Inhibitory effects of 5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione (oltipraz) on carcinogenesis by benzo (a) pyrene, diethylnitrosamine and uracil mustard. Carcinogenesis, 1986,7∶1379
2 Schutte J, minna JD, Birrer M, et al. Deregulated expression of human c-jun transforms primary rat embryo cells in cooperation with an activated c-Ha-ras gene and transforms Rat-1 cells as a single gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶2257
, 百拇医药
3 Bodner SM, Minna JD, Jensen SM, et al. Expression of mutant P53 protein in lung cancer correlates with the class of p53 gene mutation. Oncogene, 1992,7∶743
4 Li ZQ, Luo XM, Wei HJ, et al. Inhibition of the transforming ability of cigarette smoking condensate-treated human fetal lung DNA induced by oltipraz. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 1994,13∶133
5 柏华,罗贤懋,胡国刚,等.Oltipraz对细胞恶性转化作用的研究.中国实验动物学报,1997,5∶41
收稿日期: 1998-03-12, 百拇医药
单位：柏 华， 罗贤懋， 胡国刚， 魏慧娟， 李中骞(中国协和医科大学、中国医学科学院肿瘤研究所，北京 100021
关键词：奥替普拉；谷胱甘肽-S-转移酶-π；ras基因
药学学报990318 EFFECT OF SOME GENES EXPRESSION IN INHIBITION OF
CELLUAR MALIGNANT TRANSFORMATION BY OLTIPRAZ
Bai Hua(Bai H), Luo Xianmao(Luo XM), Hu Guogang(Hu GG), Wei Huijuan(Wei HJ) and Li Zhongqian(Li ZQ)
, 百拇医药
(Cancer Institute and Clinic Cancer College, Chinese Academy of Medical Science
and Peking Union Medical College, Beijing 100021)
ABSTRACT AIM: To investigate the effect of some gene expression in inhibition of celluar malignant transformation by oltipraz. METHODS: Human fetal lung (HFL) treated with cigarette smoking condensate (CSC) and / or oltipraz was extracted for DNA and transfected into Rat-1 cell. C-Ha-ras gene mutation of Rat-1 and transformated Rat-1 cell were analyzed by PCR-RFLP. GST activity and GST-π were examined by colorimetric determination and ELISA. RESULTS: Oltipraz can decrease GST activity and GST-π protein content along with its inhibition of HFL carcinogenesis, but no obvious effect on mP53 gene expression. CONCLUSION: The effects of GST-π and C-Ha-ras gene may be involved in inhibition of cellular malignant transformation by oltipraz.
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KEY WORDS oltipraz; GST-π; ras gene
奥替普拉(oltipraz)来源于十字花科(Cruciferase)蔬菜，全称5-(2-吡嗪基)-4-甲1,2-2羟基-3-硫酮，文献报道它为一种防癌抑癌剂[1]。我们用致癌素香烟凝聚物(cigarette smoking condensate CSC)诱发人胚肺组织恶性转化，提取DNA转染Rat-1细胞，在诱使Rat-1细胞恶性转化时加入奥替普拉，观察恶性转化情况，并比较分析了C-Ha-ras基因突变和谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)基因表达情况。
材料与方法
药品 奥替普拉由美国NIH的Bourat博士赠送，CSC(由医科院肿瘤所李玉华博士提供)20 μg.μl-1；C-Ha-ras引物：①CAGGCCCCCTGAGCGATG，②TCCAGGATGCCAGGCAC；抗鼠mP53单抗购自北京中山生物技术公司。
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组织培养及诱癌处理 培养的人胚肺组织分为6组：(1) DMSO对照组；(2) 用oltipraz处理；(3) 先用oltipraz处理,24 h后再用CSC处理(oltipraz→CSC)；(4) oltipraz与CSC同时处理(oltipraz/CSC)；(5) 先用CSC处理，24 h后再用oltipraz处理(CSC→oltipraz)；(6) CSC处理。CSC浓度100 μg.ml-1，oltipraz浓度150 μg.ml-1，均作用24 h；Rat-1细胞的转化实验参见文献[2]。
PCR-RFLP PCR反应液组成为三蒸水24 μl,10×buffer 5.0 μl,1 mmol.L-1 dNTP 12.5 μl,Ha-ras-1 primer 4.25 μg,Ha-ras-2 primer 4.25 μg,DNA sample 0.5 μg,反应流程为70℃ 1.5 min,93℃ 30 s,50℃ 1 min，循环32次，琼脂糖电泳检查扩增产物，C-Ha-ras基因第12位密码子的点突变用Msp I酶切鉴定。
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谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性测定 取0.2 mol.L-1磷酸缓冲液(PB) 2 ml加入玻管中，30℃水浴，加底物20 mmmol.L-1，1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB) 500 μl;20 mmmol.L-1 GSH 50 μl,样品100 μl,混匀后测1 min时A340值；GST-π测定(ELISA法)，使用小鼠单抗MAb III,BSA包被，依次加样品或抗原标准，加多抗，再加驴抗兔IgG-碱性磷酸酶，加磷酸硝基酚(PNPP)，最后加3 mol.L-1 NaOH终止反应。用酶联免疫仪测A410值。计算各样品GST-π含量(ng.ml-1)，以蛋白含量为基准换算成GST-π实际含量(ng/mgprotein)。
细胞mP53的免疫组化 参照文献[3]进行。
, 百拇医药
实验结果
1 从生长曲线分析奥替普拉对细胞恶性转化的抑制作用
上述6组培养的人胚肺组织提取DNA转染Rat-1细胞，结果仅在CSC组、CSC→oltipraz两组获得恶性转化细胞，3组细胞在同样条件下培养，作生长曲线(图1)观察比较，可见转化细胞生长较快。
Fig 1 Growth curves of Rat-1 and transformed Rat-1 cells. △ — △ T-Rat-1 cell (CSC group), ○ — ○ T-Rat-1 cell (CSC→oltipraz group), ● — ● Rat-1 cell (control); 3×104 basic cell were cultured in 24 hole dish and the grown cells were counted after 1 to 6 days (n=2).
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2 奥替普拉在阻断CSC致Rat-1细胞恶性转化中对C-Ha-ras基因的影响
PCR扩增：对两组转化细胞分别提取DNA备用，然后设计两对C-ha-ras基因引物用PCR扩增，仅在CSC组能扩增出一条278 bp的电泳带。Rat-1细胞和其它细胞的DNA PCR扩增C-Ha-ras基因均为阴性。RFLP：对上述能扩增特异条带的PCR产物用MspI酶切，并设阳性与阴性对照，发现此扩增条带不能被切开，而阴性对照能被切开，说明有12位密码子的点突变。
3 奥替普拉对各组恶性转化细胞GST-π和GSTs的影响
由表1可见CSC处理后获得的转化Rat-1细胞(T-Rat-1)，GSTs活性和GST-π含量均升高；而奥替普拉与CSC相互作用后处理的Rat-1细胞，GSTs和GST-π均较低，差别显著。
Tab 1 GSTs activity and GST-π content of Rat-1, T-Rat-1 cells Group
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GSTs activity
/nmol.L-1.min-1.mg-1
GST-π content
/ng.mg-1 protein
Control (Rat-1)
35.6±9.3
49.5±10.7
CSC/oltipraz (Rat-1)
36.7±8.9Δ
, 百拇医药
51.4±9.6Δ
CSC (T-Rat-1)
65.4±18.1*
101.4±25.6*
n=3, (
±s). *P<0.05 vs control; ΔP<0.05 vs CSC groups. Cells were culturrd in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM); Actual concentration of CSC was 100 μg.ml-1； Actual concentration of oltipraz was 150 μg.ml-1.4 奥替普拉对恶性细胞P53表达的影响, 百拇医药
用细胞免疫化学方法分别对Rat-1 cell和恶性转化Rat-1 cell进行mP53表达分析，未发现明显差别。
讨论
奥替普拉阻断CSC诱发人肺早期癌变不是一个单纯的过程，在组织病理变化的深层，涉及某些基因表达的变化。GST-π被认为可能是启动癌变最早和最精确的肿瘤标志之一。本实验室曾证实[4]由CSC，DEN等致癌剂处理人胚肺提取DNA转染获得的转化Rat-1细胞，GSTs活性,GST-π均明显高于对照组；Northern Blot检测显示转化细胞GST-π mRNA表达也较对照细胞高。本次研究发现加用奥替普拉作用后，GST-π活性有所降低，差别有显著性(P<0.05)，说明奥替普拉在一定条件下影响CSC的致癌作用。作为解毒酶的GST-π，致癌剂作用后可以拮抗性、应激性升高，持续时间短；而抗癌剂作用后也可以协同性、贮备性升高，持续时间较长，这与致癌剂使用的剂量及时间选择性密切相关[5]。
, http://www.100md.com
P53基因突变见于80%以上的小细胞肺癌和60%的非小细胞肺癌，本实验的转化Rat-1细胞与正常Rat-1细胞之间，未发现P53表达的差异，但人胚肺组织病理切片发现有奥替普拉作用者突变型P53(mP53)表达降低了，两者差别有显著性(资料待发表)，说明用奥替普拉阻断CSC所致人肺早期癌变中，抑制mP53基因的高表达在一定条件下才会发生。
ras基因突变学说是解释人肺癌变早期分子机制的经典学说[2]。c-Ha-ras癌基因的第12位密码子前两个核苷酸和第11位密码子的后两个核苷酸(CCGG)正好是限制性内切酶Msp I的酶切位点。我们用奥替普拉进行的阻断试验；一部分并未完全阻断但获得了恶性转化细胞，而这一组恶性细胞c-Ha-ras检测也为阳性，这为奥替普拉阻断人肺早期癌变的时间依赖性和由量变到质变提供了另一佐证。但对已出现癌前病变的人胚肺组织，并进入癌变促进阶段，未检测到c-Ha-ras基因突变，这并非说明ras基因仅在癌变启动中发挥作用，而是因为ras基因突变在癌变早期发生率低。还不能断言奥替普拉对CSC致癌作用的阻断是由于修复或逆转了ras基因的突变，可能是影响了ras基因的表达，或者在蛋白水平或者在mRNA水平，或者是oltipraz中和了CSC的致癌性与毒性。
, 百拇医药
现址：首都医科大学宣武医院，北京 100053
Tel:(010)63013355-2833,E-mail:cpbhcpbh@public.bat.net.cn)
参考文献
1 Wattenberg LW, Bueding E. Inhibitory effects of 5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione (oltipraz) on carcinogenesis by benzo (a) pyrene, diethylnitrosamine and uracil mustard. Carcinogenesis, 1986,7∶1379
2 Schutte J, minna JD, Birrer M, et al. Deregulated expression of human c-jun transforms primary rat embryo cells in cooperation with an activated c-Ha-ras gene and transforms Rat-1 cells as a single gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶2257
, 百拇医药
3 Bodner SM, Minna JD, Jensen SM, et al. Expression of mutant P53 protein in lung cancer correlates with the class of p53 gene mutation. Oncogene, 1992,7∶743
4 Li ZQ, Luo XM, Wei HJ, et al. Inhibition of the transforming ability of cigarette smoking condensate-treated human fetal lung DNA induced by oltipraz. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 1994,13∶133
5 柏华,罗贤懋,胡国刚,等.Oltipraz对细胞恶性转化作用的研究.中国实验动物学报,1997,5∶41
收稿日期: 1998-03-12, 百拇医药